一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述
近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或
APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM ）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
1.流式细胞仪诊断白血病的依据
⑴ FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达
⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。
⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现岀与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。
2.流式细胞仪诊断白血病的意义
⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国
际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL ）或急性未分
化白血病（AUL ）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。
⑵ 临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不
好。
⑶ 疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。
二、免疫分型常用的免疫标志及其意义
1?白血病系列分化抗原
T淋巴细胞白血病：CD3 CD5 CD7。
B淋巴细胞白血病：CD10 CD19 CD22
NK淋巴细胞白血病：CD16 CD56 CD57。
髓系白血病：CD13 CD14 CD33 MPO（髓过氧化物酶）。
红白血病：GlyA （血型糖蛋白A）o
巨核细胞白血病：CD41 CD42 CD61o
2?白血病系列非特异性抗原
CD34 HLA— DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34^、HLA- DF^、CD38-，原始细胞CD34^、HLA- DR+、CD38^，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34 —、HLA- DR-、CD38^o
3?白血病分化阶段抗原
T纟田胞抗原CD4 CD8
B细胞抗原：CD10 Cy g（胞浆卩链）、SmIg （表面膜免疫球蛋白）、CD38和Cylg （胞浆免疫球蛋白）、CD11C
4?白细胞共同抗原
CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts ）依次减弱。红细胞(中，晚幼红细胞，成熟红细胞)不表达CD45用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，
经FSC SSC McAbl-FITC、McAb2-PE CD45PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
三、白血病及淋巴瘤免疫分型
1.AML
MO有低的SSC和FSG在CD45- SSC?上出现在淋巴细胞位置上，至少表达一个特异性标志如CD13或CD116 但MPO 比CD13与CD33更灵敏。一般淋系标志阴性，但也可表达CD7或CD4 一般HLA- DR CD34阳性，
有些研究表明CD7与CD34共表达在AML且预后差。
M1:流式上M1与M0相似不易区分，M1一般CD13^、CD3升、HLA- DR-，但CD34表达少于M0,可能表达部分CD15 M2 M0与M1的主要区别是成熟度增加，blasts减少，CD15较M1较显著，CD34弱于M1, CD13有时表达
强于CD33多数病例HLA- DR( - )。CD45-SSC图显示从髓系blast区至成熟骨髓细胞区的连续细胞带，CD45-SSC
图有助于确定blasts 比例。
M3高颗粒性，具较高的SSC,但CD45较成熟C少，多数情况HLA- DR(-)或表达减少，CD34少于M2、一般CD13弱( + ),可有CD2表达。
M4与M5:两型表型相似，但M4较M5表达更多的CD34( + )，较之M0 M1, M4与M5有更大的FSS和SSC CD45- SSC 图上，成熟C出现在单核区，重要的表型为CD13 CD33 HLA- DR CD14和CD15 CD33可表达
强于CD13 CD33( + )、CD13( — )、CD34(-)很可能为M5,但只出现在少数病人中，部分M5可见CD56 (+ )。
M6 M6较少见且特征不明显，一般HLA- DR CD34 CD13 CD33阳性，CD45- SSC图显示主要为红系成份。
M7 巨核细胞白血病，在AML中少于1%。一般CD61(GpHa)和/或CD41 (GpII b -山a)阳性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假阳性，可以用流式双色分析在EDTA存在下，测GpIIb/山a与CD34以减少激活血小板的粘附。
2.ALL:
ALL是儿童中最常见的恶性肿瘤，约占全部肿瘤的25%，在成人，ALL约占急性白血病的25%，我们将ALL
分为B祖细胞型，CD1X或CD10-，前B细胞型，B细胞型，T细胞型。
B祖细胞型ALL:
在幼儿约占ALL的65%?70%，青少年为55%?60%，成人为50%。在儿童，约90%病例CD1X，在幼儿只有少于50%病例CD1X, blasts —般FSC SSC很艮少，是FAB标准的L1或L2, 一般TdT(+)HLA-DR(+), CD19(+)，此型又分为2个亚型，CD1W和CD10-，前者预后好，多数病例CD2外，CD34^, CD20表达随成熟度增加而增加，B祖细胞被定义为sIg-。
前B细胞型ALL:
此亚型约占儿童ALL的25%，细胞一般为CD19^, CD24 HLA- DR+,胞浆CD2甘，CD1X, TdT随CD20 变化，CD34多为阴性，前B亚型被认为比B祖型预后更差，这与t(1 ; 19)出现相关并由此产生E2A- PBX1 融合蛋白，它的表型为CD19^、CD1X、CD9+，不同程度CD20表达，CD34-，确认此表型有助于诊断基因上不确定的病例。
B细胞型ALL:
成熟B细胞型ALL约占ALL2%?5 %,B细胞型ALL较之B祖细胞型ALL有更大的FSC和SSC在CD45- SSC 图上出现在淋巴和单核细胞区域，即FAB标准的L3，表型为CD19 CD20 CD22 CD24且sIg (多数为IGM)
多数病例CD1X。但成熟抗原及sIg使之区别于更早的B系ALL,极少数成熟B细胞ALL无FAB- L3形态。
T—ALL:多数病例有大的FSG SSC在CD45- SSC图上可能出现在淋系未成熟细胞和髓系未成熟细胞或单核细胞区，多数表现为胸腺亚型，最常见亚型为皮质晚期表达，CD1 CD2 CD5 CD7 CD4/ CD8双阳与极
少膜表面CD3 TdT多为阳性。另一常见亚型为皮质早期表达CD2 CD5 CD7 TdT强表达。髓质期亚型表
达CD2 CD5 CD7与CD3^ CD好/CD3+CD8+,彳艮少见TdT表达。前T纟田胞亚型，表达CD7胞浆CD肝且无其它T细胞抗原，T细胞肿瘤的特征是丧失T细胞抗原而表现出其它异常抗原组合。
杂合型白血病：
随着流式技术的广泛应用，我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系，真正的双表型病人多为t（9 ; 22）或（11q23），现在杂合型的误诊率很高。最常导致误诊的原因是在分析中未能排除非白细胞，过度强
调弱的非特异性结合，忽略了某些抗体缺乏系特异性，最重要的系特异性抗原在B系、T系、髓系分别为
CD22 CD3和MPQ
3.CML
由于慢性期显著的细胞分化，在CD45- SSC图上除了髓系细胞占主导外，只显示一个正常骨髓像，CML可
确诊，CML起病与发展相对缓慢，慢性期的持续1年左右最终发展为加速期和急变期。流式细胞技术对急
变期亚型的诊断具有极高价值。直接影响到治疗效果。
急变期CML主要表现为髓系，偶为淋系，髓性急变可表现岀多种形态包括未分化细胞。淋性急变具典型形态特征，为CD10+ B祖细胞ALL极少有T细胞型ALL。
4.CLL:
CLL细胞主要为较正常淋巴细胞稍大的小淋巴细胞。免疫分型主要为：SlgM、SlgD弱表达，B系抗原为CD19
CD20 CD43 CD79a与CD5共表达，CD23表达使得CLL区另U于帽细胞淋巴癌MU即（CLL: CD2升，MCL CD23-），CD10-、CD23-、CD11c和CD25 CD20常弱表达，尽管CLL起病慢，但CLL病人的生存率变化很大，有染色体异常的病预后不良，最常见的三联体trisony12 、14q、13q、11q，免疫表型上没有特异的
变化而免疫表型的变化并不是提示染色体异常。最近，有研究表明，三联体trisony12 与Sig、CD20表达
量高度相关，与CD23-相关与FMC7相关。
B型前淋巴细胞白血病（B— DLL）较CLL更为严重，流式细胞技术在区分B—DLL和CLL上发挥很大作用，B— DLL多为CD5-，CD2甘，表达更强的sig。
MU病人平均生存率不超过5年，与CLL在形态上很难区分，与CLL相似有CD5+ B祖细胞，但Sig表达强于CLL，且CD22-O
另一与CLL难于区分的是FCC,细胞为强Sig、CD5-、CD1X、CD2升，具B系表型：对于诊断为CLL，CD5 FMC7
CD22与Sig，CD20异常强表表达的病例我们要考虑是否为DLL、MCC或CLL的亚型（trisomy12 ）因为它们危险性更大。
四、流式细胞仪免疫分型实验
1 ?样本采集、运输、保存和操作
⑴样本类型：适用于多种临床标本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、淋巴样组织活检物、浆液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。
⑵抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA ACD或肝素抗凝。如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分
析，则应用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他体液用EDTA ACD或肝素均可，但保存的样本活性可能会
降低，EDTA的优点是成熟髓性细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快；由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD做骨髓穿刺抗凝剂。（3）样本的保存：样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度息息相关。
①理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。
②短期保存(1小时或更短)应在室温(18- 22'C);
③长时间保存血或骨髓标本室温即可，有些样本可能4C为佳。
④标本保存的时间上限取决于标本类型及其保存条件。
⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时；
⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12 —24小时。
⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小时，但
⑧对于只做胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。但?quot;固定-染色"的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要进行新鲜标本的对照和验证实验。
2 ?样本制备
⑴单细胞悬液的制备
①血和骨髓：天然单细胞悬液。当有血凝块时，应用50u m尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断
靶细胞群体是否仍然存在。
②组织块：机械分离和酶分离两种方法。分离不仅是要获得最大产量的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性。大多数淋巴样组织可用轻柔的机械方法快速分离，并保持收获细胞的相对完整。某些组织由于细胞间连接紧密，需在机械分离的基础上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要确认酶的使用没有改变、减弱靶抗原的表达，细胞活性没有显著降低。
⑵分离靶细胞群体
样本的任何处理方式都可能导致靶细胞群体的丢失。所以应尽可能使用最接近原始标本状态的处理过程。去除红细胞是流式分析要求的至少步骤。两种方法：
①红细胞裂解：较佳。操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。溶血剂的选择应基于其选择
性去除成熟红细胞而最小程度的影响其他细胞的特点。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需确认：抗原性不被溶血过程改变；溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；所用溶血剂不含固定
剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。
②度梯度离心：白血病细胞回收较好并可能得到富集，同时去除死细胞。但费时，白血病细胞的相对频率较难分析，某些重要细胞群体可能选择性丢失。根据密度梯度原理，若白血病细胞没有与淋巴细胞相似的浮力密度即可能丢失。所以用此方法时应检查各层细胞特性以防止靶细胞的丢失。
⑶估细胞悬液
①样本外观：有严重溶血和血凝块的标本可能会有白细胞的损坏以及细胞亚群的丢失或改变，应弃用。
②细胞丢失和分布：确认细胞形态和原始标本相似。密度梯度离心之后更应检查细胞分布。可做血涂片判断。
③细胞计数和浓度调整：厂家推荐的抗体浓度通常是假定靶细胞数量在正常范围内(500,000-1,000,000 /testAb)。白细胞数量上的显著变化会带来染色模式的变化。而白血病标本常常有异常的白细胞数量，骨髓标本也可能被外周血稀释，这些标本的细胞性可能有极大的变异。因此有些标本没有足够的细胞做流式分析，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对不足，不能饱和所有的结合位点，导致假阳性结果。
所以染色前的细胞计数非常必要。推荐方法：WBC<1000/uL:用200uL全血并调整相应溶血剂用量；
WBC:1000-10000/uL,用100uL全血并用溶血剂标准量；WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并调整相应溶
血剂用量；WBC>20000/uL，用稀释至⑵(3)范围内。骨髓标本常常要在PBS1:10稀释后计数。应该指出，由于不同的标本中不同系列的细胞比例不同，调整细胞总数不一定合适每一个系列特异的抗体。实验室若选择不同于厂家推荐的方法(如自己稀释抗体)，抗体一定需要进行测试以得到抗体和细胞的最佳比率。
④细胞活性：死细胞对许多抗体有非特异性染色，有些抗原同时存在于胞膜和胞浆，这就使样本的细胞活性检测变得重要，尤其毖匚揪顺肚奔涞脑耸浜痛4.妫匚蚨匝镜闹谱輔一滩惶一宄薄V觳獾姆椒《
口S辛街郑阂皇鞘凳钡牧魇郊觳猓豪糜馊玖螾I、7-AAD或EMA（ ethidium monoacide ）。活细胞将拒
染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行，通过设门即可得到活细胞的染色特性。
尤其适用于高度坏死的样本。样本染色后需固定。应在加固定剂之前洗去多余的7AAD,以保证区分的是固
定前细胞的死活状态。但随着时间延长，7AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变难。对于
染色后常规固定并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证
了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。二是手工检测：使用Trypan blue 或其他细胞活性染料。
⑷细胞染色
①细胞表面染色：大多数可帮助白血病免疫分型的抗原都在细胞膜上。但由于许多抗原也同时存在细胞内，
所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。例如免疫球蛋白重链在细胞内和表面的存在有着不同的意义，检测表面标记必须是未固定的活细胞。
②细胞内染色：有些胞内特异性抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT, MPO,cCD3, cCD22,以
及胞浆内lg的表达。胞内染色的关键是使细胞膜通透，把抗体导入胞浆而不影响细胞结构的完整性。要保证固定和透膜的步骤不影响有关标记的抗原性以及和抗体的结合。③胞膜和胞内的同时染色：通常，先胞
膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。固定剂和通透剂都可能对细胞和参数有不同的多重
影响，应根据情况选择。每一步染色对荧光素的选择和抗体的选择都很重要。如，用于表面标记的荧光素应不被随后的固定和通透步骤所影响，而对于胞内染色，所用的荧光素应足够小能穿透到胞膜内。
3.抗体组合的确定：
选择抗体组合的技术性考虑：基于血液肿瘤的复杂性，提供一个通用的抗体选择策略是不现实的。国际上迄今也没有一致性的抗体组合。应该意识到，没有一个神奇的既小又功能齐全的抗体组合可以解决所有的临床相关答案。一个局限性的小组合也可能影响对样本的正确评估和分类。确认细胞异常的能力与所用抗体的数量直接成正比。
⑴选择抗体组合的基本原则如下：
1）所选的抗体组合应足够宽，可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。抗体的数量越多，检测的灵敏度越高。应该指岀，由于肿瘤细胞常常缺少细胞的正常标记或表达异常，所以特异性抗体一定程度上的重复选择有时是必要的。
2）抗体的选择应可以区分正常和异常细胞，正常细胞可作为实验的内参照，异常细胞的表达比例也更准确。如现在用CD45抗体来区分正常和幼稚细胞，此方法尤其在幼稚细胞含量少时更显优势。
3）荧光强度和表位密度应同时考虑。对表达少的抗原表位应尽可能选择强度强的荧光素。
4）必要时用活性检测排除死细胞较强的非特异性染色。国外统计，约70%组织样本和48%血或骨髓标本有活性检测结果。
5）实验人员应了解所用抗体的反应细胞谱，以及与特定荧光素结合后的染色模式。相同的CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式。
⑵常用的方案考虑：大而全的抗体组合：全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但费用高。先用筛查试
剂了解样本的一般情况，再根据所得信息采用第二线特异性更高的抗体组。经济，但费时，也需要正确的抗体选择的策略性决定。但考虑到所用时间和设备费用，只有约30%国外实验室采用此法。基于临床或形
态学的资料，选用有目标性的抗体组合以确认可疑的诊断或分类。
4.样本获取
通常，每个标本应获取1-2x104个有核细胞的荧光和散射光信号，微小残余病变分析则需5x104个细胞。
恶性细胞常有较宽的大小和粒度范围，获取时最好收集无门的数据以保留所有未知异常细胞群体的所有特
性。免疫荧光信号要求对数放大和至少256道的分辨率。无论选择对数或线性放大都要以保证异常细胞都
能被检测到。
5.数据分析
只有通过多参数分析，才能最大程度地区分异质的样本中的正常和异常细胞。多参数分析意味着综合细胞的光散射和
【全科临床论著】 218例急性白血病流式细胞术免疫表型分析 赵皓,余晾,吕合作,郑宏波,项平 【摘 要】 目的 研究急性白血病(AL)免疫表型特征及诊断价值。方法 采用流式细胞术(FC M)对218例初诊急性 白血病患者进行免疫分型。结果 急性髓系白血病(AML)患者均表达两种以上髓系抗原,其中部分伴有淋系抗原 (C D7)表达。急性淋系白血病(ALL)患者均表达淋系抗原,部分表达一种或两种髓系抗原。14例混合型白血病同时表 达两种以上淋系和髓系抗原标志。4例慢粒急淋变既表达髓系抗原又表达淋系抗原。结论 FC M免疫分型是在细胞形 态学和细胞化学染色基础上对急性白血病诊断与分型的重要补充。 【关键词】 急性白血病;免疫表型;流式细胞术 【中图分类号】 R733.7 R446.63 【文献标识码】 A 【文章编号】 167424152(2010)1021239202 Ana lysis of Imm unophenotype in218Ca ses w ith Acute L eukem i a by Flow Cyto m etry ZHAO Hao,YU L iang,LV He2zuo, et al.Central L aboratory,the First A ffiliated Hospital of B engbu M edical College,B engbu233004,A nhui,China 【Abstract】O bjecti ve To exp l ore the acute Leukem ia i m munophenotype and its diagnosis value.M ethods A ssay the i m mune phenotype in218patients with acute leuke m ia by fl ow cyt ometer.Results The patients with acute myel oid leukem ia(AML)ex2 p ressed more than t w o kinds of myel oid antigens;part of the m exp ressed ly mphatic antigens(CD7).The patients with acute ly m2 phoblastic leuke m ia(ALL)exp ressed ly mphatic antigens;part of them exp ressed one or t w o kinds of myel oid antigens.Fourteen patients with m ixed acute leuke m ia(MAL)showed t w o kinds or more ly mphoid and myel oid antigens.Four patients with chr onic granular differentiated t o acute ly mphatic leukem ia not only exp ressed myel oid antigens but als o exp ressed ly mphatic antigens. Conclusi on The i m munophenotype by fl ow cyt ometry is the i m portant supp lementary t o acute leuke m ia diagnosis and typ ing in mor phol ogy and cyt oche m ical dyeing foundati on. 【Key words】 Acute leuke m ia;I m munophenotype;Fl ow cyt ometry 白血病细胞是一种高度异源性、异质性并具有一定增殖活力的恶性细胞。传统的F AB(法国、美国和英国形态学标准)分型是在细胞形态学和细胞化学染色基础上进行的,对急性白血病诊断与分型有其局限性。流式细胞术(Fl ow cyt ometry,M)是根据白血病细胞表面和胞内的特异性抗原,采用单克隆抗体对白血病细胞的来源和分化阶段进行更精细的检测和判断,从而弥补F AB分型的不足,对确定诊断、选择治疗方案和判断预后具有重要意义[1]。本文采用FC M对218例AL患者进行免疫表型分析,现将结果报告如下。 1 资料与方法 111 临床资料 218例患者为我院2008年10月-2010年2月血液科住院患者,年龄10～79岁,男性132例,女性86例。112 研究方法 1.2.1 取材 E DT A2K2抗凝骨髓或血液标本1m l。 1.2.2 仪器与试剂 F ACSCalibur流式细胞仪,购自BD公司。单克隆抗体:F I T C标记的CD2、C D33、HLA2DR、C D15、CD10,PE 标记的CD7、C D13、C D34、C D11b、C D19,Per CP标记的CD45, APC标记的CD5、CD14、CD20、C D45,同型对照I gG1/I gG2a以及混合抗体CD3/M P O/CD79a,透膜剂F I X&PER M及溶血素,以上试剂均购自BD公司,鞘液为自配的P BS缓冲液。 1.2.3 试验方法 表面标志染色:在各试管中分别加入E D2 T A2K2抗凝骨髓或血液50μl,按表1中的抗体组合分别加入相应的抗体或同型对照(F I TC、PE及PercP标记的抗体为30μl, APC标记的抗体为5μl)室温避光孵育15m in,分别加1000μl 溶血素,室温避光孵育10m in,离心去上清,P BS洗涤细胞一次,去上清,加入0.5m l P BS重悬细胞,上机检测。胞内标志染色:先用CD452APC同上进行表面染色、溶血、洗涤,然后加200μl 作者单位:233004安徽省蚌埠医学院第一附属医院中心实验室 通讯作者:赵皓,电子信箱:icecool1980@https://www.doczj.com/doc/5210181770.html, 固定液室温固定细胞15m in,P BS洗涤细胞一次,去上清,加200μl透膜液及胞内染色抗体或同型对照30μl,室温避光孵育10m in,离心去上清,P BS洗涤细胞一次,去上清,加入0.5m l P BS重悬细胞,上机检测。检测结果采用Cell Q uest软件进行分析:首先,在FSC/SSC散点图中,根据细胞大小和颗粒度进行设门选中有核细胞群体;然后,在C D45/SS C散点图中,根据CD45表达强度和颗粒度,对有核细胞进行设门,选中幼稚细胞群体;最后,再对幼稚细胞群体进行分析,确定各种标志的阳性率。判断阳性的标准为:胞内染色标志CD3/M P O/CD79a>10%,其他表面标志>20%。 表1 AL流式细胞术免疫分型抗体组合 抗体A1A2A3A4A5A6B1B2 F I TC I gG1CD2CD33DR CD15CD10I gG1CD3 PE I gG2a CD7CD13CD34CD11b CD19I gG2a MP O Per Cp CD45CD45CD45CD45CD45CD45-CD79a APC I gG1CD5--CD14CD20CD45CD45 2 结果 119例经临床确诊的AML各种抗原表达的阳性率依次为M P O(95.80%)、C D13(90.76%)、C D33(81.51%)、HLA2DR (73.95%)、CD34(54.62%)、CD15(30.25%)、C D11b (22.69%)、CD14(10.92%),其中有19例AML患者伴有淋系抗原C D7的表达。 经临床确诊为ALL的83例患者中,经FC M免疫分型,有21例为T系ALL,各种抗原表达的阳性率依次为CD3 (100.00%)、C D7(100.00%)、CD2(90.48%)、CD5(85.71%)、HLA2DR(61.90%)、C D34(42.86%),其中有4例患者伴有CD13等髓系抗原的表达;有62例为B系ALL,各种抗原表达的阳性率依次为CD79a(100.00%)、CD19(93.55%)、CD20 (82.26%)、C D10(69.35%)、HLA2DR(83.87%)、CD34 (69.35%),其中有5例患者伴有CD13等髓系抗原的表达。
中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(完整版) 成人急性淋巴细胞白血病(ALL)是最常见的成人急性白血病之一，约占成人急性白血病的20%~ 30%，目前国际上有比较统一的诊断标准和不同研究组报道的系统治疗方案，完全缓解(CR)率可达70%~90%，3~5年无病生存(DFS)率达30%~60%[1]；美国癌症综合网(NCCN)于2012年首次公布了ALL的诊断治疗指南，我国于2012年发表我国第1版成人ALL 诊断与治疗的专家共识[2]，得到了国内同行的认可。最近2016版WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类[3]发表，对于ALL的分类有一些更新，提出了一些新概念；NCCN对于成人ALL的临床指南也先后几次修改[4]。基于此，对我国成人ALL诊断与治疗的专家共识进行了更新。 一、诊断分型 (一)概述 ALL诊断应采用MICM(形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学)诊断模式[5]，诊断分型采用WHO 2016标准。最低标准应进行细胞形态学、免疫表型检查，以保证诊断的可靠性；骨髓中原始／幼稚淋巴细胞比例≥20％才可以诊断ALL；免疫分型应采用多参数流式细胞术，最低诊断分型可以参考1995年欧洲白血病免疫学分型协作组(EGIL)标准(表1)[6]，疾病分型参照WHO 2016版分类标准[3]。同时应除外混合表型急性白血病，混合表型急性白血病的系列确定建议参照WHO 2008造血及淋巴组织肿瘤分类的标准(表2)，可以同时参考1998 EGIL标准(表3)[7]。
表1 急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫学分型(EGIL，1995) 表2 混合表型急性白血病的WHO 2008诊断标准 表3 双表型急性白血病的诊断积分系统(EGIL, 1998)
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义 1．白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 2．白血病系列非特异性抗原 CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。 3．白血病分化阶段抗原 T细胞抗原CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。 4．白细胞共同抗原 CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 急性白血病的诊断与分型4 急性白血病的诊断与分型 4 ㈩病理形态学骨髓病理活检可较全面地了解骨髓造血的情况，可弥补骨髓穿刺局限性的不足，尤其是对骨髓增生极度活跃或增生减低，骨髓脂肪化、纤维化或合并骨髓坏死等情况下更适合做病理检查。 骨髓活检病理检查已作为急性白血病诊断中的一个重要指标。 三.急性白血病的分型 1975～1976 年，法国、美国、英国的 7 位血液学者在伦敦、巴黎先后观察了大量的血及骨髓标本，讨论并制订了急性白血病分型方案，称为 FAB分型。 他们将急性白血病分为淋巴细胞型和非淋巴细胞型(髓细胞白血病)，前者可分为 L1、L2、L3，后者可分为 M1～M6。 后又经多次修改及补充，1985 年又将急性巨核细胞白血病划为M7，1991 年又提出急性髓细胞白血病未分化型(M0)。 FAB 分型方法已被国外广泛采用。 我国在 1978 年南宁的全国血液学会议上提出了关于白血病分型的建议，同年 12 月在广州召开的中华内科学会会议上又进行了修改。 1986年 9 月在天津会议上又对 ANLL 的分型进行了认真的修改补充，以使国内的诊断标准尽可能地与国外的 FAB 分型相吻合。 目前，急性白血病的 FAB 分型还在不断补充、修改、完善。 分型新的发展会对急性白血病的治疗、预后和生物学特性的研究 1 / 20
有更大的推动。 ⒈按白血病细胞系可分为淋巴细胞型及非淋巴细胞型(髓细胞型)。 ⒉急性白血病的亚型急性淋巴细胞白血病可分 L1、L2、L3 3 型。 急性非淋巴细胞白血病可分为 8 个亚型： 即急性粒细胞白血病未分化型(M0)、急性粒细胞白血病未成熟型(M1)、急性粒细胞白血病部分成熟型(M2a、M2b)、急性颗粒增多的早幼粒细胞白血病(M3a、M3b)、急性粒-单核细胞白血病(M4a、M4b、M4c、M4E0)、急性单核细胞白血病(M5a、M5b)、急性红白血病(M6)、急性巨核细胞白血病(M7)。 ⒊特殊类型的白血病低增生性急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病急性变、浆细胞白血病、嗜酸粒细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病、组织嗜碱细胞白血病、成人 T 细胞白血病等、急性白血病未分化型、急性混合细胞白血病。 ⒋急性白血病各亚型的具体标准⑴急性淋巴细胞白血病各亚型的特点： 见表 81-5。 表 81-5 急性淋巴细胞型白血病各亚型细胞特征项目细胞大小核染色质核形核仁 L1 小细胞为主较粗,结构一致规则偶有凹陷或折叠不见或小而不清楚 L2 L3 大细胞为主,可大小不一大细胞为主,大小一致较疏松,结构不一致
急性髓系白血病的免疫表型分析及临床 意义 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的探讨成人急性髓细胞白血病(AML)的免疫表型特征及临床意义。方法采用流式细胞仪对113例AML患者进行免疫表型分析。结果髓系抗原表达阳性率依次为CD13＞CD33＞CD15＞CD14，AML患者CD34阳性表达率为35.40％。113例患者中有28例(24.78％)伴有淋系抗原表达，以CD7多见，表达阳性率为71.43％，其次CD19表达阳性率为35.71％。Ly+AML与Ly－AML相比较，两者在个别形态学亚型、临床体征及CD34表达差异有统计学意义，而在异常染色体核型检出率方面无统计学意义。CD+34组CR率(69.23％)较其阴性组(78.05％)低，但两者差别无统计学意义；Ly+AML组CR 率为52.94％(9/17)，低于Ly－AML组78％(39/50)，其中，CD+7组CR率(41.67％)与其阴性组(80％)相比差别有统计学意义。结论 AML 患者高表达CD13、CD33，部分患者同时表达髓系、淋系抗原；CD34及CD7阳性与治疗反应显著相关。 【关键词】急性髓系白血病免疫表型骨髓细胞 随着系列单克隆抗体的应用，白血病细胞免疫分型的广泛开展，使白
血病得到正确的诊断和分型，而免疫标记结合FAB(法、美、英三国学者制定)形态学分型［1］，对急性髓系白血病(AML)各亚型的鉴别及特殊类型急性白血病(AL)的发现、指导治疗及判断预后有重大意义。本文对113例急性髓系白血病的免疫分型及临床特点进行分析，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 病例资料宁夏医科大学附属医院血液科2002—2007年间的住院初治AML患者113例，男58例，女55例，年龄14～76岁，中位年龄39岁。根据骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型而确诊。FAB分型：M04例，M114例，M230例，M318例，M49例，M528例，M65例，CML急变5例。 1.2 免疫表型分析受检者抽取骨髓或外周血经肝素抗凝，采用活细胞三色免疫荧光法标记，流式细胞仪检测(型号为FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司生产)，通过二维点图分析抗原表达情况；所用单克隆抗体均为美国BD公司产品。B淋巴细胞系单抗：CD10、CD19、CD20；T淋巴细胞系单抗：CD3、CD5、CD7；髓系单抗：CD13、CD14、CD15、CD33；造血干/祖细胞单抗：CD34。结果判定用Cell Quest 软件分析，CD45/SSC设计中的白血病细胞群表面标记检测阳性率≥20％判断为阳性。 1.3 细胞遗传学检查染色体标本采自治疗前骨髓，用直接培养法和24h短期培养法，按常规制备染色体并进行R显带染色分析20～30个中期分裂相，根据《人类细胞遗传学国际命名制(ISCN)》(1995)
免疫学分型的进展 人们识别白血病已有160多年的历史，在诊断分型上经历了五个阶段。第一阶段是肉眼观察，第二阶段是19世纪后期发明细胞染色技术，开始镜下分类诊断；第三阶段为自20世纪30年代后期相继建立起细胞化学染色技术，应用与白血病分型诊断，至20世纪80年代成 为FAB白血病分类分型的基础；第四阶段为在FAB分型细胞形态学和细胞化学的基础上应 用细胞免疫化学染色技术和细胞遗传学技术进行白血病分型诊断；第五阶段为最近十余年，应用分子生物学技术对白血病进行病理机制、诊断分型方面的深层次研究，使白血病的分类 分型诊断日臻完善，对此认识也不断深入。当前研究白血病分型趋向细胞形态学、细胞免疫学、细胞遗传学和分子生物学，简称MICM分型。但是由于白血病细胞具有异源性和异质 性的特点，用免疫学手段检测细胞表面分化抗原常有紊乱现象，而且它们尚未达到实用、普 及意义上的应用要求。因此，细胞形态学检验仍为当今最根本性的诊断手段，而理想的分类 便是以细胞形态学为基础，结合细胞免疫学、细胞遗传学和分子生物学提供的信息，或把新 技术作为临床诊断的辅助性手段，相互结合，进行综合判断，不断发现和认识每一个白血病 类型的异质性差异和临床之间的联系。因此细胞遗传学和分子生物学是当今研究探索白血病 本质极其重要的方法，对于形态学来说又是亟须充实的新学科知识。 造血细胞分化为成熟细胞过程中会出现一系列的免疫表型变化，白血病是造血细胞的 某一克隆被阻滞在某一分化阶段上并异常增殖的结果，故白血病细胞往往停滞在细胞分化的 某一抗原表达阶段，因此可以利用单克隆抗体检测相应白细胞表面抗原或胞质内的分化抗原 进行白血病类型、细胞发育阶段的鉴别，从而指导治疗，判断预后。 近来采用急性白血病的一线单抗来筛选急性髓系白血病及T、B淋巴系白血病，用二线单抗 进一步确定系内亚型。 ALL的免疫学亚型与FAB亚型之间除L3外，无相关性，有报道78%的B-ALL为L3型。 急淋免疫学分型不同，临床表现及预后有差异。 急性白血病免疫诊断标志 一线单抗二线单抗 髓系CD13、CD117 CD33、CD14、CD15、CD11、CD61 Anti-MPO CD41、CD42、血型糖蛋白A B淋巴系CD22浆、CD19、CD10、CD79a浆CD20、CD24、Cyμ、Smlg T淋巴系CD3浆、CD7、CD2 CD1、CD4、CD5、CD8 非系列特异性TdT核、HLA-DR CD34 筛选急性白血病的免疫标记 CD10 CD19 CD22c/m* TdT HLA-DR CD3c/m CD7 CD13 CD17 MPO B系-ALL + + +/—+ + —————T系-ALL ———+ —+/—+ ———AML ————+ ——+ + + 1.ALL免疫分型急性淋巴细胞白血病的免疫分型可分成三个阶段：1986年以前的五分法，1986~1994年的两大类七分法，1994年法国召开了国际白血病欧洲免疫学分型协作组（EGIL）提四型21类法。目前较常用将ALL分为T细胞系{占20%}和B细胞系（80%） 两大型，T细胞系ALL又分为两亚型：早T前体-ALL和T细胞ALL；也有将T-cell-ALL 分为三个亚型：I型幼稚胸腺细胞型、II型中间胸腺细胞型、III型成熟胸腺细胞型；B细胞
一、流式细胞仪在白血病免疫分型诊断的概述 近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流 式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列 及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、 表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分 化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进 一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的， 对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标 记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴 别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义 1．白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 2．白血病系列非特异性抗原 CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而 言，干/祖细胞CD34＋、HLA－D R＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼 稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－D R－、CD38＋。 3．白血病分化阶段抗原 T细胞抗原CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆
白血病分类和分型 保定第七医院肿瘤科穆铁军 时间：年月日时分 地点：肿瘤科医办室 参加人员： 白血病是造血系统的一种恶性疾病。其特征为一种或几种血细胞成分的自发性、进行性异常增殖，具有质和量改变的异常白细胞（白血病细胞）在骨髓和其他器官的广泛浸润，导致正常血细胞进行性减少，临床以贫血、出血、发热、白血病细胞浸润为主要表现。 白血病的治疗是根据不同类型选择不同治疗方案，故今日讲解白血病的分类分型。 分类 一、按自然病程及细胞的成熟度分类 （一）急性白血病起病急、病情重、自然病程一般在六个月以内。骨髓及外周血中主要为异常的原始细胞和早期幼稚细胞。 （二）慢性白血病起病缓、发展慢，病程一般一年以上，骨髓和外周血以较成熟的细胞占多数。 二、按细胞类型分类 分为淋巴细胞型、粒细胞型、单核细胞型及一些少见类型，如红白血病、巨核细胞型、浆细胞型、嗜酸细胞型、嗜硷细胞型白血病等。 三、按外周白细胞的多少分类 （一）白细胞增多性外周血中白细胞明显增多，并有较多幼稚细胞出现。 （二）白细胞不增多性外周血中白细胞不增多或甚至低于正常。血片中没有或较难找到幼稚细胞。 分型 一、急性白血病分型 急性白血病分为急性淋巴细胞性白血病（ALL）和急性非淋巴细胞性白血病（ANLL）两大类，结果如下： ①ANLL分为8个亚型：急性髓性白血病微分化型（M0）、粒细胞白血病未分化型（M1）、粒细胞白血病部分分化型（M2）、早幼粒细胞型（M3）、粒-单核细胞型（M4）、单核细胞型（M5）、红白血病（M6）、巨核细胞型（M7）； ②ALL分为三个亚型：FAB分型：L1、L2和L3型。
近年来又根据细胞的免疫学特点，ALL根据免疫表型不同可分为B-细胞和T-细胞两大类。2000WHO将急性淋巴细胞白血病（ALL）分为三种亚型：（1）前体B细胞急性淋巴细胞白血病（细胞遗传学亚型）：t（9；22）（q34；ql1），BCR/ABL；t（4；llq23），（MLL重排）；t（1；19）（q23；p13）；（E2A/PBX1）；t（12；21）（p12；q22），（ETV/CBFα）。（2）前体T细胞急性淋巴细胞白血病（T—ALL）。（3）Burkitt细胞白血病。FAB分型中的急淋形态学亚型分型方法，因可重复性较差，现已基本放弃，不再把急性淋巴细胞白血病分为L1、L2、L3。骨髓中幼稚细胞>25%时诊断采用ALL的名称，幼稚细胞≤25%称为母细胞淋巴瘤。我们这里介绍白血病的类型分类分型，主要是因为白血病治疗方式和治疗效果往往是根据病的类型而不同的。 二、慢性白血病分型 可分为：慢性淋巴细胞白血病(慢淋)；慢性粒细胞白血病(慢粒)；慢性粒－单核细胞白血病；单核细胞；红血病。 三、特殊类型白血病， 可分为：慢粒急变；低增生性；淋巴肉瘤；组织细胞肉瘤；浆细胞；多毛细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；组织嗜碱细胞；巨核细胞；未分化型急性白血病。
免疫细胞分型常见标志物大串烧（一）——T细胞分型标志物 免疫分型（immunophenotyping）是指根据存在于细胞表面、核或细胞质中的标记物或抗原的类型，利用基于抗体的对异质细胞群进行分析，以鉴定多种目标细胞群的存在及比例。通过使用特异性识别不同细胞类型标记物或抗原的抗体，从而帮助鉴定细胞的谱系。例如肿瘤标志物的检测、浸润免疫细胞的分析、白血病的诊断等。免疫分型可以利用组织切片(新鲜或固定组织)通过免疫组化方法以及利用细胞悬液通过流式细胞术进行分析。 流式细胞术可以说是用于探测人类免疫表型的首选技术，特别是由于它可以在诸如血液的复杂混合物中通过测量许多单个细胞上的多个参数，从而鉴定和分析包括稀有亚群在内的许多细胞亚群。并且由于可用的抗体试剂的扩大和实验方案的不断调整，流式细胞术不仅可用于评估细胞表面蛋白的表达，还可以用于评估胞内蛋白的表达或修饰水平以及细胞因子的水平。 使用细胞表面标记的特定组合对免疫细胞亚群进行定义是一个不断发展的过程，特别是那些高频研究的细胞类型。这些类型包括调节性T细胞(Treg)、分泌IL-17的T辅助细胞(Th17)、树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)。尽管新标记的发现和新的细胞子集将在未来一段时间内持续下去，然而，我们还是希望细胞免疫学领域具有足够的成熟程度，以达到对大多数共同研究的免疫细胞亚群的定义达成共识。换句话说，应当能够定义一种相对稳定的标记集合，其描绘T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和DC细胞等主要类型。因此，我们通过总结文献确定各个细胞类型的关键分化标记，并且总结目前用于人体免疫监测的标准化免疫表型分型组合。 T细胞 T淋巴细胞可在CD3表达的基础上被免疫表型化，随后进一步细分(如CD8+杀伤性T细胞和CD4+辅助性T细胞)。此外，T细胞表型是灵活的，可以随不同的微环境发生变化；表
急性白血病的分型 急性白血病可分为急性淋巴细胞白血病（急淋，ALL）和急性非淋巴细胞白血病（急非淋，ANLL）两大类。根据1985年修订的FAB分型标准，ANLL共分M1-M7等7型，他 们分别是： M1：未分化的原粒细胞白血病； M2：部分分化的原粒细胞白血病； M3：急性早幼粒细胞白血病； M4：急性粒、单核细胞白血病； M5：急性单核细胞白血病； M6：急性红血病或红白血病； M7：急性巨核细胞白血病。 ALL根据FAB形态学特点，则相应分为L1、L2、L3共3型。 L1型：原始淋巴细胞有均匀的圆形核、胞浆少； L2型：原始淋巴细胞变化较大，核可能不规则，胞浆较L1多； L3型：原始淋巴细胞有较细小的核染色质，胞浆为蓝色一深蓝色并有空泡形成。 急性白血病分型: (1)M0(急性髓系白血病微分化型)：骨髓原始细胞≥30%(NEC)，无嗜天青颗粒及Auer小体，电镜髓过氧化酶(MPO)阳性。 (2)M1(急性白粒细胞(lixibao)白血病未化型);原粒细胞(I+II 型)≥90%(NEC),此中至多有3%的原粒细胞(lixibao)过氧化酶或苏丹黑染色阳性，此型易累积骨膜，眼眶常见，表现为绿色瘤。 (3)M2(急性粒细胞性白血病部分分化化型)：原粒细胞(I+II占 型)30%-90%(NEC)，其他颗粒细胞>10%，单核细胞<20%; (4)M3(急性早幼粒细胞白血病);骨髓中以多颗粒早幼粒细胞为主，〉30% 。此型最易并发DIC (5)M4(急性粒-单核细胞白血病)：有下列多种情况。1)骨髓原始细 胞>30%(NEC)，各阶段粒细胞占30%--<80%,各阶段单核细胞，易牙龈增生肿胀。 (6)M5(急性单核细胞白血病)：又分为两种亚型。M5n：骨髓原单核细胞I+II 型≥80%(NEC)。M5b：骨髓原单核细胞I+II型《80%(NEC)，易牙龈增生肿胀。 (7)M6(红白血病)：骨髓幼红细胞系≥50%。 (8)M7(急性巨核细胞白血病)：骨髓原巨核细胞≥30%，
BD FACScanto ll白血病免疫分型六色试剂搭配六色试剂 第一管 CD7 FITC 340737 CD33 PE 347787 CD45 PerCP-CY5.5 340953 CD10 PE-CY7 341092 CD20 APC 340941 CD19 APC-CY7 348794 第二管 CD15 FITC 347423 CD11b 347557 CD45 PerCP-CY5.5 340953 CD34 PE-CY7 348791 CD56 APC 341025 HLA-DR APC-CY7 335796 第三管 CD2 FITC 347593 CD13 PE 347837 CD45 PerCP-CY5.5 340953 CD5 PE-CY7 348790 CD22 APC 340933
CD14 APC-CY7 333945 溶血素 349202 7 color setup beads 335775 流式上样管，无菌无盖125支/包 352052 6 color TBNK reagent kit 337166 第一管 CD7 FITC 340737 CD33 PE 347787 CD45 PerCP-CY5.5 340953 CD10 PE-CY7 341092 CD20 APC 340941 CD19 APC-CY7 348794 第二管 CD15 FITC 347423 CD11b 347557 CD45 PerCP-CY5.5 340953 CD34 PE-CY7 348791 CD56 APC 341025 HLA-DR APC-CY7 335796 第三管 CD2 FITC 347593
流式细胞仪在白血病免疫分型诊断 一、概述 近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义
流式细胞术免疫分型基础
免疫分型组成
系别相关标志 干/祖细胞：CD34，CD38，HLA-DR，TdT 髓系：CD33，CD13，CD15，CD11b，CD14，CD64，cMPO，CD117, CD11c, CD36 红系：CD71，glyA 巨核系：CD41，CD61 B 细胞：CD10，CD19，CD20，CD22，CD23，k，λ, cCD79a,cIgM, (CD5, CD11c, CD103, CD25, FMC7) T细胞：CD2，CD3，CD5，CD7，CD4/8，cCD3, TCR NK细胞：CD16，CD56，（CD3 -/CD56+） 浆细胞：CD138，CD38,c k，cλ
原始细胞（Blast） 早幼粒细胞（有颗粒原粒？）
髓系幼稚细胞 ?幼稚细胞包括原粒、原单、原始巨核、幼单。?异常单核不能算幼稚单核，在鉴别急性粒单细胞白血病、急性单核细胞白血病、慢性粒单细胞白血病中有重要作用。 ?小的异常增生巨核和微巨核不能算幼稚细胞。?在APL中，异常早幼粒也算幼稚细胞。 ?原红一般不计在内，除非罕见的急性纯红细胞白血病。
髓系幼稚细胞免疫标志 ?原粒、原单：CD34、CD117、HLA-DR、CD13、CD33、MPO+/- ?原始巨核:CD61、CD41a、CD9、CD36（不特异）?幼单：CD15dim、HLA-DRstr、CD64、CD11c、CD4dim、CD11b、CD33str、CD13、CD14-?APL：HLA-DR-、CD34-、CD117+、CD9+、 CD15-/+、CD33str、CD64+、CD13dim
急性白血病分型 一、急性非淋巴细胞白血病（ANLL） 1、微小分化急性髓系白血病（M0型）骨髓有核细胞增生程度较轻，原始细胞大于30%，可达90%以上，核圆形，核仁明显。胞质小，嗜碱性，无颗粒，无Auer小体。 2、急性原始粒细胞白血病未分化型（M1）骨髓增生极度活跃或明显活跃，少数病例可增生减低，骨髓中I型加II型原始粒细胞大于90%（NEC），可见小原粒细胞（胞体小，与淋巴细胞相似，胞似圆形，核染色质呈细颗粒状，较正常原粒细胞密集，核仁1－2个，有伪足）。 3、急性原始粒细胞白血病部分分化型（M2）骨髓增生极度活跃或明显活跃，骨髓原粒I型II型大于30%－90%，单核细胞小于20%，早幼以下各阶段大于10%，约50%病例的白血病细胞内可见Auer小体。 分两个亚型： M2a：骨髓中原粒I型＋II型＞30%－90%，单核细胞＜20%，早幼以下各阶段＞1%。 M2b：骨髓中粒系统明显增生，异常的原始及早幼粒细胞增多，以异常的中性中幼粒细胞增多为主，常＞30%，这类中幼粒细胞有核仁1－2个，核浆发育不平衡。有的晚幼粒亦见有核仁。有核凹陷处常有淡染区，胞浆可见空泡。(亚急粒) 4．急性早幼粒细胞白血病(M3) 骨髓中以颗粒增多的或异常的早幼粒细胞增生为主，>30％，胞体呈椭圆形，核可偏向一边，大小不一，另一端为大小不等的异常颗粒，胞浆可见束状Auer小体，也可逸出胞体之外。 5．急性粒-单核细胞型白血病(M4) 骨髓增生极度活跃或明显活跃，粒、单核两系同时增生，红系、巨核系受抑制。根据原始粒和单核细胞的比例、形态不同以及嗜酸细胞的数量，分为下例四个亚型： M4a：以原始及早幼粒细胞增生为主。幼单核细胞>20％。 M4b：以原、幼单核细胞增生为主。原粒和早幼粒<20％。 M4c：原始细胞具有粒细胞系和单核细胞系共同的形态特征者>30％。 4EO：除上述特征外，骨髓中嗜酸细胞>5％一30％，外周血嗜酸细胞不一定增高。 6．急性单核细胞白血病(M5) 骨髓增生极度或明显活跃，原单幼单细胞大于30％，白血病细胞形态特点：体积小，不规则，质多有伪胞质，有空泡和被吞噬的细胞。 7．急性红白血病(M 6) 骨髓增生极度活跃或明显活跃，红系增生为主，原红、早幼红多见，常有中幼红细胞阶段缺如的红血病裂孔现象，且有形态学异常。后期发展为急性髓