第3章土壤养分的生物有效性研究方法
第一节土壤有效养分的概述
一、土壤有效养分概念的提出
“有效养分”(available nutrient)概念的提出，最早来自于土壤化学家。在对土壤进行了大量的化学分析之后，发现土壤中各种营养元素的全量是很丰富的。但是，其中绝大部分对植物却是无效的。由于当时这一概念尚处于笼统与模糊状态，许多人回避这一术语。经过大半个世纪以后，随着农业增产对科学施肥的要求不断提高，随着土壤学、植物学、植物营养学等多学科的共同关注与交叉研究的发展，关于“土壤养分有效性”(soil nutrient availability)或“土壤养分生物有效性"(soil nutrient bioavailability)，无论是在概念的确立与延伸方面，还是在测定方法与定量化的研究方面都有了长足的进展。
1、原初定义
“土壤有效养分"(soil available nutrient)，是指土壤中能为当季作物吸收利用的那一部分养分。当季
2、化学有效养分
在土壤化学分析基础上建立起来的“有效养分”概念：是指土壤中那些能被植物根系吸收的无机态养分以及在植物生长期内由有机态释放出的无机态养分。如土壤中的氮、硫等元素绝大部分足以有机形态存在，可以通过矿化作用转化为无机形态。
3、生物有效养分
20世纪下半叶，随着植物营养学与植物生理学的发展，对于“土壤有效养分”的研究不只停留于养分形态的化学分析，而是延伸到：
（1）植物根如何从土壤中获取养分的过程，以及植物从土壤中能得到多少养分，进而提出了矿质态养分向根迁移的方式与速率问题。
（2）植物根系对土壤养分的生物有效性的影响，以及“根际”与“土体”之间养分有效性的差异等。
（3）植物与土壤养分有效性相互作用的综合研究，提出并发展了“土壤养分生物有效性”概念。美国土壤学家S.A.Barber教授在他的“土壤养分生物有效性”专著中指出：“生物有效养分(bioavailable nutrient)，系指存在于土壤的离子库中，在作物生长期内能够移动到位置紧挨植物根的一些矿质养分。”
定量化地研究土壤的有效养分及其影响因素，对于发展合理施肥与推荐施肥的技术，进而推动农业增产有着重要意义。
二、土壤有效养分的基本要素
1、在养分形态上，是以离子态为主的矿质养分。
2、在养分的空间位置上，是处于植物根际或生长期内能迁移到根际的养分。
第二节土壤养分的化学有效性研究方法
化学有效养分是指土壤中存在的矿质态养分。可以采用不同的化学方法从土壤样品中提取出来。化学有效养分主要包括可溶性的离子态与简单分子态养分，易分解态和交换吸附态养分以及某些气态养分。
一、相关研究
就是选择一种适宜的测定方法。通过研究几种测定方法测定的土壤有效养分含量与生物试验（植物栽培试验）获得的指标之间的相关性，选定最佳的测定方法。相关研究可以采用盆栽试验，也可以采用田间试验。盆栽试验处理简单，只有施肥与不施肥2个处理，5次重复。
（一）化学浸提剂的选择
化学有效养分测定方法的选择实际上就是化学浸提剂的选择。提取土壤有效养分的化学浸提剂种类很多，常因营养元素和土壤类型的不同而异，在提取原理上除纯化学法外，还有物理化学方法等。
由于阳离子形态的养分，主要存在于土壤溶液中或被吸附于土壤有机一无机复合体上，因此，用过量的阳离子浸提剂可将土壤样品中各种交换态和几乎全部的可溶态阳离子提取出来，然后，对提取液定量测定，将所得数值作为土壤有效养分的含量。
土壤中有效态阴离子的提取，以土壤有效磷为例，所选择的浸提剂要求其提取土壤中易分解的有机态磷、易溶解的无机态磷和部分的胶体吸附态磷。针对不同土壤上各种形态磷的组分与比例不同，以及磷酸盐的类型不同，可以有多种有效磷的浸提剂。石灰性土壤上常采用奥尔逊(Olsen)法，该法的提取剂是0.5molNaHC0
3
(pH8.5)。
近来，也有用电超滤法提取土壤有效养分的。此法是将土壤悬浊液置于电场下，通过改变电压和温度，分别提取出不同吸附态的养分。在低电压条件下，分离出的养分量少，其结果与土壤溶液中的养分浓度相关性较高，而在高电压时，提取出的养分量多，其结果就与土壤中吸附态养分相关性高。通过大量生物试验表明，用电超滤法提取的土壤有效钾比化学方法测定的交换钾能更好地反映出土壤有效钾的含量水平。
（二）化学有效养分测定值的相对性
不同化学浸提方法所测出的“有效养分”数值是不相同的，在很大程度上取决于浸提剂的类型。例如李酉开等用7种不同的化学浸提剂测定我国15种土壤所测得土壤有效磷含量的平均值差异较大，说明化学方法测定的“有效养分”含量是相对值。就看哪种方法测定值与植物生长量或产量或养分吸收量之间关系最为密切。
（三）化学有效养分与植物产量或吸收量之间的相关性（举例）
1、土壤有效氮测定值与生物指标间的相关研究
李生秀教授采用了通气培养法、淹水培养法、碱解扩散法、碱性高锰酸钾蒸馏法、沸水提取法、酸性高锰酸钾浸提法、1mol/LKCl提取起始硝态氮法等六种方法测定土壤有效氮含量，生物指标采用小麦吸氮量、产量、生物产量、相对产量等11个指标，研究了不同测定方法与生物指标之间的相关性。
最优测定方法：通气培养法。
最优生物指标：吸氮量。
2、土壤有效磷测定值与生物指标间的相关研究
（1）测定方法
用水作提取剂-提取的是水溶性磷，用于砂性土壤。
用饱和CO
2水作提取剂-模拟根系分泌CO
2
，用于石灰性土壤，但测定手续繁琐。
用有机酸溶液作提取剂-模拟根系分泌有机酸，如1%柠檬酸。
用无机酸作提取剂-一般用缓冲溶液，如HCl-NH
4
F、HOAc-NaOAc等，用于酸性土壤。
用碱溶液作提取剂-目前主要用0.5mol/LNaHCO
3
溶液，主要用于石灰性土壤，也可用于中性和酸性土壤。
还有同位素稀释法、阴离子交换树脂法等。
（2）生物指标：作物吸磷量、产量、生物产量等。
相关性研究结果：
石灰性土壤-0.5mol/LNaHCO
3
（pH8.5）法最理想。
酸性土壤-HCl-NH
4
F法较好。
3、土壤有效钾测定值与生物指标间的相关研究
（1）测定方法
土壤速效钾（交换性钾占95%以上）-1mol/LNH4OAc提取，火焰光度计法测定，水土比10:1。
土壤缓效钾-用热1molHNO
3
提取，火焰光度计法测定，水土比10:1。
土壤有效钾-用冷的2molHNO
3
提取，火焰光度计法测定，水土比20:1。
（2）生物指标：作物吸钾量、产量、生物产量等。
二、校验研究
丰缺指标的制定或土壤有效养分测试值分级标准的制定。为了提出施肥建议而对化学测定值进行校验研究，这种校验研究必须在田间进行，不能用盆栽试验代替。
（一）测试值分级
1、根据相对产量对测试值分级
原始分级是根据产量和经验来划分，分为高、中、低3等。1945年Bray以测定的有效磷作为分级依据，应用相对产量，而不用绝对产量。绝对产量受条件影响很大，而相对产量可以抵消影响。故以后均采用相对产量对测试值进行分级。相对产量是和地块的生产潜力相比较而得。例：最高产量（施肥）600kg，对照产量（基础产量或不施肥产量）300kg，则相对产量为50%。
例如：宁夏灌淤土麦田土壤碱解氮含量丰缺指标的制定（宁夏农学院学报，1992，13(4)：1-9）（1）布置多点对比田间试验：设置不施氮肥和施氮肥2个处理，共16个试验点，记录产量，计算相对产量。
（2）采集基础土样（0-20cm），按照相关研究所确定的测定方法（改进碱解扩散法）测定土壤碱解氮含量。
（3）相关性分析：土壤碱解氮测试值与小麦相对产量之间的关系研究
表1 供试灌淤土碱解氮测试值与小麦产量
土样号土壤碱解氮
(mg/kg)
小麦产量(kg/亩)
N
P
5
N
15
P
5
相对产量
(%)
9001 78.1 277.8 424.1 65.5 9003 81.5 265.4 356.7 74.4 9005 71.3 214.5 337.0 63.6 9007 117.4 287.5 338.4 85.0 9008 78.8 250.1 358.1 69.8 9012 75.3 211.1 334.8 63.1 9014 68.1 227.1 373.4 60.8 9016 86.8 300.0 878.0 79.4 9018 90.7 355.2 415.7 85.4 9020 85.5 294.1 375.4 78.3 9022 99.7 267.6 298.4 89.7 9023 77.8 220.5 362.2 60.9 9024 134.4 355.6 368.0 96.6 9025 116.9 352.6 422.8 83.4
9027 187.7 300.3 314.8 95.4
9028 123.2 268.9 3ll.1 86.4
平均98.3 278.0 360.6 77.4
首先，进行简单相关分析。分析结果：土壤碱解氮测试值与小麦相对产量之间呈极显著正相关（r ＝0.818＞r
0.01
＝0.623）。
然后，最优曲线类型选择。根据土壤碱解氮测试值与小麦相对产量的散点图形状，选择了六种函数式，对表1中土壤碱解氮测试值(x)与小麦相对产量(y)进行回归统计，并逐一计算出各自的剩余平方和Q、剩余标准差S、以及决定系数R2。通过其中任何一个参量的比较，就可进行选优。
线性函数(y＝a＋bx)、对数函数(y＝a＋blnx)、指数函数（y＝ae b/x，y＝100－ae bx）、幂函数(y＝ax b)、双曲线函数(y＝x/(a＋bx))。
表2 土壤碱解氮(x)与小麦相对产量(y)间最优函数模式的选择函数模式 a b Q S r R2位次
y＝a＋bx 45.90 0.320 739.52 7.268 0.818**0.670 6
y＝a＋blnx -98.67 38.694 521.58 6.104 0.876**0.767 3
y＝ae b/x138.63 -54.345 419.03 5.471 -0.902**0.813 2
y＝100-ae bx140.26 -0.0206 542.76 6.226 -0.870**0.758 4 y＝ax b7.92 0.498 583.51 6.456 0.860**0.739 5 y＝x/(a＋bx) 0.5935 0.006712 367.51 5.124 0.914**0.836 1
回归分析结果表明，用土壤碱解氮测试值与田间试验小麦相对产量所配置的六种回归方程，其相
关系数(r)均达极显著水平(r
0.01
＜r)，但它们的拟合性优劣顺序却不一样。以双曲线函数(y＝x/(a＋bx))拟合性最优，其Q、S值最小，R2最大。指数函数y＝ae b/x也较理想，线性函数y＝a＋bx的拟合性最差。据此可确认“改进碱解扩散法”所测定的土壤碱解氮测试值可用来表示宁夏灌淤土对小麦的供氮能力。
（4）根据相对产量对测试值分级，即土壤碱解氮丰缺指标的制定
根据上述相关性研究结果，拟选用双曲线回归方程：
Y＝
1000x
（N＝16，r＝0.914**）593.5＋6.712x
来确定土壤碱解氮的丰缺指标。划分的标准乃是小麦的相对产量，将小麦相对产量＜50%、50%-75%、75%-90%、90%-95%、＞95%所对应的土壤碱解氮测试值(N mg/kg)确定为极低、低、中、高、极高的分级指标。
表3 宁夏灌淤土麦田土壤碱解氮含量的分级指标（春小麦）
肥力级别极低低中高极高
相对产量(%) ＜50 50-75 75-90 90-95 ＞95
碱解氮(mg/kg) ＜45 45-90 90-135 135-175 ＞175
对氮肥反应效果极显著效果显著有效果效果不明显效果极不明显
2、根据肥力指数对测试值分级
相对产量不能表示最高产量以后的产量施肥情况，因此，提出了肥力指数或肥力指标。它表示养分足够程度的百分数。有2种表示方法：
（1）当土壤的实际肥力在最高产量肥力以前时，用相对产量去掉百分号，舍入个位数，最后以10的倍数作为近似值表示之。
（2）当土壤的实际肥力超过最高产量肥力以后，其相对产量可能达100%，有时小于100%。因此，计算公式为：肥力指数=实测值/最高产量测定值*100，如45/40*100=110%。
肥力指数的确定要根据土壤类型、作物种类、气候条件等来确定。
例如：土壤养分测试值划级、肥力指标数值和相对产量之间的相互关系比较
（二）施肥建议
1、根据土壤肥力分级指标提出施肥建议
施肥量的概念：贮备施肥量-以培肥土壤、提高产量为目的。标准施肥量-为了获得最高产量。维持
施肥量-在土壤肥力指标高的情况下少量施肥，其目的是为了维持土壤肥力。
2、根据多年定位试验结果提出施肥建议
3、按照土壤肥力等级，在各等级土壤肥力条件下进行施肥量试验，统计肥料效应方程，计算最高、经济最佳施肥量。
第三节 土壤养分的空间有效性研究方法 一、土壤养分的位置与有效性
土壤养分的有效性与其所处的空间位置密切相关。因为植物根系的溶积仅占土壤容积的很少部分，不足3%，所以仅靠根系与土壤直接接触的那部分养分作为植物有效养分，远不能满足植物对养分的需要，而实际上土壤相当部分有效养分可以通过质流和扩散途径迁移到根系表面供根系吸收利用，但这种迁移距离十分有限，因土壤和养分种类而异。故土壤养分的空间有效性十分重要。
02040
6080100120
0102030
土壤速效磷
Soil available P(mg
kg -1
)
土壤深度 S o i l d e p t h (c m )
灌区
旱区
02040
6080100120
0102030
土壤速效磷
Soil available P(mg kg -1)
土壤深度 S o i l d e
灌淤土
灰钙土黑垆土黄绵土
图3 宁夏农田土壤剖面中速效磷含量的分布
Fig.3 Distribution of available phosphorus contents in soil profiles in Ningxia farmlands
对不同层次速效磷含量的相关分析结果(表4)表明，土壤速效磷含量在各剖面层次之间存在极显著(r ＞r 0.01)的正相关关系。
表4 宁夏农田土壤速效磷含量在不同土层间的相关系数(r)
Table4 Coefficients correlation of available phosphorus contents between different soil depths of farmlands in Ningxia
土层 Depth (cm) 0～20 20～40 40～60 60～80 80～100 100～120
0～20 1 20～40 0.852** 1
40～60 0.872**
0.978**
1 60～80 0.851** 0.942** 0.975** 1 80～100 0.857** 0.870**
0.910**
0.970 1 100～120
0.833**
0.858**
0.888**
0.952
0.984** 1
020406080100120
050
100
150
200
土壤速效磷累积量(kg hm -2)
Available P accumulation
土壤深度 S o i l d e p t h (c m )
灌区旱区
020406080100120
50
100
150
200
土壤速效磷累积量(k g hm -2
)Available P accumulation
土壤深度 S o i l d e
灌淤土灰钙土黑垆土黄绵土
图4 宁夏农田土壤剖面中速效磷的累积量
Fig.4 Accumulated rates of available phosphorus in soil depth profiles in Ningxia farm lands
二、土壤剖面中养分的生物有效性
土壤剖面中养分的有效性与植物根系分布深度密切相关。根系分布深度与植物种类有关，通常农作物根深为50-100cm 。一年生植物根深大部分集中在0-30cm ，根系密度随土层深度增加而减少，很少超过2m ；多年生植物根深可达2m 以上甚至3m 以上，但根系总体积的2/3仍然分布在0-30cm 土层中。植物根系的分布深度说明植物不仅从表土而且也可从底土中吸收养分。
例题1：春小麦不同生育期从不同土层中吸收磷的相对百分率（陆景陵）
春小麦不同生育期不同土层的相对吸收磷率（%）
例题2：宁夏农田土壤剖面矿质氮与小麦吸氮量之间的关系（何文寿，干旱地区农业研究，2005，23(6)：47-55）
1、土壤剖面中矿质氮含量的分布
020406080100120
010203040
土壤矿质氮含量
Soil mineral N content(mg/kg)土壤深度 S o i l d e p t h (c m )
灰钙土 Sierozem
黑垆土 Dark loessial soil 黄绵土 Cultivated loess soil
图1 土壤剖面中矿质氮含量的分布
Fig.1 Distribution of mineral nitrogen contents in profiles of different soils
2、不同土层间土壤矿质氮含量的相关系数
表 不同土层间土壤矿质氮含量的相关系数
Table6 Coefficients of correlation of mineral nitrogen contents between different soil depths
of farmland
土层 Depth(cm) 0-20 20-40 40-60 60-80 80-100 100-120 0～20 1 20～40 0.902 **
1
40～60 0.716 **
0.890 **
1
60～80 0.554 ** 0.711 ** 0.730 **
1
80～100 0.562 **
0.707 **
0.722 **
0.881 **
1
100～120
0.722 ** 0.747 **
0.698 ** 0.804 ** 0.898 **
1
注：*，**分别表示P =0.05，0.01的显著水平。Note ：*，**Mean significance at 5% and 1%，respectively.
3、土壤剖面中矿质氮的累积量
020406080100120
0100200300400土壤矿质氮累积量
Accumulated rates of mineral N(kg/hm 2)土壤深度 S o i l d e p t h (c m )
灌区 Irrigated region
旱区 Dryland region
020406080100120
0100200300400土壤矿质氮累积量
A c c u m u l a t e d r a t e s o f m i n e r a l N (k g /h m 2
)土壤深度 S o i l d e p t h (c m
)
r p e d s o i l 灰钙土 S i e r o z e m 黑垆土 D a r k l o e s s i a l s o i l 黄绵
土 C u l t i v a t e d l o e s s s o i l
图8 灌区和旱区土壤剖面中矿质氮的累积量 图9 不同类型土壤剖面中矿质氮的累积量 Fig.8 Accumulated rates of mineral N in soil Fig.9 Accumulated rates of mineral N in
profiles in irrigated and dryland regions profiles of different soils
3、土壤剖面矿质氮的累积量与小麦吸氮量之间的关系
在0～120cm 土层中，土壤矿质氮的累积量与小麦籽粒产量、生物学产量、地上部总吸氮量呈极显著正相关(r ＞r 0.01)，表明在供试土壤条件下0～120cm 深度各层次中的矿质氮对小麦吸氮量及其产量都有极显著贡献。
表7 土壤剖面中矿质氮累积量与小麦地上部吸氮量之间的相关系数
Table 7 Coefficients of correlation between accumulated rates of mineral nitrogen in different soil depths of farmland and N
uptake amounts of wheat shoot
土层 Soil depth(cm)
0～20 0～40 0～60
0～80
0～100
0～120
NH 4-N
籽粒产量Grain yield 0.624 **
0.602 **
0.601 **
0.632 **
0.633 **
0.627 ** 生物产量Biomass 0.639 **
0.653 **
0.666 **
0.672 **
0.664 **
0.646 **
总吸N 量N uptake rate 0.608
**
0.641
**
0.620
**
0.617
**
0.613
**
0.582
**
NO 3-N
籽粒产量Grain yield 0.419
0.416
0.365 0.341 0.328 0.339 生物产量Biomass 0.456 *
0.468 *
0.425 0.392 0.359 0.352 总吸N 量N uptake rate 0.370 0.348
0.278
0.258
0.246
0.256
矿质氮Accumulated mineral nitrogen
籽粒产量Grain yield 0.622 **
0.649 **
0.664 **
0.702 **
0.709 ** 0.705 ** 生物产量Biomass 0.648 **
0.710 **
0.743 **
0.761 **
0.752 **
0.729 **
总吸N 量N uptake rate
0.591 **
0.657 **
0.649
**
0.652
**
0.648
**
0.620
**
注：*
，**
分别表示P =0.05，0.01的显著水平。Note ：*
，**
Mean significance at 5% and 1%，respectively.
三、土壤养分的地域空间变异性(即横向变异性)研究
1、研究思路
例题：宁夏不同农业生态区农田土壤氮磷钾：针对宁夏引黄灌区和宁南旱区的气候条件、土壤类型和肥力水平、耕作施肥等方面存在的差异，按照传统统计学的随机抽样理论和地统计学的要求相结合的方法，布点采集农田耕层土样、化验分析，定量研究不同地域尺度（地
块级、县级和地区级）土壤氮、磷、钾养分的横向空间分异规律及影响土壤养分变异性的因素。
2、确定研究区域
不同地域尺度：地块级、县级、地区级、省级 3、网格采样：确定采样方法：
（1）地块级采样：例题：在永宁县和西吉县各选择有代表性地块1块（约3000m 2），按照10m ×10m 网格取样，共60个采样点，每点取10钻。
（2）县级尺度范围采样：川区选择永宁县（耕地面积305km 2），山区选择西吉县（耕地面积1170km 2
），采用GPS 定位，按5km 间距网格法取样，共60个采样点，于春季采集耕层土样(0-20cm)，每个采样点取10钻。
sampling site in Xiji county
10
20
30
40
50
60
70
80
10
20
30
40
50
60
70
east-km
n o r t h -k m
（1）两个地区尺度范围采样：采用GPS 定位技术，按10km 间距网格法取样。川区耕地面积约3300km 2，山区约9400km 2，合计1.27万km 2，因此在两个地区农田布置有代表性采样点128个，于
春季
N W E S
采集耕层土样(0-20cm)，每个采样点取10钻。
2、测试分析
分析项目有：土壤全氮、碱解氮，全磷、有效磷、缓效钾和速效钾，同时测定土壤质地、自然含水量和有机质含量。
3、传统统计特征值
平均值、最大值、最小值、标准差、变异系数、估计区间等。
4、地统计学分析
采用软件：采用GIS(地理信息系统)技术平台支持的Arc/info，GS+等软件。
半方差分析：
土壤养分半方差图
1、季节
2、作物生育期
例题：宁夏引黄灌区春小麦不同生育期土壤有效氮磷钾养分含量的动态变化特点
图1 春小麦不同生育期土壤速效氮含量的变化
Fig 1 Dynamics of soil available N contents during growing period of spring wheat
图2 春小麦不同生育期土壤有效磷含量的变化
Fig 2 Dynamics of soil available P contents during growing period of spring wheat
图3 春小麦不同生育期土壤速效钾含量的变化
Fig 3 Dynamics of soil readily available K contents during growing period of spring wheat
班级 小组 姓名 评价等级 沅江三中四环八步教学模式 生物模块三导学案 第1页（共6页） 探究土壤微生物的分解作用(教师版) 【学习目标】 1.设计和进行对照实验，尝试探究土壤微生物的分解作用，进一步培养探究和创造能力。 2.分析土壤微生物分解淀粉的情况。 3.学会检测淀粉和还原糖的方法，并根据现象作出合理判断和解释。 案例1: 探究土壤微生物对落叶的作用 一、提出问题: 秋天，落叶纷飞。春天，绿草如茵。且不见落叶痕迹！落叶去哪里了？ 结合上面的实例，你能提出什么问题呢？请写下来。 落叶在土壤中能被分解掉,这究竟主要是土壤的物理化学因素的作用,还是土壤中微生物的作用呢 ？ 注意: （1）要选择有研究意义的问题作为课题来研究 （2）要选择我们能力范围之内的问题作为实验研究课题。 二、作出假设: 落叶是在土壤微生物的作用下腐烂的 提示:假设既可以是基于已有的知识或经验作出的解释,也可以是想像或猜测。 三、设计实验 1、设计方案 （1）实验原理: 微生物能分泌多种水解酶将大分子有机物分解成小分子有机物，如纤维素酶、淀粉酶可将纤维素、淀粉水解成葡萄糖。然后被分解者吸收到细胞中进行氧化分解，最终形成CO2、水和各种无机盐，同时释放能量。 （2）、实验材料: 土壤、落叶、 （3）、实验器具: 玻璃容器、标签、塑料d 袋、恒温箱、纱布。 （4）、实验设计步骤: ①取两个圆柱形的玻璃容器,一个贴上“甲组”标签,另一个贴上“乙组”标签。 ②将准备好的土壤分别放入两个玻璃容器中,将其中乙组放入恒温箱, 60℃灭菌1h 。 ③取 大小、形态相同的落叶12片,分成2份,分别用包好,埋入2个容器中,深度约5cm 。 ④将2 个容器放于实验室相同的环境中, 一段时间后,取纱布包。 ⑤观察比较对照组与实验组落叶的 腐烂程度。 提示: （1）要确定实验变量是什么 需要控制的变量有哪些如何控制这些变量 ； （2）要注意实验步骤的先后顺序。 （3）要注意写出具体的实验步骤以便指导实验的进行。
污染土壤微生物修复技术研究进展课程论文 摘要针对2014年4月环境环保部公布的首次全国土壤污染状况调查结果，撰写我国最严重的耕地污染中主要污染物镉、砷、滴滴涕和多环芳烃的微生物修复研究进展。 关键词土壤污染；微生物修复；重金属污染；有机物污染 2005年4月至2013年12月我国开展的首次全国土壤污染状况调查结果显示全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出。全国土壤总的超标率为16.1%，其中轻微、轻度、中度和重度污染点位比例分别为11.2%、2.3%、1.5%和1.1%。人类赖以生存的耕地中土壤点位超标率高达19.4%，迫在眉睫的主要污染物为镉、砷、滴滴涕和多环芳烃[1]。 微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术，它已成为污染土壤生物修复技术的重要组成部分和生力军[2]。由于我国土壤调查结果显示在农田耕地中重金属污染物镉、镍、砷、有机污染物滴滴涕和多环芳烃超标最严重，对这些污染物的治理已经迫在眉睫。所以，本文重点阐述针对这5种污染物的微生物修复技术研究进展。 1、重金属污染土壤微生物修复研究进展 土壤微生物种类繁多、数量庞大，是土壤的活性有机胶体，比表面大、带电荷和代谢活动旺盛，在重金属污染物的土壤生物地球化学循环过程中起到了积极作用。微生物可以对土壤中重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的[3]。因此，重金属污染土壤的微生物修复原理主要包括生物富集 (如生物积累、吸附作用)、生物转化(如生物氧化还原、甲基化与去甲基化以及重金属的溶解和有机络合配位降解)、生物固定（如与S2-的共沉淀）、生物滤除（如细菌的淋滤作用）等作用方式。 1.1镉污染 将具有重金属吸附能力的天然蛋白或人工合成肽展示在微生物细胞表面,可以提高微生物对重金属的吸附能力。Kuro da等[4]改造了微生物表面蛋白使得当酵母金属硫蛋白( YMT )串联体在酵母表面展示表达后,4 聚体对重金属吸附能力提高5.9 倍, 8 聚
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
第十章土壤养分循环 土壤养分循环：是指在生物参与下，营养元素从土壤到生物，再从生物回到土壤的循环过程，是一个复杂的生物地球化学过程。土壤元素通常可以反复的再循环和利用,典型的再循环过程包括： （1）生物从土壤中吸收养分 （2）生物的残体归还土壤 （3）在土壤微生物的作用下，分解生物残体，释放养分 （4）养分再次被生物吸收 一、土壤氮素循环 （一）氮素循环由两个重叠循环构成，一是大气层的气态氮循环，几乎所有的气态氮对大多数植物无效，只有若干种微生物或少数与微生物共生的植物可以固定大气中的有效氮。另一个是土壤氮的循环，即在土壤植物系统中，氮在动植物体、微生物体、土壤有机质、土壤矿物质各分室中的转化和迁移，包括有机氮的矿化和无机氮的生物固持作用、粘土对氨的固定和释放作用、硝化和反硝化作用、腐殖质形成和腐殖质稳定化作用。 （二）土壤的氮的获得（来源） 1土壤氮的获得（来源） （1）土壤母质中的矿质元素 （2）大气中分子氮的生物固定 大气和土壤空气中的分子态氮不能被植物直接吸收、同化，必须经生物固定为 有机氮化合物，直接或间接地进入土壤。 （3）雨水和灌溉水带入的氮 灌溉水带入土壤的氮主要是硝态氮形态，其数量因地区、季节和降雨量而异。 大气层发生自然雷电现象，可使氮氧化成NO2及NO等氮氧化物。 （4）施用有机肥和化学肥料 2土壤N存在形态 土壤无机态氮主要是铵态氮和硝态氮，是植物能直接吸收利用的有效态氮。有机态氮是土壤氮的主要存在形态，一般占土壤全量氮的95%以上，按其溶解度的大小及水解的难易分为水溶性有机氮、水解性有机氮和非水解性有机氮三类。 土壤溶液中的铵、交换性铵和硝态氮因能直接被植物根系所吸收，常总被称为速效态氮。 3土壤中氮的转化 （1）有机态氮的矿化过程 含氮的有机化合物，在多种微生物的作用下降解为简单的铵态氮的过程 矿化过程： 第一阶段：把复杂的含氮化合物的含氮化合物，如蛋白质、核酸、氨基糖及其多聚体等，经过微生物酶的系列作用下，逐级分解而形成简单的氨基化合物，称之为氨基化阶段。 然后在微生物作用下，各种简单的氨化物分解成氨，称为氨化作用，氨化作用可在不同条件下进行。 （2）硝化过程 有机氮矿化释放氨（氨、胺、酰胺）在土壤中转化为铵离子，铵离子通过微生物作
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
常用数据库 在DNA序列方面有GenBank、EMBL和等 在蛋白质一级结构方面有SWISS-PROT、PIR和MIPS等 在蛋白质和其它生物大分子的结构方面有PDB等 在蛋白质结构分类方面有SCOP和CATH等 生物信息学的主要研究内容 1、序列比对（Alignment） 基本问题是比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性。序列比对是生物信息学的基础，非常重要。两个序列的比对有较成熟的动态规划算法，以及在此基础上编写的比对软件包BLAST和FASTA，可以免费下载使用。这些软件在数据库查询和搜索中有重要的应用。 2、结构比对 基本问题是比较两个或两个以上蛋白质分子空间结构的相似性或不相似性。已有一些算法。 3、蛋白质结构预测，包括2级和3级结构预测，是最重要的课题之一 从方法上来看有演绎法和归纳法两种途径。前者主要是从一些基本原理或假设出发来预测和研究蛋白质的结构和折叠过程。分子力学和分子动力学属这一范畴。后者主要是从观察和总结已知结构的蛋白质结构规律出发来预测未知蛋白质的结构。同源模建（Homology）和指认（Threading）方法属于这一范畴。虽然经过30余年的努力，蛋白结构预测研究现状远远不能满足实际需要。 4、计算机辅助基因识别(仅指蛋白质编码基因)。最重要的课题之一 基本问题是给定基因组序列后，正确识别基因的范围和在基因组序列中的精确位置.这是最重要的课题之一，而且越来越重要。经过20余年的努力，提出了数十种算法，有十种左右重要的算法和相应软件上网提供免费服务。原核生物计算机辅助基因识别相对容易些，结果好一些。从具有较多内含子的真核生物基因组序列中正确识别出起始密码子、剪切位点和终止密码子，是个相当困难的问题，研究现状不能令人满意，仍有大量的工作要做。 5、非编码区分析和DNA语言研究，是最重要的课题之一 在人类基因组中，编码部分进展总序列的3~5%，其它通常称为“垃圾”DNA，其实一点也不是垃圾，只是我们暂时还不知道其重要的功能。分析非编码区DNA 序列需要大胆的想象和崭新的研究思路和方法。DNA序列作为一种遗传语言，不仅体现在编码序列之中，而且隐含在非编码序列之中。 6、分子进化和比较基因组学，是最重要的课题之一 早期的工作主要是利用不同物种中同一种基因序列的异同来研究生物的进化，构建进化树。既可以用DNA序列也可以用其编码的氨基酸序列来做，甚至于可通过相关蛋白质的结构比对来研究分子进化。以上研究已经积累了大量的工作。近年来由于较多模式生物基因组测序任务的完成，为从整个基因组的角度来研究分子进化提供了条件。 7、序列重叠群（Contigs）装配 一般来说，根据现行的测序技术，每次反应只能测出500或更多一些碱基对的序列，这就有一个把大量的较短的序列全体构成了重叠群（Contigs）。逐步把它们拼接起来形成序列更长的重叠群，直至得到完整序列的过程称为重叠群装配。拼接EST数据以发现全长新基因也有类似的问题。已经证明，这是一个NP-完备
一、名词解释(31个) 1.生物信息学:广义：应用信息科学的方法和技术，研究生物体系和生物过程 息的存贮、信息的涵和信息的传递，研究和分析生物体细胞、组织、器官的生理、病理、药理过程中的各种生物信息，或者也可以说成是生命科学中的信息科学。狭义：应用信息科学的理论、方法和技术，管理、分析和利用生物分子数据。 2.二级数据库：对原始生物分子数据进行整理、分类的结果，是在一级数据库、 实验数据和理论分析的基础上针对特定的应用目标而建立的。 3.多序列比对：研究的是多个序列的共性。序列的多重比对可用来搜索基因组 序列的功能区域，也可用于研究一组蛋白质之间的进化关系。 4.系统发育分析：是研究物种进化和系统分类的一种方法，其常用一种类似树 状分支的图形来概括各种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分支的图形称为系统发育树。 5.直系同源：如果由于进化压力来维持特定模体的话，模体中的组成蛋白应该 是进化保守的并且在其他物种中具有直系同源性。 指的是不同物种之间的同源性，例如蛋白质的同源性，DNA序列的同源性。（来自百度） 6.旁系（并系）同源：是那些在一定物种中的来源于基因复制的蛋白，可能会 进化出新的与原来有关的功能。用来描述在同一物种由于基因复制而分离的同源基因。（来自百度） 7.FASTA序列格式：将一个DNA或者蛋白质序列表示为一个带有一些标记的 核苷酸或氨基酸字符串。 8.开放阅读框（ORF）：是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止 密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。（来自百度） 9.结构域：大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区 域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域。 10.空位罚分：序列比对分析时为了反映核酸或氨基酸的插入或缺失等而插入空 位并进行罚分，以控制空位插入的合理性。（来自百度） 11.表达序列标签：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分 cDNA的3’或5’端序列。（来自文献） 12.Gene Ontology 协会： 13.HMM 隐马尔可夫模型：将核苷酸序列看成一个随机序列，DNA序列的编 码部分与非编码部分在核苷酸的选用频率上对应着不同的Markov模型。14.一级数据库：数据库中的数据直接来源于实验获得的原始数据，只经过简单 的归类整理和注释 15.序列一致性：指同源DNA顺序的同一碱基位置的相同的碱基成员, 或者蛋 白质的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成员, 可用百分比表示。 16.序列相似性：指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所 占的比例。 17.Blastn：是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将 同所查序列作一对一地核酸序列比对。（来自百度） 18.Blastp：是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐 一地同每条所查序列作一对一的序列比对。（来自百度）
土壤微生物研究规范——II. 土壤样品的运输和贮存 1. 土壤微生物样品的运输 土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。 微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。 如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。 如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下： （1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2 d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。 （2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。 （3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。 （4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。 如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。 如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地
生物信息学中的机器学习方法 摘要：生物信息学是一门交叉学科，包含了生物信息的获取、管理、分析、解释和应用等方面，兴起于人类基因组计划。随着人类基因组计划的完成与深入，生物信息的研究工作由原来的计算生物学时代进入后基因组时代，后基因组时代中一个最重要的分支就是系统生物学。本文从信息科学的视角出发，详细论述了机器学习方法在计算生物学和系统生物学中的若干应用。 关键词：生物信息学；机器学习；序列比对；人类基因组；生物芯片 1.相关知识 1.1 生物信息学 生物信息学时生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。它综合运用生物学、计算机科学和数学等多方面知识与方法，来阐明和理解大量生物数据所包含的生物学意义，并应用于解决生命科学研究和生物技术相关产业中的各种问题。 生物信息学主要有三个组成部分：建立可以存放和管理大量生物信息学数据的数据库；研究开发可用于有效分析与挖掘生物学数据的方法、算法和软件工具；使用这些工具去分析和解释不同类型的生物学数据，包括DNA、RNA和蛋白质序列、蛋白质结构、基因表达以及生化途径等。 生物信息学这个术语从20世纪90年代开始使用，最初主要指的是DNA、RNA及蛋白质序列的数据管理和分析。自从20世纪60年代就有了序列分析的计算机工具，但是那时并未引起人们很大的关注，直到测序技术的发展使GenBank之类的数据库中存放的序列数量出现了迅猛的增长。现在该术语已扩展到几乎覆盖各种类型的生物学数据，如蛋白质结构、基因表达和蛋白质互作等。 目前的生物信息学研究，已从早期以数据库的建立和DNA序列分析为主的阶段，转移到后基因组学时代以比较基因组学（comparative genomics）、功能基因组学（functional genomics）和整合基因组学（integrative genomics）为中心的新阶段。生物信息学的研究领域也迅速扩大。生物信息学涉及生物学、计算机学、数学、统计学等多门学科，从事生物信息学研究的工作者或生物信息学家可以来自以上任何一个领域而侧重于生物信息学的不同方面。事实上，我们今天正需要具备各种背景知识、才能和研究思路的研究人员，集思广益
第八章土壤养分的生物有效性“土壤有效养分”(soil available nutrient)，原初的定义是指土壤中能为当季作物吸收利用的那一部分养分。定量化地研究土壤的有效养分及其影响因素，对于发展合理施肥与推荐施肥的技术，进而推动农业增产有着重要意义。 生物有效养分(bioavailable nutrient)，系指存在于土壤的离子库中，在作物生长期内能够移动到位置紧挨植物根的一些矿质养分。”也可以说，土壤的生物有效养分具有两个基本要素：(1) 在养分形态上，是以离子态为主的矿质养分。 (2) 在养分的空间位置上，是处于植物根际或生长期内能迁移到根际的养分。 第一节土壤养分的化学有效性化学有效养分是指土壤中存在的矿质态养分。可以采用不同的化学方法从土壤样品中提取出来。化学有效养分主要包括可溶性的离子态与简单分子态养分；易分解态和交换吸附态养分以及某些气态养分。 一、化学浸提有效养分的方法及评价 1. 化学有效养分的提取 提取土壤有效养分的化学浸提剂种类很多，常因营养元素和土壤类型的不同而异。在提取原理上除纯化学法外，还有物理化学方法等。 由于阳离子形态的养分，主要存在于土壤溶液中或被吸附于土壤有机一无机复合体上，因此，用过量的阳离子浸提剂可将土壤样品中各种交换态和几乎全部的可溶态阳离子提取出来，然后，对提取液定量测定，将所得数值作为土壤有效养分的含量。 土壤中有效态阴离子的提取，以土壤有效磷为例，所选择的浸提剂要求其提取土壤中易分解的有机态磷，易溶解的无机态磷和部分的胶体吸附态磷。针对不同土壤上各种形态磷的组分与比例不同，以及磷酸盐的类型不同，可以有多种有效磷的浸提剂。石灰性土壤上常采用奥尔逊(Olsen)法，该法的提取剂是0. 5 mol NaHC03(pH8.5)。 近来，也有用电超滤法提取土壤有效养分的。此法是将土壤悬浊液置于电场下，通过改变电压和温度，分别提取出不同吸附态的养分。在低电压条件下，分离出的养分量少，其结果与土壤溶液中的养分浓度相关性较高；而在高电压时，提取出的养分量多，其结果就与土壤中吸附态养分相关性高。通过大量生物试验表明，用电超滤法提取的土壤有效钾比化学方法测定的交换钾能更好地反映出土壤有效钾的含量水平。 2 化学有效养分测定值的相对性 不同化学浸提方法所测出的“有效养分”数值是不相同的，在很大程度上取决于浸提剂的类型。对于同一种土壤采用不同的浸提剂所测出的“有效磷”的数值相差很大，最大的可相差
浅谈生物信息学在生物方面的应用 生物信息学（bioinformaLics）是以核酸和蛋白质等生物大分子数据库及其相关的图书、文献、资料为主要对象，以数学、信息学、计算机科学为主要手段，对浩如烟海的原始数据和原始资料进行存储、管理、注释、加工，使之成为具有明确生物意义的生物信息。并通过对生物信息的查询、搜索、比较、分析，从中获得基因的编码、凋控、遗传、突变等知识；研究核酸和蛋白质等生物大分子的结构、功能及其相互关系；研究它们在生物体内的物质代谢、能量转移、信息传导等生命活动中的作用机制。 从生物信息学研究的具体内容上看，生物信息学可以用于序列分类、相似性搜索、DNA 序列编码区识别、分子结构与功能预测、进化过程的构建等方面的计算工具已成为变态反应研究工作的重要组成部分。针对核酸序列的分析就是在核酸序列中寻找过敏原基因，找出基因的位置和功能位点的位置，以及标记已知的序列模式等过程。针对蛋白质序列的分析，可以预测出蛋白质的许多物理特性，包括等电点分子量、酶切特性、疏水性、电荷分布等以及蛋白质二级结构预测，三维结构预测等。 生物信息学中的主要方法有：序列比对，结构比对，蛋白质结构的预测，构造分子进化树，聚类等。基因芯片是基因表达谱数据的重要来源。目前生物信息学在基因芯片中的应用主要体现在三个方面。 1、确定芯片检测目标。利用生物信息学方法，查询生物分子信息数据库，取得相应的序列数据，通过序列比对，找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 2、芯片设计。主要包括两个方面，即探针的设计和探针在芯片上的布局，必须根据具体的芯片功能、芯片制备技术采用不同的设计方法。 3、实验数据管理与分析。对基因芯片杂交图像处理，给出实验结果，并运用生物信息学方法对实验进行可靠性分析，得到基因序列变异结果或基因表达分析结果。尽可能将实验结果及分析结果存放在数据库中，将基因芯片数据与公共数据库进行链接，利用数据挖掘方法，揭示各种数据之间的关系。 生物信息学在人类基因组计划中也具有重要的作用。 大规模测序是基因组研究的最基本任务，它的每一个环节都与信息分析紧密相关。目前，从测序仪的光密度采样与分析、碱基读出、载体标识与去除、拼接与组装、填补序列间隙，到重复序列标识、读框预测和基因标注的每一步都是紧密依赖基因组信息学的软件和数据库的。特别是拼接和填补序列间隙更需要把实验设计和信息分析时刻联系在一起．拼接与组装中的难点是处理重复序列，这在含有约30％重复序列的人类基因组中显得尤其突出。 人类基因组的工作草图即将完成，因此发现新基因就成了当务之急。使用基因组信息学的方法通过超大规模计算是发现新基因的重要手段，可以说大部分新基因是靠理论方法预测出来的。比如啤酒酵母完整基因组（约1300万bp）所包含6千多个基因，大约60％是通过信息分析得到的。 当人类基因找到之后，自然要解决的问题是：不同人种间基因有什么差别；正常人和病人基因又有什么差别。”这就是通常所说的SNPs（单核苷酸多态性）。构建SNPs及其相关数据库是基因组研究走向应用的重要步骤。1998年国际已开展了以EST为主发现新Spps 的研究。在我国开展中华民族SNPs研究也是至重要的。总之，生物信息学不仅将赋予人们各种基础研究的重要成果，也会带来巨大的经济效益和社会效益。在未来的几年中DNA 序列数据将以意想不到的速度增长，这更离不开利用生物信息学进行各类数据的分析和解释，研制有效利用和管理数据新工具。生物信息学在功能基因组学同样具有重要的应用目前应用最多的是同源序列比较、模式识别以及蛋白结构预测。所谓同源序列，是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列。利用数据库搜索找出未知核酸或蛋白的同源序列，是序列分析的基础[lol。如利用BLASTn和BLASTx两种软件分别进行核苷酸和氨基
第七章土壤微生物区系分析 (92) 第一节一般土壤微生物的分离与计数 (92) 一、稀释平板法 (92) 二、MPN稀释法 (94) 三、土粒法 (96) 第二节厌氧微生物的分离 (96) 一、充氮厌氧培养法 (96) 二、焦性没食子酸吸氧法 (97) 三、专性厌氧细菌的分离法 (98) 第三节土壤主要类群微生物的分离与计数 (99) 一、好氧细菌的分离与计数 (99) 二、丝状真菌的分离与计数 (100) 三、放线菌的分离与计数 (100) 第四节土壤中功能微生物的测定 (101) 一、氨化细菌的测定 (101) 二、硝化细菌的测定 (102) 三、反硝化细菌的测定 (104) 四、好氧性自生固氮细菌的测定 (105) 十一、纤维分解菌的测定 (106) 十二、光合细菌的测定 (108) 十三、甲烷产生菌的测定 (109) 十四、有机污染物降解菌的测定 (110) 十五、重金属抗性菌的测定 (111) 第八章根圈微生物分析 (111) 第一节根圈细菌的分析 (112) 一、根圈的分区 (112) 二、根圈细菌的分离 (112) 三、根圈优势菌株的分群 (114) 第二节植物组织内微生物的分离 (115) 一、植物材料的选择 (116) 二、组织表面消毒 (116) 三、分离方法 (117) 第十五章土壤微生物生物量的测定 (119) 第一节土壤样品采集与预处理 (119) 第二节土壤微生物生物量碳分析 (120) 一、熏蒸提取——容量分析法 (120) 第三节土壤微生物生物量氮分析 (124) 一、熏蒸提取——全氮测定法 (125) 二、熏蒸提取——茚三酮比色法 (127)
一、名词解释 1. 生物信息学： 1）生物信息学包含了生物信息的获取、处理、分析、和解释等在内的一门交叉学科； 2）它综合运用了数学、计算机学和生物学的各种工具来进行研究； 3）目的在于阐明大量生物学数据所包含的生物学意义。 2. BLAST（Basic Local Alignment Search Tool） 直译：基本局部排比搜索工具 意译：基于局部序列排比的常用数据库搜索工具 含义：蛋白质和核酸序列数据库搜索软件系统及相关数据库 3. PSI-BLAST：是一种迭代的搜索方法，可以提高BLAST和FASTA的相似序列发现率。 4. 一致序列：这些序列是指把多序列联配的信息压缩至单条序列，主要的缺点是除了在特 定位置最常见的残基之外，它们不能表示任何概率信息。 5. HMM 隐马尔可夫模型：一种统计模型，它考虑有关匹配、错配和间隔的所有可能的组合 来生成一组序列排列。（课件定义）是蛋白质结构域家族序列的一种严格的统计模型，包括序列的匹配，插入和缺失状态，并根据每种状态的概率分布和状态间的相互转换来生成蛋白质序列。 6. 信息位点：由位点产生的突变数目把其中的一课树与其他树区分开的位点。 7. 非信息位点：对于最大简约法来说没有意义的点。 8. 标度树：分支长度与相邻节点对的差异程度成正比的树。 9. 非标度树：只表示亲缘关系无差异程度信息。 10. 有根树：单一的节点能指派为共同的祖先，从祖先节点只有唯一的路径历经进化到达其 他任何节点。 11. 无根树：只表明节点间的关系，无进化发生方向的信息，通过引入外群或外部参考物种， 可以在无根树中指派根节点。 12. 注释：指从原始序列数据中获得有用的生物学信息。这主要是指在基因组DNA中寻找基 因和其他功能元件（结构注释），并给出这些序列的功能（功能注释）。 13. 聚类分析：一种通过将相似的数据划分到特定的组中以简化大规模数据集的方法。 14. 无监督分析法：这种方法没有内建的分类标准，组的数目和类型只决定于所使用的算法 和数据本身的分析方法。 15. 有监督分析法：这种方法引入某些形式的分类系统，从而将表达模式分配到一个或多个 预定义的类目中。 16. 微阵列芯片：将探针有规律地排列固定于载体上，与标记荧光分子的样品进行杂交，通 过扫描仪扫描对荧光信号的强度进行检测，从而迅速得出所要的信息。 17. 虚拟消化：是基于已知蛋白序列和切断酶的特异性的情况下进行的理论酶切（课件定 义）。是在已知蛋白质序列和蛋白外切酶之类切断试剂的已知特异性的基础上，由计算机进行的一种理论上的蛋白裂解反应。 18. 质谱(MS)是一种准确测定真空中离子的分子质量/电荷比(m/z)的方法，从而使分子质量 的准确确定成为可能。 19. 分子途径是指一组连续起作用以达到共同目标的蛋白质。 20. 虚拟细胞：一种建模手段，把细胞定义为许多结构，分子，反应和物质流的集合体。 21. 先导化合物：是指具有一定药理活性的、可通过结构改造来优化其药理特性而可能导致 药物发现的特殊化合物。就是利用计算机在含有大量化合物三维结构的数据库中，搜索能与生物大分子靶点匹配的化合物，或者搜索能与结合药效团相符的化合物，又称原型物，简称先导物，是通过各种途径或方法得到的具有生物活性的化学结构
核酸和蛋白质序列分析 蛋白质, 核酸, 序列 关键词：核酸序列蛋白质序列分析软 件 在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信息，从而指导进一步的实验研究。通过染色体定位分析、内含子／外显子分析、ORF分析、表达谱分析等，能够阐明基因的基本信息。通过启动子预测、CpG岛分析和转录因子分析等，识别调控区的顺式作用元件，可以为基因的调控研究提供基础。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白，这对确定实验研究方向有重要的参考意义。此外，通过相似性搜索、功能位点分析、结构分析、查询基因表达谱聚簇数据库、基因敲除数据库、基因组上下游邻居等，尽量挖掘网络数据库中的信息，可以对基因功能作出推论。上述技术路线可为其它类似分子的生物信息学分析提供借鉴。本路线图及推荐网址已建立超级链接，放在北京大学人类疾病基因研究中心网站（https://www.doczj.com/doc/5210686431.html,/science/bioinfomatics.htm）,可以直接点击进入检索网站。 下面介绍其中一些基本分析。值得注意的是，在对序列进行分析时，首先应当明确序列的性质,是mRNA序列还是基因组序列？是计算机拼接得到还是经过PCR扩增测序得到？是原核生物还是真核生物？这些决定了分析方法的选择和分析结果的解释。 （一）核酸序列分析 1、双序列比对（pairwise alignment） 双序列比对是指比较两条序列的相似性和寻找相似碱基及氨基酸的对应位置，它是用计算机进行序列分析的强大工具，分为全局比对和局部比对两类，各以Needleman-Wunsch 算法和Smith-Waterman算法为代表。由于这些算法都是启发式（heuristic）的算法，因此并没有最优值。根据比对的需要，选用适当的比对工具，在比对时适当调整空格罚分（gap penalty）和空格延伸罚分（gap extension penalty），以获得更优的比对。 除了利用BLAST、FASTA等局部比对工具进行序列对数据库的搜索外，我们还推荐使用EMBOSS软件包中的Needle软件（http://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/），和Pairwise BLAST （https://www.doczj.com/doc/5210686431.html,/BLAST/）。以上介绍的这些双序列比对工具的使用都比较简单，一般输入所比较的序列即可。 （1）BLAST和FASTA FASTA（https://www.doczj.com/doc/5210686431.html,/fasta33/）和BLAST （https://www.doczj.com/doc/5210686431.html,/BLAST/）是目前运用较为广泛的相似性搜索工具。这两
第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，
用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不 可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算