蛋白质修饰位点分析
目录
实验目的 (2)
实验平台 (2)
实验过程 (3)
一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3)
1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3)
2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4)
3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)
（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6)
（2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11)
4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14)
二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15)
1、N型糖基化位点预测 (15)
2、O型糖基化位点预测 (18)
（1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18)
（2）真核生物O型糖基化位点预测 (20)
3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22)
4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22)
实验结论 (23)
（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录）
实验目的
●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，
并说明为什么（注释）
●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果
实验平台
●uniprot数据库: https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/(查看蛋白的修饰
情况)
●预测未知蛋白磷酸化位点
DISPHOS:https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/disphos/
PhosphoSitePlus:https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,
预测未知蛋白的糖基化修饰位点
N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/
http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY
ang/
实验过程
一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰
1、“人类connexin43”蛋白质序列下载
蛋白序列：fasta.txt
2、uniprot 数据库查看蛋白磷酸化位点
网站链接： https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/
3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点
网站链接：https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/disphos/
开始预测
结果
DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。
（2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点
网站链接：https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,
●开始预测
●结果
筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。
4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论
在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较
高的蛋白质，与机体的生物活性显著相关。
通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。
二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰
Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为：hemoglobin.txt
1、N型糖基化位点预测
网站链接：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
开始预测
结果
2、O型糖基化位点预测
（1）哺乳动物O型糖基化位点预测网站链接：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/
开始预测
结果
（2）真核生物O型糖基化位点预测
网站链接：http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/
●开始预测
●结果
蛋白质修饰位点预测详 解 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
蛋白质修饰位点分析目录
（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标 可以返回目录） 实验目的 找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说明为什么（注释） 找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) 预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus:
预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列： 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果
DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为：
蛋白酶酶切位点 木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素 胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写
名称三字符号单字符号 丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点 胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。
磷酸化蛋白的高效富集 在线酶解与快速鉴定 项目申请人：袁敏婷黄懿 指导教师：杨芃原 摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。 关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解 1.引言 蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。 蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。 在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析 摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。 关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites 1.前言 生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、
蛋白翻译后修饰(齐以涛老师) 上课老师没说重点 1.蛋白的概念:由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（ＰＰT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1．切除加工 2. 糖基化 3.羟基化 4.甲基化 5．磷酸化?６．乙酰化?7．泛素化 200. … ８.类泛素化?９.…? 磷酸化修饰 １.概念: 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的,至少有3０%的蛋白被磷酸化修饰 2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸,大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。
３.实例(MＡＰK途径): 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MＡＰＫK)、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶(MAＰKＫK)。在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPＫ级联系统(MAＰK casｃade），通过ＭAPＫＫK-MAPＫK－ＭAＰＫ逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MＡPKKＫ位于级联系统的最上游,能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?ＭAPKKK磷酸化后变为活化状态,可以使MAＰKK磷酸化 ?ＭAPKＫ始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将ＭAＰK激活 ?MAＰK被磷酸化后有3种可能的去向: (1）停留在细胞质中,激活一系列其它的蛋白激酶 (2)在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 (3)进入细胞核,通过磷酸化转录因子，调控基因的表达
组蛋白翻译后修饰的类型 组蛋白和组蛋白翻译后修饰通过影响染色质的结构来调控基因的表达，目前已成为表观遗传学研究的焦点之一。 染色质是一系列核小体相互连接成的念珠状结构。核小体的核心是由组蛋白H2A 、H2B、H3 、H4各两个分子构成的八聚体, 在八聚体的表面缠绕有圈的双螺旋DNA。相邻的两个核小体之间由DNA连接, 称为纤丝(fiber), 在纤丝部位结合有组蛋白分子H1。在组蛋白H1存在时,核小体之间紧密接触,形成直径为10nm的纤维状结构。这就是染色体构型变化的一级结构。在染色质中, DNA 和组蛋白是染色质的稳定成分,组蛋白与DNA的含量之比接近 1∶1 。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分,通过带正电荷的氨基末端区域与带负电荷的DNA骨架相互作用, 对基因的表达有重要调控作用。 染色体活性调控的一个重要的机制是组蛋白的可逆共价修饰，通常容易发生在组蛋白 H3和H4的N端尾部，组蛋白H2A和H2B的N和C末端，包括甲基化，乙酰化，磷酸化，ADP-核糖基化，泛素化和小分子类泛素化修饰，这些翻译后修饰可改变组蛋白与DNA之间的相互作用，影响调控复合物与染色质结合的能力及染色质重塑，进而影响着细胞的多种功能。 ⒈甲基化 组蛋白甲基化是由组蛋白甲基化转移酶（histonemethyltransferase，HMT）完成的。甲基化可发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，而且赖氨酸残基能够发生单、双、三甲基化，而精氨酸残基能够单、双甲基化，这些不同程度的甲基化极大地增加了组蛋白修饰和调节基因表达的复杂性。甲基化的作用位点在赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的侧链N原子上。组蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常见位点。研究表明·，组蛋白精氨酸甲基化是一种相对动态的标记，精氨酸甲基化与基因激活相关，而H3和H4精氨酸的甲基化丢失与基因沉默相关。相反，赖氨酸甲基化似乎是基因表达调控中一种较为稳定的标记。例如，H3第4位的赖氨酸残基甲基化与基因激活相关，而第9位和第27位赖氨酸甲基化与基因沉默相关。此外，H4—K20的甲基化与基因沉默相关，H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是，甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 ⒉乙酰化 组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。组蛋白乙酰化呈多样性，核小体上有多个位点可提供乙酰化位点，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录。早期对染色质及其特征性组分进行归类划分时就有人总结指出：异染色质结构域组蛋白呈低乙酰化，常染色质结构域组蛋白呈高乙酰化。最近有研究发现，某些HAT复合物含有一些常见的转录因子，某些HDAC复合物含有已被证实的阻遏蛋白。这些发现支持了高乙酰化与激活基因表达、低乙酰化与抑制基因表达有关的看法。 3.磷酸化 组蛋白H3在有丝分裂过程中，两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生了磷酸化作用。Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘，Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现，两个位点的磷酸化在中期到达高峰，并扩展到染色体的所有部分。当细胞有丝分裂进入后期和末期，组蛋白H3Ser28的磷酸化逐渐消退，而组蛋白H3Ser10磷酸化的荧光信号也逐渐从染色体上消失，此时在纺锤体中央部位出现Ser10磷酸化H3.研究结果表明，组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化与细胞有丝分裂染色体的凝集和解凝集过程有着时间和空间上的相关性。Ser10和Ser28这两个位点发生磷酸化作用，可使组蛋白H3氨基末端的正电荷数降低，改变了组蛋白一DNA间的相互作用，这可能是导致染色质变构凝集的原因之一。根据激光共聚
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910253412.9 (22)申请日 2019.03.29 (71)申请人 华中科技大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037号 (72)发明人 薛宇 宁万山 许浩东 邓万锟 郭亚萍 (74)专利代理机构 华中科技大学专利中心 42201 代理人 孙杨柳 曹葆青 (51)Int.Cl. G16B 15/20(2019.01) (54)发明名称 蛋白质编码方法及蛋白质翻译后修饰位点 预测方法及系统 (57)摘要 本发明公开了蛋白质编码方法及蛋白质翻 译后修饰位点预测方法及系统，属于生物信息学 领域。所述蛋白质编码方法包括收集修饰位点信 息、位置权重训练和待编码肽段的编码。蛋白质 翻译后修饰位点预测方法包括收集修饰位点信 息、特征编码、模型训练和蛋白质翻译后修饰位 点预测。本发明利用深度神经网络和惩罚逻辑回 归分别对不同类别的阳性位点和阴性位点的数 字向量特征构建预测模型，得到多个预测模型； 将每个预测模型的预测结果作为新的特征并利 用惩罚逻辑回归构建最终模型。本发明可以捕获 更多蛋白信息从而有助于提高预测的准确度， 可 以快速的大规模鉴定蛋白质修饰位点。权利要求书3页 说明书10页 附图3页CN 110033822 A 2019.07.19 C N 110033822 A
1.一种蛋白质编码方法，其特征在于，所述蛋白质编码方法用于表示待编码肽段与阳性数据集肽段的相似度，含有以下步骤： (1)收集修饰位点信息：首先收集蛋白质翻译后目标类型的修饰位点信息；将所述目标类型的修饰位点在蛋白质上的对应位点作为阳性位点，将该蛋白质上与所述阳性位点相同的其它氨基酸位点作为阴性位点；将蛋白质的一级序列切割成以所述阳性位点或阴性位点为中心，该中心上游为n个氨基酸，该中心下游为n个氨基酸，总长度为2n+1个氨基酸序列；所述n大于等于1；所有含有所述阳性位点的所述氨基酸序列构成阳性数据集，所有含有所述阴性位点的所述氨基酸序列构成阴性数据集； (2)位置权重训练：步骤(1)所述阳性数据集和阴性数据集中的每个肽段与阳性数据集基于位置权重和氨基酸替换得分的相似度打分的公式为： 其中：L为所述阳性数据集中每个肽段的长度2n+1；N为所述阳性数据集中肽段的数量；T ij 是阳性数据集中肽段T i 在位置j上的氨基酸，i的取值范围为1≤i≤N；P j 为肽段在位置j 上的氨基酸；M[P j ，T ij ]为氨基酸P j 和T ij 在BLOSUM62氨基酸替换矩阵中的分值；W j 为该肽段中位置j上的权重； 所述阳性数据集和阴性数据集中的每条肽段分别与阳性数据集中的每条肽段依次打分，其中肽段不与其自身打分，初始位置权重W j 为1，获得肽段中除中心位置以外的其它2n 个位置的得分；然后将该2n个位置的得分使用惩罚逻辑回归执行交叉验证，使AUC值最大的权重向量由肽段中各个位置上的权重W j 组成； (3)待编码肽段的编码： 待编码肽段与阳性数据集间的氨基酸对的平均相似度S为：其中：L是待编码肽段的长度，j为氨基酸所在位置，C j 为待编码肽段与阳性数据集间的任意一个氨基酸对在位置j上出现的次数，M为所述氨基酸对在BLOSUM62氨基酸替换矩阵中的分值，W j 为步骤(2)训练得到的待编码肽段位置j上的权重；待编码肽段与阳性数据集间的所有的氨基酸对的相似度得分构成该待编码肽段的数字向量特征。 2.多特征算法模型的蛋白质翻译后修饰位点预测方法，其特征在于，含有以下步骤： (1)收集修饰位点信息：收集蛋白质翻译后目标类型的修饰位点信息；将所述目标类型的修饰位点在蛋白质上的对应位点作为阳性位点，将该蛋白质上与所述阳性位点相同的其它氨基酸位点作为阴性位点；将所述阳性位点和阴性位点按照蛋白质所属物种进行分类；将蛋白质的一级序列切割成以所述阳性位点或阴性位点为中心，该中心上游为n个氨基酸，该中心下游为n个氨基酸，总长度为2n+1个氨基酸的序列；所述n大于等于1； (2)特征编码：将权利要求1所述的蛋白质编码方法以及其它的编码方案逐个对步骤 (1)所述总长度为2n+1个氨基酸的序列进行特征编码，得到数字向量特征，将所述数字向量特征分别利用惩罚逻辑回归、支持向量机和随机森林验证每种编码方案的AUC性能，将AUC 性能大于0.5的编码方案作为备用编码方案；挑选所述备用编码方案对步骤(1)所述总长度为2n+1个氨基酸的序列进行特征编码得到的数字向量特征； (3)模型训练：利用深度神经网络和惩罚逻辑回归分别对步骤(2)所述不同类别的阳性位点和阴性位点的数字向量特征构建预测模型，得到多个预测模型；将每个预测模型的预 权 利 要 求 书1/3页2CN 110033822 A
蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)
（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点， 并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/disphos/
PhosphoSitePlus:https://www.doczj.com/doc/5012975641.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：fasta.txt
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)
第４２卷第２期２０１９年６月一一一一一辽宁师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fL i a o n i n g N o r m a lU n i v e r s i t y ( N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n )一一一一一V o l ．４２一N o ．２J u n ．一２０１９一一收稿日期:２０１８Ｇ１２Ｇ２５基金项目:国家自然科学基金资助青年项目(３１３０１８８０);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(L J Q ２０１５０５７);大连市高层次人才创新支持计划项目(２０１５R ０６７)作者简介:李庆伟(１９５５Ｇ),男,辽宁大连人,辽宁师范大学教授,博士,．E Ｇm a i l :l i q w＠２６３．c o m 一一文章编号:１０００Ｇ１７３５(２０１９)０２Ｇ０２１５Ｇ０８一一D O I :１０．１１６７９/l s x b l k ２０１９０２０２１５ G P I 锚 一种复杂的蛋白质翻译后修饰李庆伟１,２,一宋一涛１,２,一勾一萌１,２,一滕洪明１,２,一卢佳丽１,２ (１．辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连一１１６０８１;２．辽宁师范大学七鳃鳗研究中心,辽宁大连一１１６０８１ )摘一要:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o t e i n s ,G P I ＧA P s )是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质,最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区,通过翻译后修饰产生的G P I 结构锚定在细胞膜上．G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇尾组成．核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷 酸肌醇残基可不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰．尽管被精确解析出的G P I 锚结构还较少,但已在分子水平上证明G P I 锚具有非常多样的生物学功能, 如信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反应等等．近年来,由于实验技术的进步,G P I 锚的相关 研究也在逐步深入．对G P I 锚独特的翻译后修饰及其功能的最新研究进行分析归纳．关键词:糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白;G P I 锚结构;G P I 锚功能; 信号传导中图分类号:Q ５３９一一一文献标识码:A 自１９８５年被发现以来,糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(g l y c o s y l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇa n c h o r e d p r o Ｇt e i n s ,G P I ＧA P s )是在真核动物中独有的蛋白质翻译后修饰,越来越受到人们的重视[１Ｇ７]．独特而复杂的翻译后修饰可通过糖基化磷脂酰肌醇结构[８Ｇ９],连接在某些缺乏跨膜结构域和胞质尾区的蛋白质羧基末端,从而将此类蛋白质定位在细胞质膜的胞外侧,最终在信号传导二细胞黏附二蛋白质转运和免疫反 应等方面发挥作用．不同于一般的翻译后修饰,G P I 锚结构复杂, 由磷酸氨基乙醇联结部二核心糖链和磷酸肌醇组成(图１),而核心糖链中的甘露糖二葡萄糖胺二磷酸肌醇残基还可以不同程度地被磷酸氨基乙醇和其他糖类修饰[１０Ｇ１１]．这种复杂结构决定了G P I 锚的功能并不局限于细胞质膜插入． 本文对近年来G P I 锚结构和功能的研究进行分析归纳． １一G P I 锚的发现２０世纪７０年代,从蜡状芽孢杆菌中分离出了一种磷脂酶,该酶可以从组织中释放碱性磷脂酶(A l k a l i n e p h o s p h o l i p a s e ,A P a s e )[１２],因此,这种酶被命名为磷脂酰肌醇Ｇ磷脂酶(P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l Ｇs p e c i f i c p h o s p h o l i p a s eC ,P I ＧP L C )．在之后的几年里,陆续有研究者发现,经过P I ＧP L C 处理后的小鼠组织,还可释放出５?Ｇ核苷酸酶[１３]和红细胞乙酰胆碱酯酶[１４]．人们开始意识到,某些蛋白是以共价键形式,通过磷脂酰肌醇结合在细胞膜表面的．直到１９８５年,G P I 锚定蛋白的基本结构才被发现[１５]．起初,受限于复杂的分离纯化过程,G P I 锚定蛋白鉴定的通量一直很低． 随着纳升液相二高分辨质谱等分析仪器的发展,以及蛋白序列数据库的完善,批量鉴定G P I 锚定蛋白也成了可能[９]．２００３年,J e n s e n 等[１ ６]
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。
蛋白翻译后修饰（齐以涛老师） 上课老师没说重点 1.蛋白的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合 物。 2.蛋白后修饰概念和意义（PPT4-5） 3.蛋白后修饰种类 1. 切除加工 2. 糖基化 3. 羟基化 4. 甲基化 5. 磷酸化 6. 乙酰化 7. 泛素化 8. 类泛素化 9. … 200. … 磷酸化修饰 1.概念： 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋 白的特定位点上的过程。大部分细胞过程实际上是被可逆 的蛋白磷酸化所调控的，至少有30%的蛋白被磷酸化修饰
2.作用位点： 丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸是主要的磷酸化氨基酸，大多数 磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是 可变的。 3.实例(MAPK途径)： 分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶（MAPKK）、分裂原活化的蛋白激酶的激酶之激酶（MAPKKK）。 在真核细胞中，这3种类型的激酶构成一个MAPK级联系统（MAPK cascade），通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去。 具体过程如下： ?MAPKKK位于级联系统的最上游，能够通过胁迫信号感受器或者信号分子的受体，或者其本身就直接感受胞外信号刺激而发生磷酸化?MAPKKK磷酸化后变为活化状态，可以使MAPKK磷酸化?MAPKK始终存在于细胞质中，MAPKK磷酸化以后通过双重磷酸化作用将MAPK激活
?MAPK被磷酸化后有3种可能的去向： （1）停留在细胞质中，激活一系列其它的蛋白激酶 （2）在细胞质中使细胞骨架成分磷酸化 （3）进入细胞核，通过磷酸化转录因子，调控基因的表达 4.功能和意义: 一：调节酶蛋白及生理代谢 ①糖分解代谢中糖原磷酸化酶活性的调节，被磷酸化的酶具有活 性，去磷酸化的酶无活性 ②磷酸化或去磷酸化使胞内已存在酶的活性被激活或失活，调节 胞内活性酶的含量 二:调节转录因子活性 转录因子通常包含DNA结合结构域和转录激活结构域.转录因子在转录激活结构域或调控结构域发生磷酸化，直接影响其转录活性. c-Jun转录激活结构域的两个丝氨酸残基磷酸化，正调控c-Jun的转录活性. 三：调节转录因子核转位 ?TGF-b与其I型、II型受体结合，结合后的TGF-b I型受体识别R-Smad包括Smad2和Smad3，作用于C末端的丝氨酸使其磷酸化而被激活，激活后的R-Smad与Smad4结合转入细胞核内，发挥转录调节活性 ?NF-kB与其抑制因子IkB形成复合体时存在于胞质。当IkB磷酸化、
Hans Journal of Computational Biology 计算生物学, 2018, 8(1), 24-32 Published Online March 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/journal/hjcb https://https://www.doczj.com/doc/5012975641.html,/10.12677/hjcb.2018.81004 Identification of Protein Phosphorylation Sites by Diversity Increment Feature Selection Technique Shisai Hu, Zhen Liang, Yuxiang Chen, Ying Zhang*, Jun Lv* College of Science, Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia Received: Apr. 25th, 2018; accepted: May 15th, 2018; published: May 22nd, 2018 Abstract Phosphorylation is one of the most important protein post-translational modifications and plays important roles in numerous biological processes by significantly affecting proteins’ structure and dynamics. The development of computational biological methods for the accurate identification of phosphorylation sites helps to our understanding of key signal transduction mechanisms. In this paper, a kinase independent phosphorylation site identification model was presented, called FSID_PhSite. The model is featured by component of k-spaced amino acid pairs and the position conservation of residues surrounding the phosphorylation sites. Applying diversity incremental feature selection technique to feature selection and inputting the selected features into the sup-port vector machine algorithm for recognition, when the ratio of positive and negative samples is 1:1, on independent testing dataset validation, the accuracy of identification for serine, threonine and tyrosine sites is 84.34%, 82.32% and 68.89%, respectively. The results were superior to the existing kinase independent phosphorylation sites identification model. Keywords Protein Phosphorylation Site, Feature Selection Based on Increment of Diversity, Support Vector Machine 用多样性增量特征选择技术识别 蛋白质磷酸化位点 胡世赛，梁珍，陈宇翔，张颖*，吕军* 内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特 *通讯作者。