P23 P25
P43
P53
P63
P73
P83
P93
P93
P103 P113
P123
P53基因 人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質，命名為P53。p53基因的失活對腫瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的兩個方面，p53是一個重要的抗癌基因使癌細胞自殺，防止癌變；還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。 這種功能對於受化療藥物作用而受傷的癌細胞，則起修復作用，而不是使癌細胞自殺。造成被修復的癌細胞在治療後成為新的腫瘤。 編碼53kDa的蛋白質 類型人體抑癌基因 功能防止癌變，修復缺陷 基因種類腫瘤抑制 1簡介編輯 p53是一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現該基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質（protein）是一種轉錄因數（transcriptional factor），其控制著細胞週期的啟動。許多有關細胞健康的信號向p53蛋白發送。關於是否開始細胞分裂就由這個蛋白決定。如果這個細胞受損，又不能得到修復，則p53蛋白將參與啟動過程，使這個細胞在細胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53缺陷的細胞沒有這種控制，甚至在不利條件下繼續分裂。像所有其它腫瘤抑制因數一樣，p53基因在正常情況下對細胞分裂起著減慢或監視的作用。細胞中抑制癌變的基因“p53”會判斷DNA變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細胞自我修復，若DNA變異較大，“p53”就誘導細胞凋亡。 p53是重要的腫瘤抑制基因，自從該基因在1979年被首次報導以來，有關研究論文在Medline上可查到20000餘篇。人們最初認為p53基因是一種癌基因，但隨著近十年研究的深入，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示出來。在人類50%以上的腫瘤組織中均發現了p53基因的突變，這是腫瘤中最常見的遺傳學改變，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產生的主要發病因素。 p53基因突變後，由於其空間構象發生改變，失去了對細胞生長、凋亡和DNA 修復的調控作用，p53基因由抑癌基因轉變為癌基因。 p53介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用，它與細胞內其它信號轉導通路間的聯繫十分複雜，其中p53參與調控的基因已超過160種，因此，Levine 等學者提出了p53基因網路的概念： 他們認為不能孤立地觀察各個基因的生物學功能，而應該將它們組合起來看待。 p53蛋白主要分佈於細胞核漿，能與DNA特異結合，其活性受磷酸化、乙醯化、甲基化、泛素化等翻譯後修飾調控。正常p53的生物功能好似“基因組衛士（guardian of the genome）”，在G1期檢查DNA損傷點，監視基因組的完整性。如有損傷，p53蛋白阻止DNA複製，以提供足夠的時間使損傷DNA修復；
P53基因概述及应用实例 姓名;赵飞 1.P53基因概述 1.1 P53基因的发现 1979年，在大家都在研究SV40病毒的癌蛋白时，好几个科研小组都无意中分别独立发现了P53蛋白。当时在伦敦癌症研究所(London Research Institute)工作的David Lane和Lionel Crawford发现，用感染了SV40病毒的动物血清与SV40大T抗原发生免疫沉淀反应时能共沉淀下来一个分子量约为53kDa的宿主细胞蛋白。另外三个科研小组也都在1979年同时发表文章报道了同样的结论，他们分别是法国的Pierre May科研小组、美国纽约的Robert Carroll科研小组和英国的Alan Smith科研小组。 1.2P53基因的命名 在这个基因在发现之初，每一个发现它的实验室分别给这种分子量为53 kDa的蛋白质取了各自的名字，并且使用这些名字发表了很多论文，这样就造成极大的混乱。它的真正命名是在1983年在英国牛津举办的第一届国际P53蛋白研讨会上，来自各国的代表专门就这个蛋白的命名进行了讨论。经过一番激烈争论之后，大家一致认为，P53这个名字最为合适，自此被保留下来一直沿用至今。其实P53这个名字根本就不是一个名字，只是因为这个蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中表现出的分子量大约为53 kDa才因此而得名。后来大家才发现，这个表观分子量其实也只是一个大概的估计，因为该蛋白富含脯氨酸，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中的迁移率偏慢，表现出来的分子量要比它实际的分子量大。该蛋白的实际分子量只有43.7 kDa，而小鼠体内P53蛋白的分子量会更小。 1.3P53 基因的功能 P53基因是因编码一种分子质量为53 kDa 的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。其表达产物为基因调节蛋白( P53 蛋白) ，当DNA 受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦P53 基因发生突变，P53 蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。因此说这个基因具有两面性。 1.4 P53基因三十年的发展史 最初10年里，P53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者Lionel·Crawford，David·P.·Lane等人首次追踪到了P53基因的踪迹，不久以后，俄罗斯科学家Petet·Chumakov从小鼠体内克隆到了这个基因的完整版本。但此时P53基因并未受到重视，甚至在最初的几年中，一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对P53基因的正确版本。十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学Bert·Vogelstein最终找到了正确的P53基因，即野生型P53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶名：与此前认识恰恰相反的是，P53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。 第二个10年里，科学家发现P53蛋白实际上是一种转录因子，可以胁迫诱导。基于P53真正功能的重新认识，科学家发现了一系列与肿瘤相关的基因。对这些基因的深入挖掘不但
实验报告 实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达 报告人：张铨合作者：殷悦涵实验日期：2016.4.26 一、实验原理 1. 细胞RNA的提取及鉴定 细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP）的形式存在。分离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节避免它的污染。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在 1.7- 2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。 2. RT-PCR检测p53基因的表达 PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。 RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和H1299）中的表达水平。 二、实验材料及设备 材料：肺癌细胞A549（野生型）和H1299（p53缺失型）、p53引物、GAPDH 引物 试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖 耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩 设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱 三、实验步骤 1. 细胞RNA的提取及鉴定 （一）RNA提取 取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心
细胞生物学课程作业 聚焦P53基因，30年回顾前世今生P53基因的研究探索历程 学院： 姓名： 专业： 学号：
聚焦P53基因，30年回顾前世今生 ——P53基因的研究探索历程 P53基因是一种肿瘤抑制基因，又称人体抑癌基因。由于该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，故命名为P53基因。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子控制着细胞周期的启动，许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送，因此p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。如果细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡中死去。有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因p53会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，p53就诱导细胞凋亡。 p53基因是迄今为止发现与人类肿瘤相关性最高的基因，在短短的三十多年里，人们对p53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，时至今日，人们认识到p53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，并探究对其进行临床应用。本文将就P53基因的研究探索历程进行简单综述。 一、p53基因与癌蛋白抗原——10年发现历程 p53蛋白正式记载被发现于1979年。在上世纪70年代，大部分肿瘤研究工作者的注意力都集中在致癌病毒研究领域。联想到DNA病毒也会通过同样的方式（即从宿主细胞中“窃取”癌基因或者自己编码癌基因）致使人或动物患上肿瘤。研究者随即发现DNA致癌病毒也携带有癌基因，不过这些癌基因并不是宿主细胞来源的癌基因，并提出这些由病毒编码的病毒癌基因可以间接导致宿主细胞癌基因过表达，从而导致癌症发生。正是基于这种理论，p53蛋白才第一次被发现。但发现之初研究人员认为它是猴肾病毒40大T抗原的细胞伴侣，即p53蛋白为猴肾病毒的癌蛋白。在发现了p53蛋白后的最初10年里，大家把主要精力都放在了克隆p53基因上。随后，人们又发现其实p53蛋白并非癌蛋白，而是抑癌蛋白，只是在癌症患者体内的p53基因经常会发生突变而已。 二、p53基因与癌基因——10年探究历程 在对p53蛋白开展研究的第二个10年里，研究人员发现了p53蛋白的真正功能。如巴尔的摩发现肿瘤病毒与细胞遗传物质的相互作用，用新的分子生物学理论说明了肿
T p53基因检测 什么是Tp53基因？ Tp53基因是一种抑癌基因，定位于人类第17号染色体的短臂上，编码和表达Tp53蛋白。Tp53基因是细胞生长周期中的调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能相关联。 Tp53基因分为野生型（正常的基因）和突变型两种，其产物也有野生型和突变型。野生型Tp53蛋白可抑制带有DNA损伤和染色体畸变的细胞发生分裂，从而阻止畸变传递给子细胞，具有广谱的肿瘤抑制作用。相反Tp53基因的突变（缺失）则与肿瘤的发生、发展有密切关系。因此Tp53被誉为基因卫士。 Tp53检测意义 1、应用于肿瘤的超早期预警检测 检测范围包括：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等人类多发肿瘤与p53基因突变有关。 2、应用于肿瘤手术后复发监控 肿瘤具有易转移和复发的特点，及早发现复发或转移，可获得二次治疗机会，延长生命。肿瘤DNA片段存在于血液循环DNA中，被称细胞游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)。P53扫描肿瘤组织中存在的突变，p53定期检测cfDNA突变，监控术后复发和评估疗效。 3、放、化疗的疗效评估 P53发现肿瘤特有突变，通过p53定量检测放化疗前后血浆中基因突变含量变化，间接反映肿瘤治疗的效果。 基因小知识：肿瘤的发生和演变过程 肿瘤是基因突变累积的结果。肿瘤的发生和演变过程：从单个细胞开始到形成米粒小的肿瘤，大约需要8—10年，此阶段人体几乎没有任何症状。从米粒大小发展成杏仁大小，只需一年左右时间，如果没有及时发现，发展到晚期只需要3—8个月的时间。通过相关突变检测发现肿瘤的早期踪迹，进行合理干预，能够逆转肿瘤的形成。 肿瘤从单细胞基因突变到晚期发展历程图 Tp53检测适用人群 由于Tp53基因突变主要发生在肿瘤细胞中，因此对于Tp53基因突变的检测主要适用于与癌症相关的人群的检测，主要包括以下几种： （1）癌症高危人群 主要包括长期生活在大城市，工作压力大的职业；有癌症家族史或有遗传易感性的人群；长期接触有害化学物质或放射线的人群；有慢性炎症或癌前病变人群以及长期吸烟、饮酒者，过多摄入高脂肪失误导致肥胖者。 （2）疑似癌症患者 主要指身体里发现可疑肿块或病理检查有不典型增生、癌前病变人群。 （3）治疗中后期的癌症患者 癌症患者治疗中或治疗后，跟踪监测血液中基因变量的变化，评估疗效，帮助选择治疗方案；曾患癌症，治疗后可定期做Tp53基因检测，从分子层面监控是否再次出现原有的基因突变，能够较临床检查更早发现复发迹象，评估预后。
p53亚型?133p53β促进肿瘤干细胞潜能 摘要 肿瘤干细胞（CSC ）是负责形成化疗耐药性和癌细胞转移的细胞。在这里，我们介绍了?133p53β，它是一种TP53基因的剪接变异体，在MCF-7乳腺癌细胞消耗减少的时候，?133p53β能增强MCF-7乳腺癌细胞中的干性。?133p53β刺激关键多能性因子SOX2、OCT3/ 4和NANOG 的表达。同时，在其他具有高转移性的乳腺癌细胞中，侵袭性与肿瘤干细胞潜能增强和TP53剪接体表达增加相关，并且在这些细胞中，SOX2，OCT3/4和NANOG 的表达也受到TP53剪接体的正向调控。利用抗肿瘤药物etoposide 处理MCF-7细胞能够促进肿瘤干细胞形成以及TP53剪接体依赖性的SOX2，OCT3/4和NANOG 表达增强，增加了癌症复发的潜在风险。这项研究表明TP53的一种剪接体能够促进肿瘤干细胞潜能，之前一直认为TP53主要作为肿瘤抑制因子发挥作用，而这项研究提示我们通过这种剪接体的作用，TP53也可以扮演癌基因的角色。 p53通过信号转导途径突变/摄动使得它在肿瘤细胞中的功能的改变以及p53活性的损失是癌症发展的前提。突变型p53被认为在促进入侵中发挥了举足轻重的作用，有利于癌细胞从肿瘤原发部位传播，并最终导致癌细胞转移。最近有报道指出p53在干细胞稳态和多能性的作用。野生型（WT ）p53阻止体细胞重编程。而突变型p53能刺激诱导多能干细胞（iPS ）的形成。P53的枯竭会显著提高细胞重编程的功效，并促进iPS 细胞的产生。因此，p53基因可能被视为基因组的守护者，对重编程也起到一样的作用。 所有这些功能都与全长p53基因（即，TAp53α亚型）相关。然而，TP53基因通过几个机制编码至少12个不同的生理亚型（TAp53[α，β和γ]，?40p53[α，β和γ]，?133p53[α，β和γ]和?160p53[α，β和γ]），这几种机制是：替代启动子（TA 和?133亚型）、替代 内含子剪接（内含子2：?40同种型和内含子9： γβα和,亚型）以及替代翻译起始位点（?40和?160亚型）。tap53α亚型是最好的描述并在经典文献中所提到p53一样。基本上，p53的同种型可被分为以下两组：（1）包含激活域的长同种型（TA 和?40）；（2）没有激活域的短同种型（?133和?160）。此外，β和γ亚型不包含典型的C-末端寡聚化结构域，但具有未知功能的附加域。 p53同种型在许多过程中改变p53转录活性，如细胞周期进程，细胞程序性死亡，复制性衰老，细胞分化，病毒的复制，和血管生成。重要的是，P53亚型特别是在人类肿瘤中被解除管制。然而，在癌症干细胞（CSC ）中p53同种型功能的动态平衡从未被探索。在这里，我们指出?133p53β亚型的确涉及促进癌细胞的干性。?133p53β在人类乳腺癌细胞系中过表达刺激乳腺球形成和关键多能性和干性调节因子的表达（SOX2、OCT3/ 4、NANOG 和CD24/ CD44），但不包括C-MYC 。此外，使用以MDA-MB-231为基础的细胞系进行试验，我们发现?133p53亚型表达的增加与癌细胞转移潜能的提高和非黏附性乳腺球群细胞（mammospheres ）的形成有关。最后，将MCF-7和MDA-MB-231细胞与抗癌药物etoposide 利用?133p53依赖性的方法一起培养同样促进细胞干性。因此我们的结果表明，短p53同种型无论任何p53突变都正调节CSC 潜力。因此，野生型TP53，通常被认为是一种肿瘤抑制基因，也可以作为通过D133p53b 表达的癌基因。 结果 p53亚型表达的改变影响mammosphere 的形成
P53基因的功能 1 阻滞细胞周期 在细胞周期中，P53的调节功能主要体现在G1和G2/M期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin(细胞周期蛋白)的蛋白激酶抑制剂，一方面P21可与一系列Cyclin-cdk （细胞周期蛋白依赖性激酶）复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致低磷酸化Rb 蛋白（视网膜母细胞瘤蛋白）堆积，后者使E2F转录因子（参与细胞周期调控的细胞因子）不能活化，引起G1期阻滞；另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,CADD45 和14-3-3σ则参与G2/M期阻滞。 2 促进细胞调亡 Bcl-2（调控线粒体外膜通透性的基因家族）可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax （促凋亡基因）可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，T NF受体（在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子）和Fas蛋白（一种细胞膜抗原，主要功能是介导细胞凋亡）。 3 维持基因组稳定
DNA受损后，由于错配修复的累积，导致基因组不稳定，遗传信息发生改变。P53可参与DNA的修复过程，其DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸，结合并调节核苷酸内切修复因子XPB和XPD的活性，影响其DNA重组和修复功能。 4 抑制肿瘤血管生成 肿瘤生长到一定程度后，可以通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在瘤体实质内增生。P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4等表达，抑制肿瘤血管形成。在肿瘤进展阶段，P53基因突变导致新生血管生成，有利于肿瘤的快速生长，这常常是肿瘤进入晚期的表现。ASDDA p53既可阻滞细胞周期，也可诱导细胞凋亡。两种作用方式都是为了维护基因组的稳定，但二者的性质截然不同。前者是为DNA的修复或某种应激状态的改善创造时机。即便不能完全修复DNA的损伤，只要还能容忍，细胞依旧可以存活，但可能会留下基因组不稳定的后患；后者则是从根本上去除造成基因组不稳定的因素，以绝后患。显然，p53的这两种作用方式不能同时并存，二者之间有选择。 究竟p53在被激活后选择何种作用方式，要由活性p53的数量与应激细胞的损伤程度两方面来决定。当通过暂时转染方式让p53在肿瘤细胞内高水平表达时，即可诱导凋亡；而采用温度敏感突变或可诱导系统让p53低水平表达时，则只能导致细胞周期阻滞。但从根本上讲，应激细胞的DNA损伤程度等因素才是决定p53选择何种
RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告 1310301315 张铨 一、RT PCR技术 1.基本原理 聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。PCR包括三个基本过程： (1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA； (2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合； (3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。 RT-PCR方法由两部分组成： (1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段 (2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。1 2.实验方法 【实验材料】 1．试剂 (1)β-actin引物 上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’ 下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’ (2)Promega RT-PCR试剂盒 (3)酚／氯仿：1：1混合 (4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2 (5)无水乙醇 2．仪器 基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。 3．耗材 0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。 【实验步骤】
RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达 一、实验原理 细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。 1、Trizol法 该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA 的方法。Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、 膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等 物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA 位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。 2、RNA质量标准 RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减 少RNA酶对RNA的讲解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度： A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。PCR 3、PCR 聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。利用两段已 知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。其基本过程分为变性、退火、延伸三个 步骤。变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA 与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。每次循 环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。 4、RT-PCR 反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。 RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在 组织细胞中的表达情况。成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然 后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。 本实验先用Oligo引物反转录合成细胞cDNA模板，再用p53特异引物进行PCR扩 增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53基因在两种肺癌细胞的表达水平。
P53基因与癌症和衰老相关性的概述 摘要：p53基因抑制肿瘤是众所周知的，但可能也影响与肿瘤抑制无关的衰老过程。p53对各种应激做出反应，诱导细胞凋亡或阻滞细胞周期，以抑制肿瘤的发展。然而，在非癌衰老过程中p53的作用是复杂的。一方面，p53基因能诱导细胞衰老或凋亡来抑制癌症，但其后果就是加快了衰老。另一面，P53可以减缓生长和减少与生长有关的应激使细胞存活，最终延缓衰老。要想阐明其在衰老过程中的作用，并针对P53或P53转录靶点来治疗癌症和改善衰老，就必须更好地了解p53功能的多样化。 关键词：DNA损伤，细胞生长；细胞衰老；细胞凋亡，无氧酵解 引言：p53基因是一种转录因子，其在哺乳动物中抑制肿瘤的发生已经得到了广泛研究（1→3），但越来越多的证据表明，p53基因也影响衰老过程。但是，p53究竟是怎样影响衰老的还不是很清楚。p53调控大量有致癌作用的基因的转录，包括细胞周期阻滞（P21，GADD45，14-3-3s，RPRM），细胞凋亡（Scotin，killer，FAS，BBC3，PERP，53BP1，BAX，LRDD，PMAIP1），抑制有氧糖酵解（GLUT1，TIGAR，己糖激酶，磷酸甘油酸变位酶），促进氧化磷酸化（OXPHOS）（SCO2，AIF），细胞生长（PTEN，AMPK测试，TSC2，IGF-BP3）（4），以及蛋白质的翻译（sestrins）（5）。P53还具有与转录无关的其他作用，包括调节微RNA加工（6），DNA修复（7），线粒体蛋白存活（8）和核糖体合成（9,10）。因此，p53是维持基因组完整性，调节细胞生长和细胞增殖的关键，是抑制肿瘤的核心（11）。同时，p53通过一个非癌症相关
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p53基因及其功能研究进展 作者：李文娟， 潘庆杰， 李美玉， LI Wen-Juan， PAN Qing-Jie， LI Mei-Yu 作者单位：青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所,山东青岛,266109 刊名： 生物技术通讯 英文刊名：Letters in Biotechnology 年，卷(期)：2014,25(2) 参考文献(21条) 1.闫毓秀;张淑萍;滑静p53基因研究进展 2009(02) https://www.doczj.com/doc/512095789.html,ne D P;Crawford L V T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells 1970(5701) 3.Day A;Verma C S;Lane D P Modulation of p53 degradation as a therapeutic approach 2008(01) 4.李莉;祝峙;方国恩COX-2和p53在乳腺癌组织中的表达及相关性 2006(04) 5.Murray Zmijewski F;Lane D P;Bourdon J C p53/p63/p73 isoforms:an orchestra of isoforms:an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress 2006(06) 6.Wirtenberger M;Frank B;Hemminki K Interaction of Werner and Bloom syndrome genes with p53 in familial breast cancer 2006 7.周晓颖;陈可欣p53基因多态性与乳腺癌的相关性研究进展 2011(09) https://www.doczj.com/doc/512095789.html,ptenko O;Prives C Transcriptional regulation by p53:one protein,many possibilities 2006(06) 9.Zhu W G;Hileman T;Ke Y5-aza2-deoxycytidine activities the p53/p21WAFI/CIPI pathway to inhibit cell proliferation 2004(15) 10.Moreira I S;Fernandes P A;Ramos M J Protein-protein recognition:a computational mutagenesis study of the MDM2-P53 complex 2008(01) 11.Svane I M;Pedersen A E;Nikolaisen K Aiterations inp53-specific T cells and other lymphocyte subsets in breast cancer patients during vaccination with p53-peptide loaded dendritic cells and Iow-dose interleukin-2 2008(36) 12.Bao Y P;Wei T F;Lefebvre P A Detection of protein analytes via nanoparticle-based bio bar code technology 2006(06) 13.Faulk W P;Taylor G M An immunocolloid method for the electron microscope 1971(11) 14.吴幸;崔海宁;明松林P53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表达 2009(04) 15.安莉;王静;俞森洋COX-2和p53蛋白在非小细胞肺癌中的表达及与微血管生成的相关性研究 2007(01) 16.Cioffi M;Vietri M T;Gazzerro P Serum anti-p53 antibodies in lung cancer:comparison with established tumor markers 2001(2-3) 17.周决;曹世龙;陈洁流式细胞仪同时检测实体肿瘤P53蛋白和DNA含量 2000(02) 18.Shiota G;Kishimoto Y;Suyama A Prognostic significance of serum anti-p53 antibody in patients with hepatocellular carcinoma 1997(04) 19.Oda E;Ohki R;Murasawa H Noxa,a BH3-member of the bc1-2famiIy and candidate mediator of p53-induced apoptosis 2000 20.Head S R;Rogers Y H;Parikhk K Nested genetic bit analysis(N-GBA) for mutation detection in the p53 tumor suppressor gene 1997(24) 21.Faried A;Faiied L S;Kato H Targeting p53 tumor suppressor to induce apoptosis and cell cycle arrest in esophageal cancer cells by novel sugar-cholestanols compounds 2008(10) 引用本文格式：李文娟.潘庆杰.李美玉.LI Wen-Juan.PAN Qing-Jie.LI Mei-Yu p53基因及其功能研究进展[期刊论文]-生物技术通讯2014(2)
p53基因 科技名词定义 中文名称：p53基因 英文名称：p53 gene 定义：因编码一种分子质量为53 kDa的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。其表达产物为 基因调节蛋白（P53蛋白），当DNA受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进 一步运转。一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人 类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。 人体抑癌基因该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞自杀，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。 简介 P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲级化、泛素化等翻译后修饰调控。正常P53的生物功能好似“基因组卫士（guardian of the genome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡;如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。 P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。P53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。 P53基因结构及表达 P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类P53基因定位于17P13.1，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由
p53与肿瘤 基础医学院07级临床一班陈依然90701114 摘要 p53作为迄今为止发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，其研究进展对肿瘤的发生机制研究和临床治疗有重要意义。本文简述了p53的生物特性，并重点介绍了p53与肿瘤发生和治疗的一些关联。 关键词：p53 肿瘤 Abstract p53, known as the most relative cancer suppressor gene today, is significant to mechanism of tumor development and its clinic therapy. In this article, I review the characteristics of tumor-associated gene p53 and its role in mechanism of tumor growth and cancer therapy. Key Words: p53 Tumor 正文 恶性肿瘤是一大类严重威胁人类健康的疾病。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，有报道称甚至有50%以上的肿瘤患者存在p53基因的改变。在细胞周期中，正常的p53在DNA损伤或缺氧时活化，使细胞周期停滞于G1/S点，进行DNA修复，如修复失败则活化下游基因使细胞凋亡。这两种功能均有助减少肿瘤发生的可能。 1.p53基因特征 人类p53基因位于17号染色体短臂1区3.1带（17q13.1），全长16-20kb，含11个外显子和10个内含子，分为野生型（wt-p53）和突变型（mt-p53）。wt-p53作为抑癌基因，其功能的改变或缺失与大量不同种类的人类肿瘤细胞有密切关系。wt-p53能整合各种不同的细胞紧急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号做出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应，监视细胞基因组的完整性；mt-p53则不能完成这些功能，甚至成为原癌基因。 wt-p53蛋白是一种分子质量53kd的核内磷酸化蛋白，其半衰期较短。它是一种定位于细胞核中的转录因子，其活性形式为四聚体，自N端起依次为转录激活
Tp53基因检测 什么是Tp53基因？ Tp53 基因是一种抑癌基因，定位于人类第17 号染色体的短臂上，编码和表达Tp53 蛋白。Tp53 基因是细胞生长周期中的调节因子，与细胞周期的调控、DNA 修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能相关联。 Tp53 基因分为野生型（正常的基因）和突变型两种，其产物也有野生型和突变型。野生型Tp53蛋白可抑制带有DNA 损伤和染色体畸变的细胞发生分裂，从而阻止畸变传递给子细胞，具有广谱的肿瘤抑制作用。相反Tp53 基因的突变（缺失）则与肿瘤的发生、发展有密切关系。因此Tp53 被誉为基因卫士。 Tp53检测意义 1、应用于肿瘤的超早期预警检测 检测范围包括：肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等人类多发肿瘤与 p53基因突变有关。 2、应用于肿瘤手术后复发监控 肿瘤具有易转移和复发的特点，及早发现复发或转移，可获得二次治疗机会，延长生命。肿瘤DNA片段存在于血液循环DNA 中，被称细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)。P53扫描肿瘤组织中存在的突变，p53定期检测cfDNA突变，监控术后复发和评估疗效。 3、放、化疗的疗效评估 P53 发现肿瘤特有突变，通过p53定量检测放化疗前后血浆中基因突变含量变化，间接反映肿瘤治疗的效果。 基因小知识：肿瘤的发生和演变过程 肿瘤是基因突变累积的结果。肿瘤的发生和演变过程：从单个细胞开始到形成米粒小的肿瘤，大约需要 8—10年，此阶段人体几乎没有任何症状。从米粒大小发展成杏仁大小，只需一年左右时间，如果没有及时发现，发展到晚期只需要 3—8 个月的时间。通过相关突变检测发现肿瘤的早期踪迹，进行合理干预，能够逆转肿瘤的形成。 肿瘤从单细胞基因突变到晚期发展历程图
p53基因的30年 基英肽总部2009年11月4日摘自博客作者：riset 与DNA相结合的p53蛋白 在人类基因组所包含的数万条基因中，它是研究的最为透彻的一个。在已经进入临床试验的抗肿瘤基因治疗药物中，超过40个都选择了以它为靶点。在美国国立生物医学信息中心的生物医学文献数据库（pubmed）中，有关它的研究文献已经超过了50000篇，而且这一数字仍在稳定的增长。没错，它就是p53基因，时至今日，对这一基因的研究已经走过了30年的坎坷历程。 十年蹉跎两茫茫 1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者Lionel Crawford,，David P. Lane等人首次追踪到了p53基因的踪迹。这些研究者或许没有料到，他们的发现开启了现代肿瘤研究与治疗的新时代。 不久以后，俄罗斯科学家Peter Chumakov从小鼠体内克隆到了这个基因你的完整版本。因为这一基因
在细胞中翻译后产生的蛋白质（protein）的分子量为53千道尔顿，故而被命名为p53。 不过，在发现伊始，p53基因并未受到重视，甚至在最初的10年中，p53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对p53基因的正确版本。众所周知，一条基因由一系列脱氧核糖核酸按照相应的顺序彼此串联而成，如果其中的某个或某些核苷酸发生改变就意味着这条基因发生了突变，而起初研究者拿到的基因就是p53的突变版本，按照这一版本翻译成的蛋白质自然就无法行使正常p53基因的功能。 蹉跎十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学家Bert V ogelstein最终找到了正确的p53基因，即野生型p53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶名：与此前认识恰恰相反的是，p53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。 新桃换旧符 藉由p53真正功能的重新认识，科学家发现了一系列与肿瘤相关的基因。对这些基因的深入挖掘不但让人们对癌症的本质有了更新的了解，而且还为肿瘤的基因治疗奠定了基础。现在科学家已经公认，癌症发生的肇因是由于细胞增殖与凋亡、细胞的分化与抑制、免疫与逃避免疫、血管的生成与抑制以及转移与抑制转移之间的精细平衡被打破的缘故。这些平衡归根结底是癌基因与抑癌基因间的平衡。 然而，平衡的打破并非一蹴而就，因此癌症的发生发展是一个持续时间很长的过程。根据现有的统计数据，大约在50%以上的癌症中都发现有p53基因的突变，如果将癌症的发作比作一列倾倒中的多米诺骨牌，那么p53基因很有可能位居这列骨牌的前列。 在人体这个迄今为止最为复杂的系统中，倘若一个细胞想要改变其现有状态（如从静止到生长分化状态的改变），必须接收到一系列相关指令后，这一过程才能进行。在这其中，p53就扮演了“分子警察”的作用——通过对细胞周期的调控来控制细胞的增殖生长。 譬如，一旦细胞中的DNA发生了损伤，p53发觉后，就会亮出红灯，细胞的增殖过程即会停止，同时召唤出DNA的“修理工”，对受损DNA进行修复，以防不正确的遗传密码错误复制下去。如果DNA的损伤过于严重，无法复原，p53就会下达“死刑”执行令，诱导细胞进入凋亡状态（由基因控制的细胞自主的有序的死亡），提前将不正常的细胞从机体中清除出去。 另外，癌细胞具有增殖效率高、生长速度快的特点，因此在肿瘤实体的生长过程中，需要源源不断的氧气和养分的供应。这些成分的输送通道就是血管。这些血管如此重要，以至于任何一个细胞与其最近的毛细血管的距离不能超过100微米。这些发现促成美国哈佛大学医学院的科学家Judah Folkman提出了“抗血管生成治疗”的假说。巧合的是，科学家发现p53基因能够阻断一种血管生成基因的表达，来抑制肿瘤内部血管的形成。 在由抑癌基因组成的通路和网络中，p53的重要程度就如同大管家一般，因此科学家希望能够通过基因治疗的手段，向癌症患者体内导入正常版本的p53基因来实现抗肿瘤的目的。 自打1990 年，美国国立卫生研究院的Freuch Anderson博士启动了全球第一个真正意义上的基因治疗临床试验以来，已有1000余例基因治疗临床试验获批上马，其中大约70%是针对肿瘤，而p53基因更是成为其中不可或缺的靶点。在我国，深圳赛百诺基因技术有限公司从1998 年开始进行重组腺病毒——p53 抗癌注射液的临床试验，至2003 年完成了全部临床试验，于2004 年1 月获得我国SFDA 批准的新药生产批文，成为世界上第一例正式上市的基因治疗产品。 最熟悉的陌生人 自从p53基因被认定为一种重要的抑癌基因以来，它一直就是焦点中的焦点。1993年，p53还被《科学》
P53基因的结构及表达 P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。正常P53的生物功能好似“基因组卫士（guardian of the genome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡;如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。 P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。P53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。 P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类P53基因定位于17P13，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5 个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～19 2、236～258、270～286编码区.P53基因转录成
2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为4 3.7KD，P53基因的表达至少受转录及转录后二种水平的调控.在停止生长或非转化细胞 中P53mRNA水平很低，但刺激胞液后mRNA显著增加.持续生长的细胞，其mRNA 水平不随细胞周期而出现明显变化，但经诱导分化后mRNA 水平降低，部分是转录后调控.P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp，P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起作用，如内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性. P53 基因位于人类17号染色体含11 个外显子，其转录翻译编码的野生型P53 蛋白由393个氨基酸残基组成，包含多个功能域。N-末端的转录激活结构域(activtiondomain, AD）AD1,AD2位于氨基酸 1-50位，与通用转录因子TF11D 结合而发挥转录激活功能。TF11D 是由TBP（TATAbinding protain)和TAF(TBP associatedfactor)结合而成的复合物，P53与TF11D中的TAF结合，作用于下游基因启动子中的TATA box ，达到转录激活功能。P53基因生长抑制结构域位于氨基酸65-90 位，富含脯氨酸，含5重复的pxxp序列，可与含SH3 结构域的蛋白质相互作用，将P53与信息传递途径连接起来。 P53 基因还有：序列特异的DNA结合结构域，位于氨基酸100-300位间；核定位信号NLS位于氨基酸残基316-325；四聚体寡聚化结构域，定位于氨基酸残基334-356；C-末端非专一DNA调节结构域，同时在碰到DNA损伤时，P53 可能补充其它蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。P53 与DNA的结合能力并非特异性地与DNA 结合，参与核心区与DNA 结合的别构调节，同时在碰到DNA损伤时，P53可能补充其他蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。