酶的应用
绪论
酶”对于大多数人来说，还是比较陌生的，还不知酶为何物，要么不知所云，要么误认为“煤”等等名词。然而，随着生物技术的飞速发展，酶迅速的深入应用于人们息息相关的各工业部门及日常生活中来。当你幸福的享受生活的时候，您可能已经在使用许多用酶制剂生产出来的产品，比如：爽口的果汁、香甜面包、清洁能力出众的洗衣粉、舒适的服装，以及昨天刚在超市买的调味品、化妆品、减肥品，今天朋友聚会喝的白酒、红酒、啤酒等等等等。
酶是自然的产物，是生物为了生存而适应自然的产物。自古以来，酶就被应用于日常生活，远在人类游牧时代，人民已经利用动物胃液来凝固牛奶，制造奶酪。尤其在我国远古时代，四千年前，已经掌握了酿酒技术，秦汉以前，已经利用麦芽制取饴糖，古人还用粪便供兽皮脱毛、制造皮革，用动物胰脏软化皮革等等，都是酶的作用。酶的作用还被用于治病；两千五百年年前人民已懂得酒曲可治肠胃病，古代还用鸡内金（鸡胃膜）治消化不良。说明了古代我们的祖先，在那时即使还不知道什么是酶，已凭着实践所积累的丰富经验，广泛应用动物、植物与微生物的酶的催化作用，来生产生活资料和治病。
目前，随着现代生物工程技术的快速发展，尤其是基因工程、蛋白质工程在酶制剂方面的深入应用，进一步拓宽了酶制剂应用的广度和深度。使得酶制剂广泛应用于食品、洗涤剂、饲料、纺织、造纸、制药、制革、发酵、石油化工、环境保护等与国民经济息息相关的各个行业。酶和微生物是能够在人类居住的地球上的自然资源和人类不断增长的消费需求之间建立一种良好平衡的要素之一。而且伴随着科学技术，尤其是生物技术的发展，酶制剂将在许多行业发挥巨大作用，
是现代众多行业进步的推动力之一，（三大技术：信息、生物、膜，生物工程技术包括四大工程技术，酶工程、发酵工程成熟）。
梅奥生物目标成为中国市场已经接受的酶制剂应用领域中的第一，并不断开拓酶制剂应用的新领域。为实现这一目标，我们须把更多的精力放在酶制剂的应用研究与开发上，积极开发各方面的新的酶制剂应用工艺（中草药、保健品、能源、可再生资源）。因此我们将致力于酶制剂应用的开发，不断开发出合适的酶制剂应用工艺，为我们的客户、乃至客户的客户提供最富创新和高效的可持续发展解决方案。因次，梅奥生物提出了自己的远景：致力于生物酶制剂的研究与发展，让未来世界经济更繁荣、生活更便利、环境更清洁。
第一节酶及酶制剂
酶是由活细胞产生的一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质。
酶除了具有蛋白质的所有特性以外，酶是具有严格的专一性和高效性。
酶具有如下重要特性：
1、催化的高效性
催化效率是普通无机催化剂的106-1013倍。例如1gα－淀粉酶结晶，在65℃15min内可使2吨淀粉糊化，而用酸来催化，则要145－150℃的耐酸、耐高压的专用设备中进行几个小时。
2、底物专一性强
一种酶只能催化一种或一类底物。
3、用条件简单（温和）
常压、常温、温和的酸碱度条件下既可反应。
酶对于生命体起着十分重要的作用，细胞内1000余步化学反应都是在酶的参与下高效完成，没有酶就不能进行新陈代谢，更谈不上生命活动。
目前发现3000余种，能制备约300余种，大量生产和应用不到几十种。只要有适宜的生长条件，微生物就可大量繁殖并生产大量的酶。不超过1.5微米的微生物是梅奥生物生产业务的核心。
作为五类高新技术之一的生物工程技术，作为生物工程技术中应用最广泛，技术最成熟、前景最辉煌的酶。因此，我衷心希望梅奥生物的每一位员工都能努力学习、积极工作，培养良好的学习力、树立良好的执行力，通过实际行动来阐释梅奥生物的事业准则：学会学习超越自己。
第二节生物工程、酶工程
21世纪取得突破性进展的世纪，是新材料、新能源、电子信息等高新技术广泛应用的时代，是人类向空间、海洋、地球内部不断拓展的时代。生物技术作为一个新兴产业，像信息技术一样，发展迅猛，它将是新世纪最有前途、最有代表性、最有推动力的科学技术。
1、生物工程也叫生物技术或生物工艺学。
生物工程在国外一般指医学工程、农业工程、环境工程、卫生工程、人体功能工程等总称。在国内生物工程与生物技术的概念混乱，把生物工程理解为函盖生物技术的一个广义的概念。
生物工程包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程。
四大工程中目前以酶工程和发酵工程发展最为成熟，基因工程和细胞工程起步较晚，很多先进的技术目前只在实验室中得到验证，一时很难转化为生成力，难以大规模生产应用。
2、酶工程
酶工程是指酶的生产和应用技术。
包括酶的发酵生产、分离纯化、分子修饰、固定化、酶反应动力与反应器、酶的应用等内容。酶工程是生物过程的主要内容，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术。
3、现代生物技术最新进展
（1）人类基因组序列工作框架图的完成2000年6月26日宣布人类基因组序列工作框架图完成，…中国科学院遗传研究所完成了1％?，为人类今后全面认识人类基因组的功能提供了一个结构基础，而要“读懂”遗传奥秘，后基因组生物学时代将有更多的事情要做。
（2）生物芯片生物芯片是缩小的生化分析器，是借用微电子工业比较成熟的微细加工工艺在玻璃、塑料、硅片上加工出微米尺寸的微结构，在微结构上进行生化反应和分析。生物芯片包括样品制备芯片、生化反应芯片和基因芯片。它的出现将给生命科学、医学、化学、新药开发、法医鉴定、环境监督等带来一场革命。
（3）动物反应器、植物反应器现代生物技术的发展已经使以下方面成为可能：
①.使动植物获得优良的性状；
②.使动植物具有抗病、抗虫和抗逆境的能力；
③.转基因动植物生物反应器－这种把外源基因转变成蛋白质的动植物体非常引人注目。
第三节酶的生产
酶的生产简单的将就是利用微生物菌种经发酵后，制得的满足应用需求的产品。
第四节酶的应用
酶的应用领域非常广泛。
1、酶具有高效﹑专一和反应条件温和的特点。它的这些特性有助于提高生产效率，降低成本，避免不必要的副反应，简化分离提纯步骤，为有目的地开发特定产品提供良好的途径；减少设备投资，提高安全系数；减少环境污染。
2、酶可以改变被作用对象的物理化学性质或赋予作用对象新的功能
⑴改变对象的溶解性﹑乳化性﹑持水性﹑粘度等等。⑵解决产品沉淀，提高原材料利用率或提高产品的可溶性，调整产品生产过程中粘度或生产出粘度适当的产品，去除杂质。⑶结合适当的调控手段，酶可以改变原副材料选定部位的性质、溶解原副材料中特定部位，也可开发特定物化特性的产品。这些作用有助于改善最终产品的加工过程﹑提高产品性能和开发新的功能性产品。
3、酶可以有选择﹑有控制地通过特定方式改变对象的化学结构，这些方式包括水解﹑氧化还原﹑裂解﹑合成﹑异构﹑转移基团等，使被作用对象按预定设想发生化学反应，生产出特定产品。
总之，酶应用的可能性几乎是无限的，未来百分之九十多的化学反应将有酶的参与，绿色化学所主要研究的问题，有称12项原则，其中九项都必须在或包括酶的参与下完成。
1、洗涤剂和个人用品工业用酶
洗涤剂是工业用酶最大的应用领域。在洗衣、洗碗、公共清洗及隐形眼睛等的清洗中，酶无处不在。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶可除去衣领、袖口处的污渍及血渍、菜渍、油渍等一系列生活污垢；而纤维素的参与则通过对棉组织纤维的修复作用而达到“织物复新”的效果。
含有淀粉葡萄糖酶和葡萄糖氧化酶的牙膏及漱口液可防止牙菌斑的形成，减少口臭。将来，多酶氧化酶在合适的介质中可完成生物染法的工作。这将使爱美人士不必再担心为美丽而付出受化学品毒害的代价。
2、酶在食品工业的应用
⑴烘焙工业用酶
早在十九世纪，人们就用麦芽做为酶的来源天家在面团中，以降低面团粘度，提高发酵率。目前，工业化的焙烤用酶被制备成可自由流动的与面粉颗粒大小相同的制剂，使用也很安全。它可改善面团的韧性、体积结构，并延长货架期。
可口的面包具有光亮的色泽、良好的弹性、膨松的体积和芳香的口味。真菌α-淀粉酶和糖化酶通过将淀粉及糊精分解成葡萄糖，提供酵母发酵用养分，从而增大面包体积，改善面包的色泽，还能使面团易揉制。真菌α-淀粉酶则具有独特的抗干硬性能，它在焙烤过程中修饰淀粉，降低了面包储存过程中重结晶的可能性，比添加无菌单甘脂(DMG)作抗干硬剂具有明显的优势。
小麦中的谷蛋白在处理面团时通过形成结实的网络结构产生韧性更好、更易揉制的面团。小麦胚乳中的戊聚糖(一些半纤维素物质)中的不溶物、面粉重点脂肪等均会通过与谷蛋白结合而破坏网络的结构。蛋白酶及戊聚糖酶可溶解戊聚糖与谷蛋白结合形成的胶状物质。而脂肪酶则组织了甘油三脂与谷蛋白的结合。加酶后的面包心结构均匀、光华且更白。葡萄糖氧化酶则可部分替代用于强化谷蛋白的化学氧化剂和溴盐酸等，从而提高面包质量。
⑵酶应用于果汁与葡萄酒加工
果胶酶用于果汁加工已有70多年历史，现在大部分果汁加工都会用到酶。果浆酶、纤维素酶等可以使皮渣几乎全部溶解，提高果汁产量。果胶酶、阿拉伯聚粮酶可防止浓缩汁的浑浊。
葡萄果实中的酶活性很弱，不足以分解果胶类物质。酶制剂在果酒和葡萄汁的生产中可起到软化果皮、提取颜色、澄清果汁和帮助过滤等作用。酶还可以防止因真菌感染而引起的混浊及滤膜阻塞。
⑶乳品工业用酶
酶在牛奶加工中的应用已有很长历史。古时代人们用小牛精制凝乳酶促进奶酪生产时牛奶蛋白凝集。今天，DNA重组技术使得小牛凝乳酶的基因克隆到微生物中，生产出价廉物美的粗制凝乳酶，只需对奶酪生产工艺作少许改动。
从牛奶凝集得到新鲜凝乳块主要含酪蛋白、脂肪、碳水化合物和矿物质，这此化合物味道很淡。奶酪的风味是在成熟过程中逐渐获得的。使用不同的微生物或其酶系可使奶酪逐渐成熟，得到风味不同的奶酪；使用蛋白酶则可不解干酪，加速奶酪的成熟。来自米氏毛霉的脂肪酶在意大利奶酪中，由于形成短链脂肪酸而促进辣味的产生，已成为替代从小动物中提取的粗制凝乳的安全生产技术。
在以牛奶为基质配方的婴儿奶粉中加入蛋白酶已有50多年的历史了。对于婴儿这个过敏高危群体或其它牛奶过敏人群来说，部分牛奶蛋白质——抗原决定其具有潜在的危险。而使用专一性蛋白内切酶切断蛋白高亲水肽链则可消除其过敏作用，并提高婴儿奶的营养价值。
⑷蛋白质工业
A、植物蛋白
a、大豆蛋白奶
b、植物蛋白水解产物
B、动物蛋白
⑸肉类加工
A、嫩肉粉
B、保鲜剂（溶菌酶）
⑹功能食品与酶
A、谷氨酰胺转胺酶
B、天然调味品
3、纺织品整理用酶
从棉花到面料，在纺织厂要经过纺织退浆、煮练、漂白、印染等一系列工序。淀粉酶用于退浆早已是纺织行业中最古老的应用。果胶酶代替氢氧化钠进行“生物煮练”可能形成对织物低损伤和更为环保的新工艺。过氧化氢酶则以在除去漂
白残留液的过程中大显身手。
服装工业受时尚推动，风格各异的牛仔服饰、免烫整理的纯棉织品，生物抛光为设计者提供独具特色的面料品质；悬垂飘逸的天然纤维，古朴质感的麻制品无一不需纤维素酶的处理；羊毛的生物丝光防缩，麻纤维的酶法脱胶等新工艺的不断涌现，使人们在穿衣着装时避免残余氢化物的危害，并减少行业对环境的污染。
4、饲料工业用酶
猪和家禽饲料中的磷约有50-80%以肌醇六磷酸(植酸)的形式存在。多数单胃动物体内没有可消化植酸的酶，因而会排除有害于环境的含磷粪便。全世界的牲畜每年排除的含磷粪便多达八百万吨，如果在饲料中添加植酸酶，一方面通过释放被结合的磷提高营养价值，另外可使排出的磷减少30%。
用蛋白酶及碳水化合物酶加工的大豆蛋白、菜籽蛋白或谷类蛋白可制成小猪、小牛的母乳替代品，具有与母乳同样的功能和营养，且价格低廉。
5、啤酒酿造工业用酶
传统方法将谷物转化成啤酒的酶来自麦芽。如果麦芽汁中酶活性变化过过低可能导致一系列质量问题：提取率低，麦汁分离时间长，发酵慢，啤酒的口味及稳定性差等。
工业酶可用来补充麦芽天然含有的酶，用辅料(玉米、小麦、水稻等淀粉类原料)酿啤酒，大麦酿啤酒时分别加入α-淀粉酶，β-葡聚糖酶及蛋白酶可确保酿造质量。
麦芽汁分离和啤酒过滤是酿酒工艺中两个常见的难关。在糖化过程中，β-葡聚糖酶和戊聚糖酶的应用可解决这些问题。
啤酒发酵初期酵母产生的双乙酰使啤酒有一种类似乳酪的味道。当啤酒中双乙酰的含量下降到某一水平（大约0.07ppm）时，则标志着啤酒的成熟。发酵早期加入α-乙酰乳酸脱峻酶可促进双乙酰分解，缩短啤酒发酵时间并确保良好的风味。
6、酶与燃料酒精
由生物原料生产的酒精可用作传统机动车燃料的替代品、提高辛烷值，减少尾气污染。燃料酒精是淀粉类原料(如玉米)经“干磨”的方法磨碎，糊化后在α-淀粉酶的作用下液化。部分降解的淀粉经糖化酶转化为葡萄糖，由酵母利用糖发酵产生乙醇，再经蒸馏脱水后即可得到燃料酒精。其副产品DDG(全谷物饲料)是非常好的动物饲料。
7、淀粉糖工业用酶
六十年代初，糖化酶的应用很快使大多数葡萄糖生产工艺都由酸水解变成酶水解。由于酶反应的高效性和专一性，人们可以大规模地生产纯度更高、更易结晶的产品。1973年，固定化葡萄糖异构酶大开发使得高糖果浆的工业化生产成为可能。这一工业还迅速采用了由分子生物学和遗传工程学得到的新酶，使工艺不断得到优化和突破。
淀粉(主要来源于小麦、玉米、木薯及马铃薯等)制糖的主要转化步骤是液化、糖化和异构化。
在淀粉悬浮液中加入耐温型的α-淀粉酶，搅拌后通过喷射液化器在105-110摄氏度的温度下经一系列管道系统停留约5分钟，使淀粉完全糊化。部分液化了
的淀粉经板式换热后其温度降至90-100摄氏度。淀粉酶进一步反应1-2小时，即可得到麦芽糊精。液化淀粉所产生的麦芽糊精经糖化酶或真菌α-淀粉酶进一步糖化，可生产各种不同甜度的甜味剂，如麦芽糖浆及高转化糖浆。应用β-淀粉酶、糖化酶及普鲁兰酶可生产高麦芽糖浆和中转化糖浆，其麦芽糖含量接近80%。
另外，淀粉经酶水解后还可发酵生产酒精、多元醇、维生素C和青霉素等。
8、发酵工业与酶
中华民族早在5000年前就开始利用微生物发酵生产食品、调味品和饮用酒类，是世界上最早应用发酵技术的民族之一。
随着人类对微生物生理活动规律认识的加深，利用外源的高活力工业酶制剂将淀粉分解成为菌种利用效率最高的葡萄糖，并加入到发酵培养基中。形成了在时间与空间上均可分别进行的糖化和发酵工艺。这种工艺将工业化的α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶(即糖化酶)的应用引入发酵工业，并立即带来发酵工业技术进步的巨大飞跃。
时至今日，仅仅是将淀粉分解为葡萄糖的酶制剂已远远不能满足发酵工业的需求，具备以下特征的酶越来越受到发酵工业的青睐：
◆更宽的PH、温度适应范围；
◆更少的副产物生成；
◆减少化学品使用以利于环境保护。
除了上述两种酶的应用外，越来越多的酶被不断地引入到发酵工业中以使人们可利用更多的原料来源，或使生产过程更环保和便利。
9、制革工业用酶
皮革/毛皮加工中使用酶制剂有着悠久的历史，第一种商品化皮革酶制剂产生于1908年。如今，从皮革/毛皮加工的浸水、脱毛/浸灰、脱脂、软化、浸酸，到蓝湿皮处理及中和等制革工序中，蛋白酶和脂肪酶均大显神通。同时使用两种酶制剂时，由于协同效应而使酶的作用更加明显。
酶不仅简化了制革这一传统污染行业的应用工艺，同时在环保方面发挥了无可比拟的优势。全世界一年因制革产生含铬废物60万吨。用酶处理含铬废物不仅回收了铬，还能通过不同工艺得到动物饲料或明胶，解决了人们对废物填埋的燃眉之急。
10、造纸与制浆工业用酶
造纸是与皮革并列的另一重污染工业。其中用含氯化合物对纸浆漂白的工艺过程污染尤为严重。半纤维素酶的处理可洗去半纤维素类物质，有效地对木质素进行漂白。木聚糖酶是这种有助于减少氯及无氯的漂白工艺的主要手段。
木材中的树脂会粘在抄纸机的滚轴上，引起造纸机械方面的问题。轻则形成纸张瑕疵，重则造成停机。如在匀浆机中加入脂肪酶搅动纸浆，则可有效减少此类问题。
近年来，再生指发展迅速。在回收的办公室混合废纸脱墨工艺中使用纤维素酶，可生产出颜色浅亮的高清洁度纸浆，并改善白水循环的操作。
用α-淀粉酶处理所得到的低粘度淀粉可用于纸张涂层，改善纸的光泽、滑度及印刷特性。
11、生物聚合物加工用酶
用可降解的生物高分子材料生产的可降解塑料、涂料和纤维板等无疑会对控
制白色污染带来革命性的改变。酶已被用于加工诸如蛋白质、淀粉、纤维素、非淀粉多糖(如果胶、木聚糖、木质素)以及生物塑料(聚基丁酸)等一定规模的生产中。人们正在研制通过交联反应直接将单体聚合成塑料的酶。过氧化物酶、脂肪酶和转谷氨酶都能形成交联键，形成生物聚合物。
12、酶与油脂加工、石油裂解
脂肪酶可用于油脂水解，转酯反应及酯合成。利用这些技术人们可以生产出自然界中产量少但价值高的产品，如可可脂，单甘酯等。重油便轻油。
结论
我们的生活离不开酶。酶已经在洗涤剂、纺织、酿造、淀粉制糖、动物饲料、酒精、焙烤、果汁、油脂、皮革、造纸、奶制品、有机合成，医药等方面得到成功的工业应用，人类则主动地运用酶以改善自己的生存环境。尽管人类已发现和开发出多种酶，但自然界巨大的酶库远远没有得到充分的开发，今后还可能在更多的工业领域中开发出新的更加令人振奋的应用前景，为提高生产效率、改善产品性能、确保人类持续发展做出应有的贡献。
总之，今天有幸同大家共同探讨有关酶制剂的相关内容，不仅因为本公司是立志成为中国优秀的酶制剂制作商的需要，也是本公司为社会责任的一部分，更是实现我本人……一个酶制剂行业的热爱者的一个愿望，使更多人了解酶、宣传酶、应用酶，创造大家，人类美好的未来，正如梅奥公司的口号：绿色健康新生活。
髓过氧化物酶指数在57例急性冠状动脉综合征患者的临床应用 髓过氧化物酶(MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。分子量为150KDa。MPO基因位于人第17号染色体，其编码蛋白翻译修饰后形成2条轻链和2条重链，构成四聚体糖基化蛋白。在早期由北京协和洛克和美国克利夫兰医院共同研究发现出来，它具有早期预警和提前筛查心脑血管疾病一个标记物。另一方面血液中95%的MPO来源于多形核白细胞。尽早明确急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)的诊断、危险分层及正确地评估个体近期发生ACS的危险性,对尽早干预治疗ACS至关重要。有研究表明,血浆髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MP0)是早期诊断ACS的重要指标,与心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)联合应用更能增加ACS诊断的灵敏度[1]。尤其是当cTnI正常时,血浆MPO升高可预测心脏事件的发生[2]。但血浆MPO检测方法繁琐,目前无法自动化,临床应用受到限制。Unionluck全自动血细胞分析仪是一种基于流式细胞分析原理的仪器,现在广泛应用于大中型医院实验室,在计数全血细胞的同时可根据细胞内MPO染色的情况得出中性粒细胞过氧化物酶活性指数(myeloperoxidase index,MPXI),用于评价炎症状况和白血病[3-4]。现将本院分析MPXI在57例ACS患者的临床应用报道如下。
1资料与方法 1.1一股资料选择2011年5~8月本院收治的ACS患者57例。其中,不稳定型心绞痛(UAP)20例为UAP组,其中,男12例,女8例,年龄(70.00±10.10)岁。非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)20例为NSTEMI组,其中,男12例,女8例,年龄(67.00±18.10)岁。ST段抬高型心肌梗死(STEMI)17例为STEMI组,其中,男8例,女9例,年龄(69.90±15.20)岁。选取同期本院体检中心健康体检者20例为对照组,其中,男10例,女10例,年龄(63.3±3.0)岁。根据病史和辅助检查,ACS的临床诊断标准参照美国心脏病学会(美国心脏病协会)制订的标准[5]。排除标准:(1)近期罹患感染性疾病或慢性炎症疾病;(2)严重血液性疾病;(3)骨髓移植术;(4)结缔组织病和风湿病;(5)应用炎症抑制药物如非固醇类消炎镇痛药、类固醇类药物等;(6)创伤、肿瘤;(7)严重肝肾功能不全。4组年龄、性别等方面比较差异无统计学意义,具有可比性。 1.2方法 1.2.1标本采集人院后立即采集肘静脉血2管,一管为EDTA-K 抗凝标本查血 2 常规,一管为不抗凝标本查cTnI、肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶(CK),对照组的生化指标检测采用空腹抽静脉血不抗凝标本。 1.2.2血常规检查使用全自动血细胞分析仪及其配套试剂,检测白细胞(WBC)、中性粒细胞计数(NEUT)、中性粒细胞百分率(NEUT%)、MPⅪ。 1.2.3血糖、糖化血红蛋白、血脂、肌酸激酶检查血清葡萄糖、血液糖化血红蛋白、血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、CK检测使用协和洛克的试剂盒,总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)使用北京协和洛克剂盒,在用全自动生化分析仪检测。
溶菌酶及其在食品工业中的应用 Research advances in egg bioactive component—lysozyme and its applications in food industry 徐敬宜徐永平* 刘姝金礼吉?(请确认是否少写了作者姓名) XU Jing-yi XU Yong-ping*LIU Shu Yu Wang?Yongsheng Ma? （1.大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,山东大连116024； 2.国家精细化工重点实验室,山东大连116012） （1.Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology, Dalian,Shangdong116024,China；2.State Key Laboratory of Fine Chemicals,Dalian University of Technology,Dalian,Shangdong116012,China） 摘要：溶菌酶是一种对人安全且具有保健作用的蛋白酶，是国际公认的绿色天然酶制剂。它在食品工业中被广泛用作食品添加剂和防腐剂。溶菌酶广泛存在于人、动植物及微生物体内，尤以鸡蛋清中含量较高，具有巨大的开发应用价值。 关键词：溶菌酶；鸡蛋；溶菌性；食品 Abstract:Lysozyme is a bacteriolytic enzyme commonly found in nature and is present in almost all secreted body fluids and tissues of human and animals. It has also been isolated from some plants,bacteria and bacteriophages.The chicken egg white is a rich and easily available source of lysozyme.Lysozyme is used as an antimicrobial agent in various foods,either as a preservative or to control microbial processes in cheese,beer and wine production. Keywords:Lysozyme；Egg；Bacteriolytic；Food 溶菌酶（Lysozyme，法定编号：EC3.2.1.17，美国化学文摘服务社（CAS）编号[9066-59-5]）是一种安全性很高，且具有一定保健作用的蛋白酶。溶菌酶能选择性地分解微生物及植物细胞壁，对人体细胞不会产生降解作用，常作为绿色天然防腐剂被广泛应用于食品、医药等行业。WHO（World Health Organization）及许多国家，如奥地利、澳大利亚、比利时、丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、日本、西班牙和英国都公 基金项目：国家自然科学基金（项目编号：30371053） 作者简介：徐敬宜(1980－),女,大连理工大学环境与生命学院在读研究生。 通讯作者：徐永平 E-mail:bam@https://www.doczj.com/doc/5418828388.html, 收稿日期：2005-10-29
酶工程的应用及发展前景 生物技术一班 41208220 杨青青
酶工程的应用及发展前景 杨青青 （陕西师范大学生命科学学院生物技术专业1201班） 摘要：酶工程是现代生物技术的重要组成部分，它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。本文概要介绍了酶工程的概念，酶工程在农产品加工、医药工业、食品工业、污染治理工业、蛋白质高值化加工等方面的应用以及探讨了在各个工业中的发展前景。 关键词：酶工程、应用、发展前景 一、酶工程的概念 酶是由生物体产生的具有催化活性的蛋白质，它能特定的促成某个化学反应而本身却不参加反应，且具有反应率高、反应条件温和、反应产物污染小、能耗低、反应容易控制等特点。这些特点比传统的化学反应具有较大的优越性。酶的应用不仅可以增强产量，提高质量，降低原材料和能源消耗，改善劳动条件，降低成本，而且可以生产出用其他方法难得到的产品，促进新产品、新技术和新工艺迅速发展。随着现代生物技术的兴起，酶工程技术应运而生，并在制药、食品工业和农产品加工显示出强大的生命力。酶工程就是利用酶催化作用，
通过适当的反应器工业化的生产人类所需的产品或是达到某一目的，它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。酶工程包括自然酶的开发和利用、固定化酶、固定化细胞、多酶反应器（生物反应器）、酶传感器等。 二、酶工程的应用以及发展前景 1、酶工程在农产品加工上的应用与前景 以前，人们认为氨基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。随着研究的发现，蛋白质经消化道中的酶水解后，主要以小肽的形式被吸收，比完全游离的氨基酸更易吸收利用。这一发现启发了科研工作者采用酶工程技术用蛋白质生产生物活性肽的新思路。生物活性肽是蛋白质中20种天然氨基酸以不同排列组合方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能。主要是通过酶法降解蛋白质而制得。 目前已经从大豆蛋白、玉米蛋白、牛奶蛋白、水产蛋白的酶解物中制得一系列功能各异的生物活性肽。因为各类蛋白质存在的差异性，所以在生产活性肽方面有略微的不同。不论哪种方法，都会用到一定的酶类水解蛋白质。比如：文献报道采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解大豆蛋白，配合活性炭的吸附处理、超滤、真空浓缩和喷雾干
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
1. 溶菌酶简介 溶菌酶，又称细胞壁水解酶，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1，4糖苷键，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。 2. 溶菌酶的理化性质（可要可不要） 溶菌酶是一种糖苷水解酶，是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白，相对分子质量为14 300，分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构，形成一个椭圆形的外形结构， 溶菌酶纯品为白色粉末结晶，无臭、甜味，易溶于水和低浓度的盐溶液，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃，最适pH为5～7，在低温干燥条件下可长期保存，热稳定性强，耐酸性强，pH为4—7时，100℃下处理45 min仍能保持其酶活性，但在碱性条件下化学性质不稳定，易变性。 3. 溶菌酶的作用 1．抗菌消炎 2．抗病毒：溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 3．增强免疫力：溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。 4．其它方面的药理作用：溶菌酶还具有激活血小板的功能。可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。 5．促进双歧乳酸杆菌增殖：溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细
第34讲酶的研究与应用 A组基础题组 考点一酶在果汁生产、洗涤方面的应用 1.果胶酶能分解果胶等物质,澄清果蔬饮料,在食品加工业中有着广泛的应用。某兴趣小组的同学对三种不同品牌的果胶酶制剂(制剂中果胶酶浓度相同)进行了探究,其实验设计及实验结果如下表所示。 注:“+”越多表示果汁越浑浊。 (1)表中X所代表的数值应为,Y的果汁浑浊程度应表示为(用若干个“+”表示)。 (2)除了观察果汁浑浊程度外,还可以通过检测的变化量来判断不同品牌果胶酶制剂的效果。若使用该方法,相关物质变化量最大的是组。 (3)微生物是生产果胶酶的优良生物资源。分离和筛选能产生果胶酶的微生物,使用的培养基应以 为唯一碳源;如需进一步纯化果胶酶,可根据果胶酶分子的(至少写出两点)等特性进行分离提纯。由于果胶酶的活性容易受到外界环境因素的干扰,所以应利用技术减少影响从而保护酶的活性。 2.(2016江苏盐城阜宁中学期末,32)某同学用含有不同种类酶制剂的洗衣粉进行了如下实验。 请回答以下问题:
(1)该实验的目的是探究。该实验还应控制的无关变量有。该实验中分别构成两组对照实验。 (2)该同学在实验过程中可通过观察来判断酶的催化效率。 (3)蛋白酶洗衣粉的去污原理是。 (4)大力推广使用加酶洗衣粉代替含磷洗衣粉,有利于生态环境保护,这是因为。 (5)加酶洗衣粉中的酶是用特殊的化学物质层层包裹的,遇水后包裹层很快溶解,释放出来的酶迅速发挥催化作用,请说明这是否应用了酶的固定化技术及其理由是。 考点二固定化酶与固定化细胞 3.东北农业大学科研人员利用双重固定法,即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接),海藻酸钠作为包埋 剂来固定小麦酯酶,研究固定化酶的性质,并对其最佳固定条件进行了探究。如图显示的是部分研究结果(注:酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率,包括酶活性和酶的数量),请分析回答下列问题: (1)下列所示的酶固定化技术中属于包埋法的是。 (2)从对温度变化的适应性和应用范围的角度分析,图甲所示结果可以得出的结论是对温度变 化的适应性更强且应用范围更广。 (3)图乙曲线表明浓度为的海藻酸钠溶液包埋效果最好,当海藻酸钠溶液浓度较低时,酶活力低的原因是。 (4)固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋,而是用戊二醛作交联剂,这是因 为。 4.(2016江苏南通中学期中,29)下图1表示制备固定化酵母细胞的某步操作,图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图,请据图分析回答:
聚合酶链式反应 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 反应准备 其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整。 PCR反应五要素： 引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。 PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。 模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常
第28卷第6期 V ol 128 N o 16长春师范学院学报(自然科学版)Journal of Changchun N ormal University (Natural Science )2009年12月Dec.2009 溶菌酶的应用进展 丁亦男1,聂洪峰2 (1.长春师范学院生命科学学院,吉林长春 130032; 2.吉林省辽源市第五中学,吉林辽源 136200) [摘 要]介绍了溶菌酶的生物学价值、在各领域中的应用,并对利用溶菌酶时存在的问题进行了分 析,最后对溶菌酶的应用前景进行了展望。 [关键词]溶菌酶;生物学价值;应用;展望 [中图分类号]Q556 [文献标识码]A [文章编号]1008-178X (2009)06-0046-02 [收稿日期]2009-06-09 [作者简介]丁亦男(1982-),女,吉林长春人,长春师范学院生命科学学院助理实验师,硕士研究生,从事动物营养与饲 料科学研究。 溶菌酶(lys ozyme )是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶(murami -dase ),或N -乙酰胞壁质聚糖水解酶(N -acetyl muramide glycanohydralase )[1]。它是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,N -乙酰胞壁酸(NAM )与N -乙酰葡萄糖胺(NAG )之间的β-1,4-糖苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。该酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清,哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶,其中以蛋清含量最为丰富。 1 溶菌酶的生物学价值 111 抗菌消炎 溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶,此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一。该酶能催化水解细胞壁中的N -乙酰胞壁酸和N -乙酰氨基葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键,使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,细菌内容物溢出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌,在分泌型免疫球蛋白A 、补体的参与下,还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌。此外,它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合,使其失活,并能增强抗生素和其它药物的疗效,改善组织基质的粘多糖代谢,从而达到消炎、修复组织的目的。 112 抗病毒 溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,与DNA 、RNA 、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎,尤其对输血后肝炎及急性肝炎效果显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性,其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长,并能防止疱疹性病毒感染。113 增强免疫力 溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一,参与机体多种免疫反应,在机体正常防御功能和非特异性免疫中,具有保持机体生理平衡的重要作用。实验表明溶菌酶可改善和增强巨嗜细胞吞噬和消化功能,激活白细胞吞噬功能,并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少,从而增强机体的抵抗力。2 溶菌酶在各领域的应用 211 溶菌酶在饲料工业中的应用 溶菌酶与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用,具有良好的防腐作用,在饲料中添加溶菌酶可防止霉变,延长饲料的贮存期,减少不必要损耗。溶菌酶与葡萄糖氧化酶一起使用有增效作用,且加入花生四烯酸后抗酸作用更强。此外,溶菌酶与免疫球蛋白在功能上也有着紧密的联系,并能与其它生命活性物质互补增强抗体的活性,从而杀灭细菌,因为溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作用[2]。在不用任何抗生素情况下,于饲料中添加饲用溶菌酶制剂,可促进饲料中营养物质的消化吸收,提高增重和饲料报酬,减少死亡。曹江山采用添加了溶菌酶的饲用酶制剂饲喂同一鸡舍的鸡,与对照组相比,产蛋数增加7104%,蛋重增加7106%,产蛋率提高5176%,饲料转化率提高6169%,比对照组增加收入0146元。 212 溶菌酶在食品工业上的应用 溶菌酶可用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜。有人对冷却肉生产中溶菌酶、Nisin 、G ma 液保鲜效果的比较实验表明:当三种保鲜剂单独使用时溶菌酶明显地优于对照组,也显著地优于G ma 组,略优于Nisin 组[3]。溶菌酶还可以用于低温肉制品的保鲜,由湖南农业大学研制的 ? 64?
实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术 【实验目的】 掌握PCR反应的原理及操作技术。 【实验原理】 PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。 【器材与试剂】 1．器材 DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统 2．材料 模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。 3．试剂 (1) 10×PCR 缓冲液 (2) MgCl2 15mmol/L (3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L (4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl (5) 引物1和引物2：2 μmol/L (6) 琼脂糖凝胶电泳试剂 【操作步骤】 1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl 10×PCR 缓冲液 2 μl MgCl2（15mmol/L） 2 μl dNTP（2.5mmol/L） 2 μl 引物1 (2μmol/L) 2 μl 引物2 (2μmol/L) 2 μl 模板DNA 2 μl Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl 总体积20 μl 2．按下述循环程序进行扩增 程序阶段程序名称温度时间循环数 1 预变性94℃ 3 min 1 变性94℃30 sec 2 退火52℃30 sec 30 延伸72℃30 sec 3 保温4℃∞ 1 3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。 【要点提示】 1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。 2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。 3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
实验三、酶切与连接 一、实验目的与原理简介 限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。 制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带； 而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面： 1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况； 4）切割与连接方式；5）接头状态。 酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种： 1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。 2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。 二、材料和试剂 限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪 三、实验步骤 1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下： 2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。 3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。 4）回收产物电泳检测后进行连接： 连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl 目的基因 6μl 质粒载体 2μl 产物酶切体系 pPI9K 质粒酶切体系 DDW 4.6μl DDW 7μl 10×H Buffer 1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段 4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut 0.2μl(37 ℃15min)
实验一溶菌酶的溶菌作用 实验目的： 1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。 2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。 基本原理： 正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。 溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β- 1,4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。 实验材料： 1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。 2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml原液，并稀释为100、50、10 ug/ml标准液，用前保存在冰箱中。 3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3次，10分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）； 4、其它：无菌打孔器（孔径2mm），无菌毛细吸管、毫米尺等。 实验方法： 1、制备含葡萄球菌的琼脂平板加热融化3%琼脂，冷至60℃~70℃时，加入1ml葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。 2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径2mm左右，孔距 5-20mm。用针头挑出孔内琼脂， 3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。
酶在制药方面的应用 摘要：酶的生产与应用技术过程叫做酶工程。药用酶是指具有治疗和预防疾病功效的酶。酶法制药是在一定条件下利用酶的催化作用，将底物转化为药物的技术过程。现在生物制药越来越受到人们的关注，本文将对酶在制药方面的应用展开讨论。 关键字：酶工程；应用；药物 引言：因为酶的催化作用专一性强，催化作用效率高和催化条件温和，酶制剂已成为制药方面的新宠。在制药方面，酶的使用越来越广泛，治疗效果也很显著。 Abstract: The enzyme production and application technology of enzyme engineering process called. A medicinal enzyme is a treatment and prevention of diseases of the enzyme. Enzymatic method of medicine is that under certain conditions the enzyme catalysis, converting a substrate for drug technology process. Now the biopharmaceutical receives people's attention more and more, the enzymes in pharmaceutical applications are discussed. Keywords: enzyme engineering; application; drug Introduction:Because the enzyme catalysis has strong specificity, high efficiency and catalysis catalytic mild condition, enzyme preparation has become the new favorite of pharmaceutical. In medicine, the enzyme is used more and more widely, and treatment effect is also very significant. 一、概述 酶工程是现代生物技术的重要组成部分，酶工程制药是将酶或活细胞固定化后用于药品生产的技术。应用固定化的酶或细胞戳了能全程合成药物分子，还能用于药物的转化。[1] 酶工程作为发酵工程的替代品，其应用具有广阔的前景，将导致整个发酵工业和化学合成工业的巨大改革。[2] 酶工程制药主要研究各种产药酶的来源、酶的固定化、酶反应器及相应的操作条件等。酶工程生产药物具有生产工艺结构简单紧凑、目的产物产量高、产品回收容易、回收率高、可重复生产及污染少等优点。药用酶是指具有治疗和预防疾病功效的酶。例如，用于治疗白血病的天冬酰胺酶，用于防护辐射损伤的超氧化物歧化酶，用于防治血栓性疾病的组织纤溶酶原活化剂等。[2] 酶法制药是在一定条件下利用酶的催化作用，将底物转化为药物的技术过程。例如，用青霉素酰化酶生产半合成抗生素，用β—络氨酸酶生产多巴，用谷氨酸脱羧酶生产γ—氨基丁酸等。为了改进酶的催化特性，酶法制药还可以利用酶固定化和酶的非水相催化技术。[1] 酶法制药技术主要包括酶的选择与催化反应条件的确定，固定化酶及其在制药方面的应用，酶的非水相催化及其在制药方面的应用等。 药用酶的生产技术有：①提取分离法；②生物合成法；③化学合成法。[3] 二、固定化酶在制药方面的应用 固定化酶的研究从20世纪50年代开始，1953年联邦德国的格鲁布霍费和施莱恩采用
溶菌酶的研究及应用简介 摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。 关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展 溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。 1 溶菌酶的发现 1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年https://www.doczj.com/doc/5418828388.html,schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus
lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。 2 溶菌酶的理化性质、空间结构 2.1溶菌酶的理化性质 溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3围剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下: 2.2 空间结构 溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直
酶在食品中的应用 人类对酶的应用可以追溯到几千年前。在对酶的不断认识过程中，我们给酶下了一个科学的定义:酶是由生物活细胞产生的、具有高效和专一催化功能的生物大分子。食品酶学是酶学的基本理论在食品科学和技术领域中应用的科学，主要研究食品原料、食品产品中酶的性质、结构、作用规律以及食品储藏、加工和食用品质的影响，食品级酶的生产及其在食品储藏、加工环节的应用理论与技术。 食品用酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。在食品工业中广泛采用酶来改善食品的品质以及制造工艺，酶作为一类食品添加剂，其品种不断增多。它在食品领域中的应用方兴未艾。与以前的化学催化剂相比，酶反应显得特别温和，这对避免食品营养的损失是很有利的。 酶制剂在食品行业中的应用主要体现在以下几个方面: 1. 有利于食品的保藏，防止食品腐败变质。例如:目前与甘氨酸配合使用的溶菌酶制剂，应用于面食、水产、熟食及冰淇淋等食品的防腐。如溶菌酶用于 pH6.0,7.5的饮料和果汁的防腐。乳制品保鲜新鲜牛乳中含有13毫克/100毫升的溶菌酶，人乳中含量为40毫克/毫升。在鲜乳或奶粉中加入一定量溶菌酶，不但可起到防腐作用，而且有强化作用，增进婴儿健康。 2. 改善食品色香味形态和质地。如，花青素酶用于葡萄酒生产，起到脱色作用;复合蛋白酶嫩化肌肉，使肉食品鲜嫩可口;在肉类香精生产中常用的风味酶就是一种复合酶，使最终反应达到风味化要求。 3. 保持或提高食品的营养价值。通过多种蛋白酶的作用生产多功能肽及各种氨基酸已经是营养保健行业常见的加工方法。
国内的溶菌酶的应用与发展 溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性{3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在2015%
的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol /L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:内- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内 - N - 乙酰己糖胺酶为例,内- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分