全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
全国高中生物竞赛大纲Last revision on 21 December 2020
全国中学生生物学竞赛纲要 理论部分 全国竞赛理论考试应当注意那些适用于同一类群中大多数生物的生物学概念。考试不应包括特殊事实、例外或者需要特殊或地方经验的某地特有生物的知识。 大部分试题应当考查学生的理解力、科学工作技能以及他们生物学知识的应用。单纯考识记的试题应尽可能的少，不应超过总分的25%。 理论部分应按注明的比例包括以下7个部分： Ⅰ.细胞生物学 25%细胞的结构和功能 * 化学成分 * 细胞器 * 细胞代谢 * 蛋白质合成 * 通过膜的转运 * 有丝分裂和减数分裂 微生物学 生物工程学 Ⅱ.植物解剖和生理（重点是种子植物） 15%
组织和器官的结构和功能 * 光合作用、蒸腾作用和气体交换 * 水分、矿物质和同化物的运输 * 生长和发育 * 生殖（包括蕨类和苔藓） Ⅲ.动物解剖和生理（重点是脊椎动物） 15%组织和器官的结构和功能 * 消化和营养 * 呼吸作用 * 血液循环 * 排泄调节（神经的和激素的） * 生殖和发育 * 免疫 Ⅳ.动物行为学 5% * 行为的体系 * 行为的原因 * 争斗行为 * 习得性行为
Ⅴ.遗传学与进化 15% * 变异：突变和渐变 * 孟德尔遗传 * 多等位性、重组、伴性遗传 * 哈迪温伯格定律 * 演化的机理 Ⅵ.生态学 15% * 生态系统 * 食物关系 * 能流 * 生物地球化学系统 * 演替 * 种群结构和动态 * 生物圈和人 Ⅶ.生物系统学 10%结构和功能；主要类群中典型生物之间的演化和生态的关系 在上述各主题中均应包括有科学思维的原则和生物学方法的原理的题目。 全国竞赛考纲细目
（生物科技行业）全国中学生生物学竞赛纲要
全国中学生生物学竞赛纲要 （全国中学生生物学联赛可适当参考） 附表I 理论部分 全国竞赛理论考试应当注意那些适用于同壹类群中大多数生物的生物学概念。试题壹般不包括特殊事实、例外或者需要特殊或地方经验的某地特有生物的知识。大部分试题考查学生的理解力、科学过程技能以及他们生物学知识的应用。单纯考查记忆的试题比例较少，壹般不超过总分的25%。 理论部分应按注明的比例包括以下7个部分： Ⅰ.细胞生物学25% -细胞的结构和功能 *化学成分 *细胞器 *细胞代谢 *蛋白质合成 *通过膜的转运 *有丝分裂和减数分裂 -微生物学 -生物工程学 Ⅱ.植物解剖和生理（重点是种子植物）15% -组织和器官的结构和功能 *光合作用、蒸腾作用和气体交换 *水分、矿物质和同化物的运输
*生长和发育 *生殖（包括蕨类和苔藓） Ⅲ.动物解剖和生理（重点是脊椎动物）15% -组织和器官的结构和功能 *消化和营养 *呼吸作用 *血液循环 *排泄调节（神经的和激素的） *生殖和发育 *免疫 *皮肤及其衍生物 *运动器官 Ⅳ.动物行为学5% *行为的体系 *行为的原因 *争斗行为 *习得性行为 Ⅴ.遗传学和进化15% *变异：突变和渐变 *孟德尔遗传 *多等位性、重组、伴性遗传 *哈迪-温伯格定律
*演化的机理 Ⅵ.生态学15% *生态系统 *食物关系 *能流 *生物-地球化学系统 *演替 *种群结构和动态 *生物圈和人 Ⅶ.生物系统学10% -结构和功能；主要类群中典型生物之间的演化和生态的关系 在上述各主题中均应包括有科学思维的原则和生物学方法的原理的题 目。 全国竞赛考试纲要细目 Ⅰ.细胞生物学25% 细胞的结构和功能 *化学成分 -单糖、双糖、多糖 -脂类 -蛋白质：氨基酸、遗传密码子、蛋白质结构 蛋白质的化学分类：简单蛋白质和结合蛋白质 蛋白质的功能分类：结构蛋白和酶
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/537022407.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/537022407.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
群体遗传与进化 (总分：1086.48，做题时间：90分钟) 一、填空题(总题数：15，分数：73.50) 1.达尔文自然选择学说的主要内容有：______、______、______、______。 （分数：6.00） 填空项1:__________________ 2.达尔文的自然选择学说认为，生物的变异一般是______，而自然选择是______。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ 3.按照达尔文的自然选择学说，生物的______为进化提供原始材料，______是生物进化的动力，______决定生物进化的方向。 （分数：4.50） 填空项1:__________________ 4.生存斗争是指______之间的相互斗争，以及______与______之间的斗争。 （分数：4.50） 填空项1:__________________ 5.某地区在建立工业区前后，灰色尺蛾与黑色尺蛾的比由95:5发展到5:95，产生这种现象的原因是 1。 （分数：1.50） 填空项1:__________________ 6.某农药是对付蚜虫的有力武器，连续使用了十几年后，人们发现杀虫效果下降，蚜虫______的增强可用达尔文的______进行解释。 （分数：3.00） 填空项1:__________________ 用达尔文自然选择学说分析解释狼的进化过程。 （分数：12.00） (1).狼群中存在不同类型的个体，如有跑得快的，有跑得慢的。它说明生物具有______的特性，而这种特性一般是______的。______和______是生物进化的内在因素。（分数：4.00） 填空项1:__________________ (2).随着环境的改变，食物稀少，跑得快、凶猛的狼才能获得食物生存下去。这样，食物、环境对狼起了______作用，而这种作用是______的，它决定着生物进化的______。（分数：4.00） 填空项1:__________________ (3).狼的进化过程是通过______实现的。（分数：4.00） 填空项1:__________________ 7.三界理论认为______、______和______是进化中的三个平行分支。 （分数：4.50） 填空项1:__________________ 8.物种的定义是指个体间能相互交配或可能相互交配而产生可育后代的______。不同物种的成员在______上是彼此隔离的，而同一物种的个体享有一个共同的______。
DNA测序标准实验流程（V1.2版）1．对DNA的要求 纯度：OD 260 / OD 280 = 1.6 ~ 2.0， PCR产物用量：每反应15 -20ng（片段大于3KB可加两倍DNA）。 质粒DNA用量：每反应20 -25ng（插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）。 1300载体本身序列就比较长，我们建议每反应加50-80ng。 每个小组一次配100份BD MIX(BD 0.4ul,5*buffer 1.8ul,water 2.8ul)长期保存，每个反应体系加5ul 2．P CR产物的测序PCR反应（测序PCR反应中只要加一个引物就可以，需要加热盖） 标准反应体系： 10ul体系 试剂用量 纯化的P CR产物(15-20 ng / μL) 1 μL （片段大于3KB可加两倍DNA） 引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8μL 灭菌去离子水 5.8μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温 质粒DNA的测序PCR反应 标准反应体系： 10ul体系 试剂用量 质粒DNA (20-25 ng / μL) 1 μL （插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA） 引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8 μL 灭菌去离子水 5.8 μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温 注意：BigDye (2.5 x)是一种含有DNA聚合酶和荧光物质的混合物，非常昂贵，平时都放在-20度保存。加之前拿出来放在冰上融化，用完马上放回-20冰箱。BigDye (2.5 x)和BigDye Seq Buffer (5 x)可以混合后一起加到反应体系，有多的话可以放在-20冰箱，下次还能使用。 BIGDYE尽量避光，一般用铝珀纸遮盖。P CR样品处理过程中如在室温放置和酒精挥发阶段都尽量用铝珀纸遮盖或者放入抽屉，有利于样品的稳定性。 3．测序产物纯化 单个0.2 mL离心管离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 台式离心机12000 x g 4°C离心20 min，马上用枪吸尽上清液。(DNA很微量，基本看不到，所以枪头不要碰到DNA沉积处) 3. 每孔加入100μL 75% 酒精，12000 x g 4°C离心10 min，马上用枪吸尽上清液。（如果不是马上操作，DNA沉淀很可能 浮起，被吸走，所以如果没有及时吸去上清的话，要重新离心5MINS。） 4. 让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净(至少20mins)，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 96孔板整板离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 板式离心机4000 x rpm 4°C离心30min；马上倒置96孔板，弃上清，倒置在洗水纸上，离心500rpm，1mins。 3. 加100μL 75% 酒精，4000 rpm 4°C离心20 min；马上倒置96孔板，弃上清，离心500rpm,1mins。 4.让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净（至少15mins），加入10 μL Hi-Di For mamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 4. 部分相关试剂 酒精：100%酒精使用国产分析纯；75%酒精用去离子水配制。 BigDye (2.5 x) -20度保存 BigDye Seq Buffer (5 x) 4度保存 7.5M NH3Ac 4度保存 Hi-Di For mamide -20度保存 黄方亮 2009.10.27日整理
方案设计诺禾致源最新发表GBS遗传图谱文章 123 微生物基因组测序16S/18S/ITS等扩增子测序细菌基因组 de novo 测序真菌基因组 de novo 测序微生物重测序宏基因组测序动植物基因组测序全基因组survey 全基因组 de novo 测序泛基因组测序变异检测BSA性状定位遗传图谱全基因组关联分析群体进化Hi-C测序人类基因组测序全基因组测序外显子测序目标区域测序单细胞基因组测序建库测序建库测序诺禾致源微信文章精彩阅读 >> 版权所有：北京诺禾致源科技股份有限公司 转录调控测序 真核有参转录组测序 医学转录组测序 真核无参转录组测序 比较转录组与泛转录组测序 原核转录组测序 宏转录组测序 单细胞转录组测序 LncRNA测序 circRNA测序 small RNA测序 ChiP-seq RIP-seq 全基因组甲基化测序图1 亲本间多态性SNP在全基因组及外显子区域的分布 图4 遗传图谱与物理图谱共线性分析 图2 玉米 bin map (横轴表示染色体编号，纵轴表示样本数； 红色表示与亲本Qi319基因型相同，蓝色表示与亲本Ye478相同； 黄色：杂合基因型) 图3 三个环境下的PH性状相关QTL在染色体上的分布GBS遗传图谱代表文献 中国农业科学院作物研究所研究人员携手诺禾致源重测序团队， 采用GBS技术，利用Illumina HiSeq 2500测序平台，对314株高 世代群体（RILs）进行双末端PE125低深度测序（平均测序深度 0.07×），检测群体SNP，并进行遗传标记开发，亲本间多态性 SNP标记分布如右图所示（图1）。 基于该图谱，对玉米3个株型相关的性状进行了定位，并且在3个 环境中定位出了主效QTL。通过这些定位出的QTL，预测到2个候 选基因，为后续进行基因的准确鉴定奠定了基础（图3）。案例1 基于GBS技术的玉米高密度遗传图谱构建和株型相关性状定位 案例西北农林科技大学研究人员与诺禾致源重测序团队合作，采用GBS技术，对枣树F 1群体的145个个体利用Illumina HiSeq PE150平台测序，检测群体SNP，并进行遗传标记开发，构建遗传图谱。本研究共得到12个连锁群，上图标记数为2540个，遗传距离总长为1456.53cM，标记间平均距离为0.88cM。 2 基于GBS技术构建枣树F 1代高密度遗传图谱 本研究通过亲本及子代SNP基因分型，开发bin 标记，基于4183个 bin 标记构建玉米高密度遗传图谱，遗传距离总长为1545.65cM， 标记间平均距离为0.37cM, 平均物理距离为0.51Mb（图2）。 类 别作物类林木类作物类作物类林木类作物类作物类发表时间2016201620152015201420132013发表刊物BMC Genomics Tree Genetics & Genomes Molecular Breeding BMC Genomics G3:Gene Genomes Genetics BMC Genomics Plos Genetics IF 3.8672.1322.1083.8672.913.8676.661策 略GBS GBS GBS GBS GBS GBS GBS link link link link link link link 物 种 玉米[1] 枣树[2] 狼尾草[3] 木薯[4] 苹果[5] 覆盆子[6] 柳枝稷[7]
畜牧兽医学报 2016，47（10）：1947-1953 A c t aV e t e r i n a r i a e tZ o o t e c h n i c aS i n i c a d o i ：10.11843/j .i s s n .0366-6964.2016.10.001动物基因组学重测序的应用研究进展 汪文强1，2，赵生国2，马利青3，郭继军4，马月辉1*，赵倩君1* （1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070； 3.青海省畜牧兽医科学院，西宁810016； 4.青海省畜牧总站，西宁810001 ）摘 要：随着第二代测序技术的研发和应用，基因组学的研究不断出新，为其带来了更新的科研方法和解决方案。基因组测序可以更深地了解一个物种的分子进化、基因组成和基因调控等特点，特别基因组重测序技术的发展和应用，将基因组学的研究推向了多领域、多样化、多功能的新阶段。现已从变异检测、性状定位、遗传图谱构建、群体进化分析等方面取得丰硕成果。文章阐述了动物基因组重测序学领域中全基因组测序技术和简化基因组测序技术的应用现状和发展趋势。关键词：重测序； 群体进化；变异检测；性状定位；遗传图谱中图分类号：S 813.3 文献标志码：A 文章编号：0366-6964（2016）10-1947-07收稿日期：2015-12-30 基金项目：中国农业科学院科技创新工程（A S T I P -I A S 01）；国家自然科学基金项目（31201765）；国家绒毛用羊产业技术体系（C A R S -40-01 ）作者简介：汪文强（1991-），男，甘肃天水人，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E -m a i l ：187931128479@163.c o m *通信作者：赵倩君，副研究员，E -m a i l ：z h a o q i a n j u n @c a a s .c n ；马月辉，研究员，E -m a i l ：y u e h u i .m a @263.n e t T h eR e s e a r c hP r o g r e s s a n dA p p l i c a t i o no fR e s e q u e n c i n g B a s e d o nA n i m a lG e n o m i c s W A N G W e n -q i a n g 1，2，Z H A OS h e n g -g u o 2，M AL i -q i n g 3，G U OJ i -j u n 4，M A Y u e -h u i 1*，Z H A O Q i a n -j u n 1*（1.I n s t i t u t e o f A n i m a l S c i e n c e ，C h i n e s e A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ，B e i j i n g 1 00193，C h i n a ；2.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ，G a n s uA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ，L a n z h o u 730070，C h i n a ；3.Q i n g h a i A c a d e m y o f A n i m a l S c i e n c e a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ，X i n i n g 8 10016，C h i n a ；4.A n i m a lH u s b a n d r y S t a t i o n o f Q i n g h a i ，X i n i n g 8 10001，C h i n a ）A b s t r a c t ：W i t h t h e a p p l i c a t i o na n dd e v e l o p m e n t o f t h en e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g t e c h n i q u e ，t h e r e s e a r c h e so f g e n o m i c s a r e c o n s t a n t l y u p d a t i n g ，w h i c h f i n d s o u t n e ws o l u t i o n s a n d t e c h n o l o g i e s t o g e n o m i c s .T h e g e n o m e s e q u e n c i n g i s c o m p e t e n t t o l e a r nt h e p o p u l a t i o ne v o l u t i o n ，g e n ec o m p o s i -t i o na n d g e n e r e g u l a t i o nd e e p l y ，e s p e c i a l l y t h e a p p l i c a t i o na n dd e v e l o p m e n t o f g e n o m e r e s e q u e n c -i n g t e c h n o l o g y ，w h i c hm a k e s t h e g e n o m e r e s e a r c h c o m e i n t o b e i n g a n e we r a i nm u l t i r e g i o n ，d i v e r -s i f i c a t i o na n dm u l t i f u n c t i o n .N o w a d a y s t h e n e x t g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g t e c h n i q u e h a sm a d e a l a r g e p r o g r e s s i nm u t a t i o nd e t e c t i o n ， f i n em a p p i n g o f i m p o r t a n t g e n e s ，g e n e t i cm a p c o n s t r u c t i o n ，a n a l y -s i s o f p o p u l a t i o n e v o l u t i o n ，a n d s oo n .T h e r e v i e ws t a t e s a p p l i c a t i o n s t a t u s a n dd e v e l o p m e n t t e n d -e n c y o fw h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y a n d r e d u c e d -r e p r e s e n t a t i o n g e n o m e s e q u e n c i n g t e c h -n o l o g y i na n i m a l g e n o m e r e s e q u e n c i n g .K e y w o r d s ：r e s e q u e n c i n g ；p o p u l a t i o ne v o l u t i o n ；m u t a t i o n d e t e c t i o n ；f i n e m a p p i n g o fi m p o r t a n t g e n e s ；g e n e t i cm a p 随着S a n g e r 测序技术的限制性，第二代测序技术（N e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g ，N G S ）的优势逐渐凸显，对重测序技术的发展起到了重要的作用。N G S 的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定D N A 的序列，测序技术成本低、高通量、快速、高效等特点能有效地鉴别单核
1 技术优势 全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息分析。可全面挖掘DNA 水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因，研究发病及遗传机制提供重要信息。 全基因组测序 平台优势 HiSeq X 测序平台 读长：PE150 通量：1.8T/run 测序周期：3 天 专为人全基因组测序准备、测序周期短、通量高
生物信息分析 技术路线 技术参数 样品要求 样本类型：DNA 样品 样本总量：≥1.0 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本) ≥1.5 μg DNA (提取自FFPE 样本)样品浓度：≥ 20 ng/μl 测序平台及策略HiSeq X PE150 测序深度 肿瘤：癌组织(50X),癌旁组织/血液样本(30X)遗传病：30~50 X 项目周期37天
3 案例解析 该研究选取3个家系中6个患者和1个正常个体，首先使用基因芯片寻找纯合突变位点，然后对其中无亲缘关系的2例患者采用全基因组测序研究，在2例患者非编码区域均发现相同的变异，10号染色体PTF1A 末端发生一个点突变（chr10：23508437 A>G），且变异在患病人群和细胞试验中均得到了验证。研究解释了生长发育启动子隐性变异是罕见孟德尔遗传病的常见致病原因，同时说明许多疾病的致病突变也可能位于非编码区。 图1 检出的变异信息 智力障碍是影响新生儿心智发育的一类疾病。这项研究选取50个经过基因芯片和全外显子测序未确诊致病因子的trio 家系，全基因组测序检出84个de novo SNVs 和8个de novo CNVs，及一些结构变异（如VPS13B、STAG1、IQSEC2-TENM3），检出率为42%。揭示编码区的de novo SNVs 和de novo CNVs 是导致智力障碍的主要因素，全基因组测序可以作为可靠的遗传性检测应用工具。 案例一 单基因病研究——全基因组测序鉴定PTF1A末端增强子常染色体隐性突变导致胰腺 发育不全[1] 案例二 复杂疾病研究——全基因组测序解析智力障碍的主要致病因素[2] 图2 PTF1A 的家系图谱
差异位点分析流程步骤分解 数据准备： mkdir 1.QC cd 1.QC ln -s /root/mdna-data/reseq/1.QC/*.fastq . Ls cd .. mkdir 2.mapping cd 2.mapping ln -s /root/mdna-data/reseq/2.mapping/ref.fasta . 步骤1：参考基因建索引 cd 2.mapping ##bwa建索引： bwa index ref.fasta Expected Result：得到一系列BWA 进行alignment 需要的文件。 ##samtools建索引： samtools faidx ref.fasta Expected Result：生成refgene.fasta.fai。每行都是fasta 文件中每条contig 的record，每条record 由contig name, size, location, basesPerLine 和bytesPerLine 组成。 ##生成字典： java -jar /root/mdna_software/picard-tools-1.102/CreateSequenceDictionary.jar R=ref.fasta O=ref.dict Expected Result：生成refgene.dict。描述fasta 文件内容，类似SAM header 格式。 步骤2：bwa比对 ##用bwa作比对： nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim1.fastq -f 1.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim2.fastq -f 2.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim_unpaired.fastq -f s.sai & jobs
三代基因组测序技术原理简介 【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1： 测序技 术的发 展历程 生命体 遗传信 息的快 速获得 对于生 命科学 的研究 有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
第十四章群体遗传与进化 本章习题 1．解释下列名词：孟德尔群体、基因库、基因型频率、等位基因频率、遗传漂变、生殖隔离、地理隔离、进化树、进化速率、分子进化钟。 孟德尔群体：通过个体间的相互交配的结果，孟德尔遗传因子可以各种方式从一代传递给另一代的群体称为孟德尔群体。该群体不是一些个体的简单集合体，而是在各个体间有相互交配关系的集合体。 基因库：是指一个群体中全部个体所共有的全部基因称为基因库。 基因型频率：任何一个遗传群体都是由它所包含的各种基因型所组成的，在一个群体内某特定基因型所占的比例就是基因型频率。 等位基因频率：是指一群体内特定基因座中某一等位基因占该基因座等位基因总数的比率，或称基因频率。 遗传漂变：在一个小群体内，每代从基因库抽样形成下一代个体的配子时，会 产生较大的抽样误差，由这种误差引起群体等位基因频率的偶然变化，叫做随机遗传漂变，或简称遗传漂变。 生殖隔离：是指防止不同物种的个体相互杂交的环境、行为、机械和生理的障碍。生殖隔离可以分为两大类：①?合子前生殖隔离，能阻止不同群体的成员间交配或产生合子；②.合子后生殖隔离，是降低杂种生活力或生殖力的一种生殖隔离。这两种生殖隔离最终达到阻止群体间基因交换的目的。 地理隔离：是由于某些地理的阻碍而发生的，例如海洋、大片陆地、高山和沙漠等，使许多生物不能自由迁移，相互之间不能自由交配，不同基因间不能彼此交流。 进化树：采用物种之间的最小突变距离构建而成的一种树状结构，可以表示不同物种的进化关系和程度，也称为种系发生树。一般是当不同物种蛋白质的氨基酸差异进一步以核苷酸的改变来度量时可用最小突变距离表示。 进化速率：进化速率是指在某一段绝对时间内的遗传改变量，一般可用不同等大分子的差异来估算进化速率。mtRNA和DNA物种的蛋白质、. 分子进化钟：利用不同物种的蛋白质、DNA ffi mtRNA等大分子的差异估算出的分子进化速率，进而可以推断不同物种进化分歧的时间。 2. 什么是生物的进化？它和遗传学有什么关系？答：生物进化是指在不断变化的自然条件下，生物体通过遗传、变异和自然选择并在隔离等因素的作用下，由简单到复杂、低级到高级的不断演变，可从旧物种中产生新的物种。其中微观进化是指发生在一个种内的进化，宏观进化是指在物种以上水平的进化。 遗传学所研究的是生物遗传和变异的规律和机理，进化论所研究的是生物物种的起源和演变过程。每个物种一般具有相当稳定的遗传特性，但新种的形成和发展则有赖于可遗传的变异。遗传学的研究不仅可以明确质量性状和数量性状的遗传规律，而且可从分子、细胞、个体和群体各个不同水平认识了遗传和变异的实质，为认识和控制生物的进化提供了理论和实践的依据，阐明生物进化的根本原因和历史进程，是研究进化论问题的必要基础。近代分子遗传学的发展更使进化论从分子水平上得到进一步的了解，根据遗传学研究的结果、采用实验方法人工创造和综合新的物种和新品种。如采用远缘杂交和细胞遗传分析等方法，已能清楚地说明小
基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间， 体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系
DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul
Illumina测序的化学原理 目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升 一些常用的基本概念介绍： flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位 reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度 双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能 primer：PCR中的引物 测序反应基本流程介绍： 1、建库 A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的） B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端 C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列 E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求 建库示意图如下：
SLAF-seq技术：大规模基因分型高通量策略 大规模基因分型在遗传相关性研究中起着重要作用，尤其是和高通量测序技术结合后，它为基因挖掘带来了新的机遇。大规模基因分型的有效解决方法：SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing），该技术前期利用生物信息学方法，对目标物种的参考基因组（或已知BAC序列）进行系统分析，设计标记开发方案，后期根据前期的方案，构建SLAF-seq文库，筛选特异性长度片段进行高通量测序，将获得测序深度和质量满足要求的SLAF片段来代表目标物种的全基因组信息。它具有以下优势: 1. 高深度测序保证分型准确； 2. 简化的策略降低测序成本； 3. 前期简化方案预测保障标记数量最优； 4. 采用double index技术能适用于大群体。 在文章中，我们用水稻和大豆数据验证了SLAF-seq技术的有效性，2个结果都显示预测的和实际的结果一致性非常高，同样基因分型也非常准确。我们还利用这个技术构建了鲤鱼的高密度遗传图谱（物种高杂合且无参考基因组），对2个亲本和211个子代进行简化测序，得到50,530个SLAF标签，构建了50条连锁群，上图标记5885，标记平均距离0.68 cM。将得到的连锁群与鲤鱼的近缘物种斑马鱼进行比较基因组学研究，结果显示鲤鱼的2条连锁群对应斑马鱼的1条染色体，二者的共线性良好，说明高质量的SLAF分型结果。 SLAF-seq技术为大规模基因分型提供了一个高通量的策略，并且能应用于不同物种和群体，适用性非常广。SLAF标记的质量评估部分的基本原理，采用基因分型质量评分对标记质量进行评估。质量评分采用PHRED 公式的算法，错误率数据用新的方法得到。文章中，对于SLAF 简化效率的评估方式和结论，通过仿真研究发现4 ×以上的测序深度能够保证SLAF的准确性。对鲤鱼4.28×的测序进一步验证，SLAF的质量能将错误率控制在3%(5/190)以内。 SLAF的技术流程： （1）预实验：用rice 和soybeans 等training data确定酶和酶切片段大小。 （2）构建文库：包括酶切，连接，PCR反应，凝胶电泳过程。 （3）基因分型：采用配对双末端测序获得短片段DNA序列信息，用软件定义和评估基因型。