大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型
缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。
1.实验动物
SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250g-300g。
2.实验分组
实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
3.实验周期
0h、3h、6h、12h、24h、72h
4.建模方法
1.选取体重250g-300g大鼠，行术前12 h禁食，自由饮水。
2. 15%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将大鼠腹部至剑突术区剃毛，用10％碘酒和75％乙醇术区消毒。
3.取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。
4. 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉,使约70%的肝脏缺血,以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后,与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将大鼠放在37℃恒温加热垫上保温。
5. 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，0.5min左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。待大鼠清醒后放回饲养室饲养，密切关注大鼠的状态及生存状况并做好记录。
6. 术后分别于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h处死大鼠，下腔静脉取血1ml，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。采用全自动生化分析仪检测血清中ALT（谷丙
转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。同时统一取肝左叶组织1．5cm×1cm×0．2cm留作病理标本或分生标本。
5.模型评价
1. 分别检测术后0h、3h、6h、12h、24h及72h大鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（天门冬氨酸氨基转移酶）的水平。
2. 统一取肝左叶组织1.5cm×1cm×0.2cm于4%多聚甲醛溶液中固定24h后脱水，包埋，进行石蜡切片后行HE染色，tunel染色。作坏死评分。肝小叶结构严重破坏，网状纤维支架塌陷，肝细胞坏死，空泡变样，肝细胞索、肝窦充血肿胀，边界不清，周围有炎性细胞浸润。
3.肝脏缺血损伤评分：
0分：无肝细胞损伤
1分：轻度损伤，特点为细胞质空泡化，病灶核固缩
2分：中度损伤，血窦膨胀，细胞溶质空泡化，细胞边界模糊
3分：中度到重度损伤，凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊红细胞增多，中性白细胞着边（附着于血管壁）
4分：严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入
6.注意事项
6.1 分离肝门时用棉签分离，可避免对肝脏的损伤
6.2术前禁食有利于手术进行
6.3阻断血流要一次成功，否则会造成缺血预处理，减轻损伤程度
6.4再灌后用棉签轻轻按压肝脏，有利于血流恢复
6.5取材时镊子不要损伤肝脏
Ischemia liver lobe
Non ischemia liver lobe
图1 大鼠肝脏70%缺血大体图，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白
武汉云克隆诊断试剂研究所
肝脏缺血再灌注的损伤机制及和防治 摘要：缺血再灌注损伤是Jennings第一次提出的，是指组织或器官在缺血后紧接着得到血液供应，但是这时血液的供应不利于缺血的组织、器官的功能的恢复，甚至加重了代谢的障碍、结构的破坏。本文的肝脏缺血再灌注损伤是肝脏术后肝功能异常、原发性肝移植无功能、肝衰竭的重要原因之一【1】。肝脏缺血再灌注损伤的后果往往取决于缺血时间的长短、肝脏储备功能的强弱等【2】。目前。肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科的研究热点，普遍认为其病理机制是多种机制共同作用的结果，防治主要是缺血预处理、药物预处理和缺血后处理。 1.肝脏缺血再灌注损伤的机制 肝脏缺血再灌注损伤的发生可能有部分原因是由于肝脏缺血过程中的损伤，另一部分原因是当缺血的肝脏得到血流再灌注时产生一系列损伤。研究指出，缺血再灌注使得肝细胞和kuffer细胞、中性粒细胞、肝窦状隙内皮细胞、贮脂细胞等细胞之间发生相互作用【3】。另外，血小板、补体也有参与。活化的细胞释放大量的促炎因子、脂质炎性因子，导致炎性介质反应和细胞的凋亡。损伤会使得肝窦状隙内皮细胞被破坏，肝脏微循环障碍，进而加重肝脏微循环的缺血且导致肝细胞再生受阻【4】。 2.肝脏缺血再灌注损伤与氧自由基 研究指出，氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤的时候发挥了较为重要的作用，主要来源于kuffer细胞、中性粒细胞和黄嘌呤氧化酶，主要包括超氧化物自由基、氢氧根离子、过氧化氢等。氧自由基造成肝细胞损伤的机制主要是：通过对细胞膜磷脂双分子结构中脂质的氧化，改变细胞膜通透性及流动性，从而直接损伤肝细胞；同时氧自由基损伤肝脏血管内皮细胞，特别是肝窦状隙内皮细胞，引起血液中血小板以及粒细胞等在微血管中聚集，阻碍肝脏微循环，氧自由基还可抑制线粒体氧化磷酸化，使肝细胞供能减少。 3.肝脏缺血与细胞内钙超载
[23] O sakiM ,Kase S,Adachi K, et al .I nhibiti on of the P I 3K/Akt sig 2 naling pathway enhances the sensitivity of Fas -mediated apop t o 2sis in human gastric carcinoma cell line,MK N -45[J ].J Cancer Res Clin Oncol,2004,130(1):8-14. [24] Shinom iya N ,Gao CF,Xie Q,et al .RNA interference reveals that ligand -independent met activity is required for tumor cell signa 2ling and survival[J ].Cancer Res,2004,64(21):7962-7970. [25] Ya mamot o S,Tom ita Y,Hoshida Y,et al .Pr ognostic significance of activated Akt exp ressi on in pancreatic ductal adenocarcinoma [J ].Clin Cancer Res,2004,10(8):2846-2850. [26] Schlie man MG,Fahy BN,Ra m sa mooj R,et al .I ncidence,mecha 2 nis m and p r ognostic value of activated AKT in pancreas cancer [J ].B r J Cancer,2003,89(11):2110-2115. [27] A sano T,Yao Y,Zhu J,et al .The P I 3-kinase /Akt signaling pathway is activated due t o aberrant PTEN exp ressi on and targets transcri p ti on fact ors NF -kappa B and c -Myc in pancreatic cancer cells[J ].Oncogene,2004,23(53):8571-8580. [28] Stephan S,Datta K,W ang E,et al .Effect of rapa mycin al one and in combinati on with antiangi ogenesis therapy in an orthot op ic mod 2el of human pancreatic cancer [J ].Clin Cancer Res,2004,10(20):6993-7000. [29] Khaleghpour K,L i Y,Banville D,et al .I nvolve ment of the P I 3-kinase signaling pathway in p r ogressi on of col on adenocarcinoma [J ].Carcinogenesis,2004,25(2):241-248. [30] Sa muels Y,W ang Z,Bardelli A,et al .H igh frequency of mutati ons of the P I K3CA gene in human cancers [J ].Science,2004,304(5670):554. (编校:任永斌) 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制研究进展 千年松,帝振宇,陶开山 【指示性摘要】缺血再灌注造成的器官损伤与多种临床及环境因素有关。临床中的许多状况均可引起缺血 再灌注损伤,如器官移植、心脏冠状搭桥以及心肌梗死、中风等。缺血再灌注损伤主要来源于再灌注时产生的急性活性氧。它们会导致直接的组织损伤,并且启动一连串的导致炎症、细胞死亡甚至器官衰竭的有害的细胞反映。肝缺血再灌注损伤(Ische m ia /reperfusi on,I/R )是肝脏外科疾病中常见的病理过程,如处理严重的肝外伤。施行广泛的肝切除术、肝脏移植等,导致肝缺血再灌注损伤的原因很多。确切的发病机制仍不十分清楚。目前,对肝脏缺血再灌注损伤发生机制的研究已成为关注的热点。【关键词】肝脏;缺血再灌注;发生机制;急性活性氧【中图分类号】R730.3 【文献标识码】A 【文章编号】1672-4992-(2009)08-1589-04 缺血再灌注损伤是影响肝移植和肝脏叶段切除术后肝功能的一个多因素的过程。复氧过程中活性氧的产生, Kupffer 细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的活化引起一系列损害 性的细胞反应,继而导致炎症、细胞死亡。同时由于肝窦内皮细胞的损害而导致的微循环障碍,进一步加重肝脏局部缺血。在细胞应激过程中血红素氧化酶系统发挥了细胞保护、抗氧化、抗炎症、维持微循环的作用。还有一些重要保护物质越来越受到大家的重视,包括热休克蛋白[1]、一氧化氮 (NO )[2]。 1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制研究1.1 钙超载和肝脏缺血再灌注损伤 细胞内自由钙浓度在调节许多细胞机能和激素的活性方面有重要作用。正常生理条件下,肝细胞维持胞内外钙的 【收稿日期】 2008-08-29【修回日期】 2008-12-13 【作者单位】 第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科,陕西 西安 710032 【作者简介】 千年松(1982-),男,吉林吉林人,博士,主要从事器 官移植和肝脏肿瘤等方面的基础与临床工作。 【通讯作者】 陶开山(1964-),男,安徽人,主任医师,副教授,主要 从事肝癌干细胞及肝移植的基础和临床研究。 动态平衡,主要依靠Na +/Ca 2+交换系统、H +/Ca 2+ 交换系统、膜对Ca 2+的低通透性和膜钙泵的主动转运。当细胞内钙超载时可引起磷脂酶的激活,膜磷脂分解,破坏细胞和线粒体膜。最终导致细胞死亡[3]。钙超载可激活巨噬细胞,在肝脏即Kupffer 细胞,从而释放很多毒性产物,如水解酶和细胞因子。钙超载可使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,从而导致自由基生成增多。目前认为,细胞内钙超载引起肝细胞损伤的机理:①激活Ca 2+依赖磷脂酶c 和磷脂酶A2,使其双分子层结构紊乱,导致膜性结构的破坏[4];②激活Ca 2+依赖蛋白酶,破坏细胞骨架与胞膜联接的完整性而导致细胞损伤[5];③线粒体钙超载使其膜电势丧失,氧化磷酸化脱偶联,引起严重能量代谢障碍,并促进了氧自由基的产生,对细胞产生不可逆的损伤。1.2 中性粒细胞和肝脏缺血再灌注损伤 中性粒细胞在肝脏缺血再灌注损伤的早期聚集到肝脏微循环系统中被活化,加重再灌注损伤。中性粒细胞的聚集外侵需要肝窦内皮细胞和中性粒细胞之间的相互作用,通过中性粒细胞和内皮细胞表面黏附分子的上调使得两者的结合更加紧密,从而使中性粒细胞进一步越过内皮细胞,转入肝脏实质,产生炎症反应。有研究认为,肝窦是中性粒细胞外侵的主要地方,一旦外侵入肝实质,中性粒细胞通过淋巴细胞相关抗原与肝细胞上的细胞间黏附分子结合发生作用。
小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP 迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 0h、3h、6h、12h、24h、72h 4.建模方法 1 小鼠术前1 2 h禁食，自由饮水。 2 3%戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75％乙醇术区消毒。 3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。 4 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放在37℃恒温加热垫上保温。 5 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，
内容摘要：肝移植术后的胆道并发症是肝移植的致命弱点，是阻碍肝移植疗效提高的重要因素。因此，它被肝移植先驱calne爵士称为“阿咯琉斯之踵”(the heel of achilles)［1］。随着对肝移植胆道并发症的进一步认识和外科技术的提高，因外科技术原因造成的吻合口、引流管相关并发症发生率呈下降趋势，而非外科技术原因的移植肝缺血型胆道病变(ischemic type biliary lesion，itbl)则成了肝移植术后胆道并发症的主要类型。因此，被称为“阿咯琉斯之踵再现”［2］。缺血型胆道病变是指肝移植术后移植肝非吻合技术性的胆管树的破坏，其发生率为2%～19%［2］。由于其发病原因复杂，临床处理困难，已成为影响肝移植患者长期存活及导致移植物丢失的主要原因之一［3］。为此，肝移植术后缺血型胆道病变的研究已引起了全球移植专家的高度重视［2-4］。 肝移植术后的胆道并发症是肝移植的致命弱点，是阻碍肝移植疗效提高的重要因素。因此，它被肝移植先驱calne爵士称为“阿咯琉斯之踵”(the heel of achilles)［1］。随着对肝移植胆道并发症的进一步认识和外科技术的提高，因外科技术原因造成的吻合口、引流管相关并发症发生率呈下降趋势，而非外科技术原因的移植肝缺血型胆道病变(ischemic type biliary lesion，itbl)则成了肝移植术后胆道并发症的主要类型。因此，被称为“阿咯琉斯之踵再现”［2］。缺血型胆道病变是指肝移植术后移植肝非吻合技术性的胆管树的破坏，其发生率为2%～19%［2］。由于其发病原因复杂，临床处理困难，已成为影响肝移植患者长期存活及导致移植物丢失的主要原因之一［3］。为此，肝移植术后缺血型胆道病变的研究已引起了全球移植专家的高度重视［2-4］。 1 缺血型胆道病变的发病机理 1.1 供肝缺血时间 1.2 供肝灌注方式 1.3 胆汁对胆管上皮细胞的损伤 1.4 肝动脉血供受损 胆管重建时对胆管血供的破坏可导致肝移植术后itbl的发生，这一观点已得到公认［13,17-18］。另外，任何原因引起的肝动脉供血不足，如肝动脉吻合口狭窄、血栓形成、受者肝动脉过细或变异等,均可引起胆管黏膜缺血性损伤,最终发生胆瘘或胆管狭窄。有报道［19］显示原位肝移植术后发生肝动脉血栓的患者中86%出现胆道并发症，术后早期发生的肝动脉血栓常会导致胆管壁缺血坏死和胆瘘,后期发生的肝动脉血栓多导致肝内、外胆管狭窄。 1.5 abo血型不符 在肝移植时,abo血型不符可引起体液性免疫排斥反应,导致大胆管出现局灶性坏死,最后可导致胆管狭窄或闭塞性胆管炎和小胆管消失。sanchez urdazpal等［20］报道了17例abo 血型不符的肝移植患者，9例发生itbl，发病率高达53%。 1.6 巨细胞病毒(cytomegolovirus,cmv)感染 halme等［21］研究发现itbl的发生与cmv感染密切相关。cmv感染可引起慢性炎症反应，激活单核细胞和库普弗细胞，继而对受感染的组织造成慢性炎性损害。另外因cmv抗原与人体自身抗原是类似物,使特异性的细胞毒性t淋巴细胞能产生交叉识别,将同种抗原识别为“非自身抗原”并加以损伤。此外cmv感染也可引起移植后的血管硬化、狭窄或血栓形成。当累及肝动脉时即可导致胆管狭窄或胆漏［22］。 1.7 原发肝脏疾病 有资料［23］表明受者原发疾病为原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎及meld评分≥35分的严重肝病，移植术后有较高的itbl发生率。
模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 （1）术前12小时给动物禁食 （2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上 （3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml （4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1 （5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2
（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3
（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4
（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5 （9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6
（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7
（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果，图8 结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：
大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250g-300g。 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 0h、3h、6h、12h、24h、72h 4.建模方法 1.选取体重250g-300g大鼠，行术前12 h禁食，自由饮水。 2. 15%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将大鼠腹部至剑突术区剃毛，用10％碘酒和75％乙醇术区消毒。 3.取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。 4. 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉,使约70%的肝脏缺血,以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后,与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将大鼠放在37℃恒温加热垫上保温。 5. 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，0.5min左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。待大鼠清醒后放回饲养室饲养，密切关注大鼠的状态及生存状况并做好记录。 6. 术后分别于再灌注0h、3h、6h、12h、24h及72h处死大鼠，下腔静脉取血1ml，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。采用全自动生化分析仪检测血清中ALT（谷丙
2013年12月 第23卷第12期中国比较医学杂志CHINESE JOUＲNAL OF COMPAＲATIVE MEDICINE December ，2013Vol．23No．12 ［基金项目］国家自然科学基金（81273691）。 ［作者简介］陈婵娟（1985－），女，在读博士生，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药对心血管疾病的预防与 治疗。E- mail ：ccjqlgcj@126．com 。［通讯作者］鲁卫星（1959－），男，主任医师，博士生导师，主要研究方向：中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管 疾病的研究。E-mail ：weixinglu918@sina．com 檵檵檵檵檵 檵檵檵檵檵殝殝 殝 殝。研究报告大鼠Langendroff 离体心脏局部缺血 再灌注模型建立及功能评价 陈婵娟1，潘昡1，赵明镜2，鲁卫星 3（1.北京中医药大学，北京100029；2.北京中医药大学东直门医院，北京100007； 3.北京中医药大学第三附属医院心内科，北京100029） 【摘要】目的建立大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血再灌注模型的方法并进行功能评价。方法将26 只Wistar 大鼠随机分成2组，对照组（control ，n =12）和模型组（model ，n =14）。两组均建立标准的Langendorff 离 体心脏灌注模型：K-H 液持续灌注（95%O 2+5%CO 2过饱和，左心室插入球囊压力管）， K-H 液持续灌注平衡20min 后对照组K-H 液持续灌注105min ；模型组同对照组平衡20min 后穿线结扎冠状动脉左前降支第一对角支下 缘部位， 造成局部停灌（缺血）30min ，而后剪断结扎线复灌（再灌注）75min 。伊文思蓝、TTC 染色观察心肌梗死、缺血面积；记录左心室压力及心率变化过程，比较各组平衡20min 、局部缺血30min 、再灌15min 、再灌30min 、再灌 75min 的血流动力学指标及灌流液中肌酸激酶（creatine kinase ，CK ）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH ）漏 出量。结果对照组血供正常，模型组局部缺血、梗死明显；对照组、模型组平衡末心肌酶学及血流动力学各参数 无明显差异（P ＞0.05），模型组局部缺血、再灌注各个观测时刻心肌酶学及血流动力学参数均与对照组有显著差 异（P ＜0.05），说明模型组经历局部缺血、再灌注损伤，心肌酶漏出明显升高，心脏收缩功能、舒张功能受损，心肌 耗氧量升高。结论大鼠Langendorff 离体心脏局部缺血灌注模型稳定可靠，掌握制作要点及注意事项后，可顺利 快速地成功制备， 为心肌局部缺血再灌注损伤的研究提供更接近临床疾病状态的实验途径。【关键词】大鼠；Langendorff 离体心脏；局部缺血再灌注；模型制备与评价 【中图分类号】Ｒ33【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856（2013）12-0021-06 doi ：10.3969．j．issn．1671.7856.2013.012.006 Establishment and assessment of a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion CHEN Chan-juan 1，PAN Xuan 1，ZHAO Ming-jing 2，LU Wei-xing 3 （1.Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100029，China ； 2.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine ，Beijig100007； 3.Department of Cardiology ，the Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029） 【Abstract 】Objective To explore and summarize a Langendorff perfused rat heart model of ischemia-reperfusion．Methods Twenty-six Wistar adult rats were divided into two groups randomly ：control group （n =12）and model group （n =14）．Each rat underwent open-chest surgery．The hearts were removed and immediately cannulated and effectively
Ca2+通路对肝移植缺血再灌注损伤的影响马俊，李立（昆明医科大学附属甘美医院，云南昆明650100）［关键词］肝移植；缺血再灌注损伤；Ca2+通路；细胞凋亡；机制 肝脏缺血－再灌注损伤是困扰肝脏外科的一大难点，也是影响肝移植受者术后转归的重要因素。细胞凋亡是肝移植缺血－再灌注损伤的重要机制之一。Ca2+是最先被发现的在缺血－再灌注损伤过程中起作用的因子之一，Ca2+通道通过调节细胞内Ca2+浓度从而影响缺血再灌注损伤的严重性；通过对Ca2+通道的调节，进而对肝移植缺血－再灌注损伤进行调控，以减少肝移植缺血－再灌注对肝脏造成的损伤。缺血再灌注损伤是指缺血的组织器官重新获得血液供应后，并没有使组织、器官功能得到尽快恢复，反而加重其功能代谢障碍及组织结构破坏的现象。 1肝脏缺血再灌注损伤的机制 肝脏缺血再灌注损伤过程按时间可分为缺血期和再灌注期。 1．1缺血期：①线粒体损伤：线粒体是氧化磷酸化反应的主要部位，缺血缺氧首先引起线粒体的损伤，使其功能受损，细胞色素酶系统功能失调，进而形态发生改变，出现线粒体通透性改变，使线粒体内Ca2+聚集，最后导致细胞程序性死亡或坏死［1］。②无氧代谢与代谢性酸中毒：发生缺血、缺氧时，由于线粒体损伤，氧化磷酸化受到抑制，使得ATP有大幅度地减少，依赖于ATP的各种细胞活动受到影响，而因肝脏内的ATP 迅速耗尽和无氧酵解的发生，可导致乳酸、酮体等的堆积，从而引发代谢性酸中毒，pH值明显降低［2］。③Ca2+超载：生理情况下，细胞内和细胞外Ca2+浓度有明显差异，维持细胞正常生理功能的前提是细胞内保证处于Ca2+浓度的状态。缺血缺氧使ATP含量有大幅度地下降，会使细胞内外Ca2+浓度发生明显变化进行重新分布，使得Ca2+大量内流，最终造成细胞内Ca2+浓度异常增多，此种现象称为Ca2+超载。 1．2再灌注期：①氧自由基的损伤：氧自由基具有高度不稳定性的特点，生理情况下，身体内氧自由基的产生和清除相对动态平衡，肝缺血再灌注造成细胞内Ca2+超载，激活Ca2+依赖蛋白酶促进胞内黄嘌呤脱氢酶（XDH）向黄嘌呤氧化酶（XOD）转化，而黄嘌呤氧化酶利用胞内分子氧产生大量的氧自由基。氧自由基对肝细胞膜重大直接损伤，细胞遭受到严重破坏后产生出大量细胞内容物，进一步加重炎性反应过程中氧自由基的产生，氧自由基又进一步损伤到内皮细胞，最终造成丧失微循环完整性，血流也有急剧减少。②细胞因子：肿瘤坏死因子α（TNF－α），白细胞介素－1和6（interleukin1 and6，IL－1and IL－6），前列腺素（prostaglanddins，PG）等细胞因子参与了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程。这些细胞因子既可通过单个形式也可通过彼此间协同作用引起肝细胞损伤［3］；激活中性粒细胞释放氧自由基；刺激单核巨噬细胞和其他细胞分泌IL－1，IL－6等炎性因子给予相关抗体能减轻肝脏炎性反应和损伤［4］。③中性粒细胞和Kupffer细胞活化：中性粒细胞在肝脏缺血再灌注损伤的早期聚集到肝脏微循环系统中被活化，加重再灌注损伤，最终会加重内皮细胞的损伤，进一步作用使得肝内微循环发生严重紊乱，造成肝脏持续性的缺血，会严重损伤到肝细胞［5］。④一氧化氮（NO）和内皮素（ET）：NO是由一氧化氮合成酶通过L－精氨酸加工而来，他在免疫调节、神经递质传递、血小板聚集等生理过程中都有重要作用［6］。NO能够激活cGMP降低血管张力，从而发挥其血管舒张因子的作用［7］，另外，NO还可以通过调节中性粒细胞粘附、血小板聚集、星状细胞的舒张等达到影响缺血再灌注损伤严重程度的作用［8］。ET浓度增高将导致微血管收缩，肝血流减少而引起肝脏微循环功能障碍，继而导致肝细胞的损伤。 2Ca2+在缺血再灌注损伤及细胞凋亡中的作用 Ca2+是最先被发现的在缺血－再灌注损伤过程中起作用的因子之一，Ca2+通道通过调节细胞内Ca2+浓度从而影响缺血再灌注损伤的严重性。在此过程中，Ca2+是某些磷脂酶、核酶、蛋白酶的激活所必须的离子，另外，在缺血再灌注损伤相关的氧化磷酸化紊乱过程中，Ca2+通过减少ATP的合成，发挥了重要的作用［9］。线粒体内钙离子的浓度变化也与肝脏热缺血－再灌注损伤的严重程度有密切关系［9］。 Ca2+是广泛存在于各种细胞内的信号分子，他不仅可以从多个方面调节细胞正常生理功能，同时也是细胞凋亡信号途径中的重要成分［10］。一些药物或化学物质，如糖皮质激素、内质网Ca2+－ATP酶抑制剂毒胡萝卜内酯（thapsigarin）以及一些肿瘤化疗药物，都是通过凋亡起始阶段暂时提高细胞内游离的Ca2+浓度、并激活细胞内Ca2+储藏细胞器释放Ca2+，从而诱发细胞凋亡［10］。此外，在处于细胞凋亡效应阶段晚期的细胞内，也可观察到游离Ca2+浓度的升高［10］。目前已经发现了一系列的Ca2+介导的细胞凋亡信号途径。 线粒体在细胞内位于接近内质网Ca2+通道附近的微小区域，当这些通道开放时，胞质内Ca2+有可能升高［11］。线粒体内Ca2+浓度上调有可能导致线粒体渗透性移位（mitochondrial permeability transition），从而进一步诱发线粒体肿胀和凋亡。例如卡配因（Calpain），他是一种依赖Ca2+存在而激活的半胱氨酸蛋白酶，已经被证实在某些刺激的作用下能够诱发细胞凋亡［12］，在此过程中，一些重要的细胞成分也参与到其中，如caspase－12［13］，Bax［14］，Bid［15］。 3钙离子拮抗剂对肝缺血再灌注损伤的作用和研究进展国内外鲜有应用钙离子通道阻断剂降低肝缺血再灌注损伤的相关研究及报道，多为理论研究，临床研究少见。 4小结 缺血再灌注损伤的机制研究较深入，如何有效减少缺血再灌注损伤是目前国内外外科学研究的重点和难点，笔者从Ca2+通道对于缺血再灌注损伤的影响方向入手，以求找到一种有效的方法，最大限度地发挥钙离子通道拮抗剂在缺血再灌注损伤病理生理过程中的保护作用。 5参考文献 ［1］Kim J，Qian T，Lemasters JJ．Mitochondrial permeability transit ion in the sw itch from necrot ic to apoptotic cell death in is-chemic rat hepatocytes［J］．Gast roentero logy，2003，124（2）：494．［2］Lemasters JJ，Thurman RG．The many facets of reperfusion injury［J］．Gast roerlogy，1995，108（4）：1317． · 729 · 吉林医学2013年2月第34卷第5期
基金项目:广东省自然科学基金(06021338);广东省科技计划项目 (2007B031508003);佛山科技局(200808109) *通讯作者,Wushuhua168@https://www.doczj.com/doc/519900503.html, 文章编号:1007-4287(2010)08-1163-03 大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型的建立与评估 成玲俐1,吴素华2*,李志梁1,唐 2 ,张 瑞1 (1.南海盐步医院,广东佛山528247;2.中山大学附属第一医院;3 南方医科大学珠江医院) 摘要:目的 改进和完善大鼠急性心肌缺血再灌注损伤动物模型的制备及评估。方法 健康SD 大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。并从造模成功率、心电图、外周血中LDH 、CK MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方面对改进后的模型进行评估。结果 改进后的造模成功率达到90%以上,血液动力学、心电图、外周血中LD H 、C K MB 的含量测定、心肌病理组织学检查等方式均证实改良后的动物模型成功。结论 改进后的方法能大大降低手术难度,提高模型成功率和动物成活率,准确地复制心肌缺血再灌注损伤的实验模型,简化实验操作步骤。 关键词:大鼠;心肌缺血再灌注;动物实验模型中图分类号:R541 4 文献标识码:A Im proving and Evaluating the Method of Establishing Rat Models of Acute Myocardial Eschem ia Reperfusion C HE NG Ling li ,WU Su hua,LI Zhi lian g ,et a l.(De p a rtment of Ca rdiovascula r ,Yanbu H osp ital o f Nanhai District ,Foshan 528247,China) Abstract:Objective To i mprove and evaluate the method of establishing rat models of acu te myocardial ischemiareperfusion,which had high rate of success and survive.Methods 60Sprague Dawley rats were divided into three groups at random:con trol group,Sham group and improved myocardial ischemia/reperfusi on group.The successful rate and the effectiveness of each group were observed.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staining,myocardial enzyme spectrum and histology resul ts were used for evaluating the modified model.Results The successful rate of three groups were 90%,100%and 100%,respectively.The hemodynamics,eletrocardiogram,Evans blue and TTC staini ng ,myocardial enzyme spectru m and histology all tes tified that the models of modified method were results were successful.Conclusion The method of establish rat models of acu te myocardial ischemia reper fusion is simpleand convenient,with high successful rate and survival rate. Key words:Rats;Myocardial ischemia reperfusion;E xperimental animal models (Chin J Lab Diagn,2010,14:1163) 在动物体内阻断左冠状动脉前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在预定时间内恢复血供予以再灌注,是模拟人类缺血性心脏病恢复血供治疗必需的实验方法。由于大鼠在进化关系上比较接近人类,且其冠状动脉侧支循环少、心肌坏死出现早、心律失常发生率高、稳定性好,且大鼠制作模型费用低廉,从而成为制作心肌缺血再灌注损伤模型的首选,结扎大鼠LAD 形成心肌梗死是目前国内外公认的模型制备方法。但以往模型制备过程中存在诸多不便,如:手术时反复多次将心脏牵拉到胸腔外,造成动物死亡率增加,加大了实验成本,又加大了动物的创伤;阻断冠状动脉造成缺血后实现再通时,结扎线不易剪断,常导致左心耳破裂,引起心脏撕脱伤,造成大出血;文献报道冠状动脉的定位部位不一,会造成模型缺血损伤部位及损伤程度不一致等。参照不 同研究人员采用的模型制备方法[1],结合本实验室条件对该模型制作进行了改进,以提高模型制备成功率。现报告如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物与分组 清洁级SD 大鼠,体重220-260g,雄性,合格证号:SC XK(粤)2008-0020。由广州中医药大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为3组:假手术组(Sham 组),仅穿线,不结扎LAD;缺血组(Ischemia 组),单纯结扎LAD30min;缺血再灌注组(IR 组),结扎LAD30min,再灌注120min 。每组20只。 1.1.2 主要仪器和器械 动物呼吸机ALC V8(上海奥尔科特生物科技有限公司),澳大利亚产Power lab16导生理记录仪,无创缝合针(上海医菱医疗器械有限公司);黑色医用缝合线、lOml 一次性无菌注射器、各种手术器械,如止血钳、小无齿弯钳、小镊、小眼科剪等。 1163 中国实验诊断学 2010年8月 第14卷 第8期
题目：不同药物对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用 目的：观察抑制氧自由基生成药物（5-甲酰尿嘧啶）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察钙离子拮抗剂（硝苯地平）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 观察抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）对大鼠心缺血再灌注损伤的治疗作用。 原理：多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。 心缺血再灌注损伤是指心肌缺血后再灌注期间导致的心机细胞损害，其损害程度较心肌缺血本身严重，常表现为心肌细胞收缩功能减弱和心室顺应性改变，出现心律失常，心功能低下等现象。 心肌缺血再灌注损伤与氧自由基产生增多、钙超载、及白细胞的作用有关。 抑制氧自由基生成药（黄嘌呤氧化酶抑制剂——5-甲酰尿嘧啶）具有抑制氧自由基生 成的作用，减少氧自由基生成。钙离子拮抗剂（硝苯地平）可以阻断钙的慢通道，使细胞外钙的内流减少，从而降低胞浆钙离子，可起到减少MIRI的作用。抗脂质过氧化制剂（维生素C或维生素E）可以阻断脂质过氧化可1）抗白细胞粘附;（2）保护内皮功能;（3）抗血小板粘附、聚集及脱颗粒反应。有研究证实外源性维生素E可增加心肌梗死后大鼠血浆、心脏的维生素E含量，改善心功能，并减少大鼠的再灌注心律失常。 实验对象：大鼠4只，120-200g，体格健康雌雄不限。 器材和药品：手术刀，动脉夹4个，棉线，剪子，镊子2把，玻璃分针2个，注射器及针头2个，动脉插管器械，BL-420生物机能实验系统 药品：20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g，5-甲酰尿嘧啶注射液，硝苯地平注射液，维生素C或维生素E注射液，肝素。 方法步骤：1、大鼠心再灌注损伤再灌注模型的制备 （1）取大鼠，称重，用20%氨基甲酸乙酯0.5ml/g腹腔注射麻醉，仰卧位固定。 （2）1%肝素0.2ml/100g从尾静脉注射。 （3）前胸，上腹部剪毛，沿肋缘下剪开腹前壁皮肤皮下筋膜，肌肉，纵向剪开胸前壁和横向剪开胸前壁暴露心脏。 （4）经主动脉插管 （5）找到左冠状动脉用动脉夹夹闭1分钟。打开动脉夹，血液重新供应，用BL-420实验技能系统记录，观察心律心室内压等的改变。