实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察
一、实验原理
简单染色采用一种染料对菌体进行染色，常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。染色后，菌体与
背景形成鲜明对比，在显微镜下很容易被识别。通过简单染色方法可以观察细菌的菌体形态特征和菌
体的排列方式。 观察菌体形态 简单染色 （只用一种染料）
观察菌体排列方式
染色方法 革兰氏染色
鉴别
鉴别染色 抗酸性染色
（利用两种染料） 芽孢染色
观察特殊结构 荚膜染色
鞭毛染色
二、实验步骤：
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
三、思考题
1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？
答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；
取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细
胞个体形态
同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。
（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；
（3）干燥固定：否则细胞会破裂或变形； （4太长，否则菌体形态则会发生改变。
（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜
部位，水流不宜过急，过大，至流出水无色为止；
2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？
答：使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，
而且会提高了分辨率。
若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N会减小，分辨率D也会变小。而且还会造成油水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。
3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样呢？
答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。
（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。
4、为什么细菌染色常用碱性染料？什么情况下用酸性染料？
答：（1）细菌染色常用碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
（2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
实验二细菌的革兰氏染色法
一、实验原理
革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一。通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌(G-)。
G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同。
①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物。
②乙醇脱色：细胞壁较厚结晶紫与碘液复合物留在细
G+
肽聚网层次多和交联致密且不含类脂
细胞壁较薄结晶紫与碘复合物溶出，细
G- 胞壁退成无色
肽聚网层薄和交联差，外膜层类脂含量高
③番红染色：G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。
二、实验步骤立即水洗干燥
结晶紫碘液：紫色：蓝色
菌体紫
初染媒染：红色
1、涂片：
芽孢杆菌与右边的水滴充分混合，将左、右方的菌液延伸与玻片中央，使大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在玻片中间区域相互混合成含有两种菌的混合区。
2、干燥：涂片在空气中干燥
3、固定：手持载玻片一端，有菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。注意用手指触摸载玻片反面为不烫为宜。冷却。
4、染色：滴加结晶紫染色液于菌膜部位，覆盖菌膜，染色1~1.5min。
5、水洗：斜置玻片倾去染色液，用水自玻片上端缓慢冲洗。注意勿使水流直接冲洗菌膜部位。
6、媒染：滴加碘液于菌膜部位，覆盖菌膜，放置1~2min。
7、水洗：同上
8、脱色：斜置玻片，自标本的上端缓慢滴加95%乙醇脱色，直到留下的酒精无明显的紫色为止。脱色是革兰氏染色中的关键一步，注意不要脱色过度。
9、水洗：同上
10、复染：滴加番红染色液，染色1min.
11、水洗并用吸水纸自载玻片边缘轻轻吸去多余水分。
12、镜检。
三、思考题
1、什么是鉴别染色？有何优点？
答：（1）鉴别染色是指至少使用两种不同颜色的染色剂进行染色。
（2）优点：可以区分不同类别的菌种；可以很好地观察菌体结构；
2、革兰氏染色法中初染、媒染、脱色、复染的目的是什么？
答：初染：利用结晶紫初染使所有细菌都着上蓝紫色。
媒染：利用碘液作为媒染剂，碘会与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强染料在菌体中
的滞留能力
脱色：用95%乙醇作为脱色剂，根据G+和G-细胞壁机构和化学组成的差异，G+的肽
聚网孔会收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，而G-中原先滞留的
碘-结晶紫
复合物容易被洗脱下来，菌体变无色。
复染：用番红作为复染剂把洗脱的G-染成红色，而G+仍为蓝紫色。
3、革兰氏染色反应的关键步骤是什么？为什么？
答：革兰氏染色反应的关键步骤是脱色；
①若脱色不够的话，则大肠杆菌中的碘-结晶紫复合物不能被洗脱下来，或无法完全被洗脱下来，那么之后用番红复染时不会变成红色，而是呈紫色，造成大肠杆菌的假阳性。
②若脱色过度的话，则金黄色葡萄球菌中的碘-结晶紫复合物也会被洗脱下来，那么之后用番红复染细胞呈红色，造成金黄色葡萄球菌的假阴性。
实验五酵母菌形态的观察
一、实验原理（略）
二、实验步骤
1、酵母个体形态与出芽繁殖
接种与培养制片观察
2、假菌丝形态
接种与培养制片
3、酵母细胞的死活染色鉴别
涂片、染色观察
三、思考题
1、显微镜下观察的酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同?
答：（1）细菌是一类细胞细短的原核生物，一般直径约为：0.5μm，长度约为：0.5~5μm。
显微镜下观察的细菌个体形态基本上是球状、杆状、螺旋状三大类，仅少数为其他形状，如丝状、三角形、方形和圆盘形等；
（2）酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，是典型的真核生物，在显微镜下观察的酵母菌个体形态通常是有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等。
2、美蓝色染色液染色时间对酵母菌死活细胞数量有何影响？试对所得的结果进行分析和讨论。
答：美蓝染色液染色时间越长，酵母菌死细胞数量越多，而活细胞数量越少。
实验六霉菌形态的观察
1、试分析Subouraud 琼脂培养基的优点？
答：①pH偏酸性，适合霉菌生长；
②氯霉素可抑制细菌的生长；
2、载片培养法中“U”形玻璃棒和培养皿底部的滤纸上加入适量灭菌水的目的是什么？除了加灭菌水之外，还可以加入什么溶液？
答：①目的是保证培养皿内适宜温湿度；
②还可通过无菌操作在培养小室中园滤纸片上加3至5ml灭菌的20%的甘油。
3、载片培养还适宜哪些微生物进行形态观察？
答：载片培养还适宜培养放线菌、假丝酵母等分枝丝状体进行形态观察。
4、为什么载片培养所用的材料均要灭菌？
答：载片培养所用的材料如不灭菌，则极易引入杀菌，当接种到培养基上时，很有可能会影响霉菌的生长，而且也会影响到后期的显微观察。
实验七微生物测微技术
一、实验原理
显微测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合使用的部件。
镜台测微尺总长1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100 个小格，每一小格长度为0.01mm。
目镜测微尺分50小格和100小格两种。
二、实验方法和步骤
目镜测微尺放置目镜测微尺的标定酵母菌大小的测定将镜台测微尺用擦镜纸擦拭干净，放进盒子里保存，同时正确清理和维护显微镜。注：放置镜台测微尺时有刻度的一面朝上；目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行；使两尺左边某一区域内两线完全重合后找出右边另外相重合的线，分别数出两重和线。
目镜测微尺每格长度（um）=重合线间镜台测微尺格数*10/重合线间目镜测微尺格数
三、思考题
1、为什么使用不同放大倍数的目镜或者物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？
答：因为目镜测微尺在不同放大倍数的目镜和物镜下的大小是不一样的，也就是比例不同，所以要重新校正。
2、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？为什么？
答：相同。因为同一菌体的大小是一定的，不同放大倍数的物镜不会改变菌体的实际大小，但物镜的放大倍数越高，目镜测微尺的精确度越高，测量月准确。
3、测量菌体大小时对菌龄有无要求？为什么？
答：有要求。因为菌在不同生长时期细胞大小有时会有较大变化，若需自己制样进行细菌大小测定时，应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料。
实验八微生物技术技术-血球计数板法
一、实验原理
测定细胞数目的方法有直接计数法（如血球计数板计数计数）和间接计数法（如平板菌落计数法）
显微镜计数的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。
其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞，霉菌孢子等计数。
二、实验方法和步骤
1、镜检计数板的计数室（在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗）
2、加样品(菌悬液需摇匀）
3、计数(加样后静置5min）
4、清洗血球计数板
注：1、活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数时应适当减低视野亮度以增大反差；
2、进行显微计数是应先在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至视野中央，再换高倍镜观察计数。
3、酵母菌以每格5到10个菌体为宜。
三、思考题
1、用血球计数板计数时，哪些步骤容易造成误差？应如何尽量减少误差力求准确？
答：容易造成误差的步骤（1）计数室的清洗（2）加样时是否将菌液摇匀（3）计数
尽量减少误差的措施：
(1)加样前应先镜检计数室，若有污物则需清洗后镜检，直至计数室没有污物；
(2)加样前先摇匀菌液，因为放置一段时间的菌液其浓度是不均匀的；
(3)计数时先根据计数板的规格确定计数方法：记上不计下，记左不计右。
2、血球计数板计数有哪些缺点？
答：优点是直观、快速、操作简单，可直接观察到微生物的总数，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。
3、利用血球计数板计数时，注入的菌液为什么不能过多？
答：（1）注入菌液过多，会将盖玻片顶起而改变计数室的容积。
（2）注入菌液过多，也会使计数室中格线变得模糊，无法清楚的计数。
实验九培养基的制备与高压蒸汽灭菌
一、实验原理
培养基是人工配置的适合我微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大营养物质。一般培养细菌的常用营养琼脂培养基，放线菌常用高氏一号培养基，酵母菌常用麦芽汁培养基，霉菌常用马铃薯培养基（PDA）。
高压蒸汽灭菌：121℃，15-30min。
二、思考题
1、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多？
答：①分装量太多，三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底。
2、配置培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意什么问题？为什么？
答：（1）按培养基配方称取所需药品（2）加入少量水溶解（3）待完全溶解后加水补足至所需体积，调节PH（4）分装（5）灭菌
3、试分析培养基灭菌不彻底的原因。
答：（1）装有培养基的试管和三角瓶等在灭菌前没有包扎好；
（2）分装时培养基沾在管口；
（3）高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽，致使温度没有达到121℃；
（4）灭菌锅内物品装的太挤，妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果；
（5）灭菌锅内三角烧瓶与试管口与锅壁接触，冷凝水会淋湿包口的纸而透入棉塞；
（6）灭菌结束后，压力未降到0即打开排气阀，开盖取物。这时锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
4、举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养均？其PH值如何？答：细菌：营养琼脂培养基PH 7.0-8.0
放线菌：高氏一号培养基PH 7.5-8.5
酵母菌：麦芽汁培养基PH 3.8-6.0
霉菌：马铃薯培养基PH 4.0-5.8
5、在使用高压蒸汽锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？
答：（1）在灭菌前一定要检查灭菌锅中是否有水，若没有水或水不够要及时加水（最好是去离子水）否则灭菌锅可能会烧干而引起炸裂事故。
（2）灭菌结束后，注意压力一定要降到0，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因为锅内压力突然下降，使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出，造成棉
塞沾染培养基而发生污染，甚至灼烧操作者。
（3）灭菌时，旁边一定要有人观察灭菌锅是否处于正常使用状态。
实验十玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌
一、实验原理
干热灭菌的条件为：160~170℃，维持时间：1~2h ，适用对象：玻璃器皿、金属器皿机械和其他物品（如石蜡油）等的灭菌。
二、思考题
1在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
答：灭菌前：[1]电热干燥箱中玻璃器皿不要放置地过于紧密，否则会灭菌不够彻底
[2]开始灭菌，设定温度为160℃，当干燥箱中温度达到160℃时，灭菌1~2h
[3]注意干热灭菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故，灭菌时人不能离开
灭菌后：[4]不要立即打开电热干燥箱，否则会因为内外温差过大而引起玻璃器皿的破裂，灭菌结束后应先关闭电源，放置一段时间后再拿出。
2为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高，时间要长？
答：高压蒸汽灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。干热灭菌也是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的。细胞内蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，菌体受热时环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固就越快，反之含水量少，凝固慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度更高，时间更长。
3玻璃器皿为什么在干热灭菌前要先行干燥？
答：干热灭菌温度一般在160~170℃，若玻璃器皿上有过多的水，可能会引起炸裂。
实验十一微生物接种与培养技术
一、实验原理
只有一种微生物的培养物为纯培养，通常情况下只有纯培养物才能可以提供重复的结果，所以纯培养技术是进行微生物学研究的技术。接种时必须是严格的无菌操作，通常，斜面接种、固体接种、液体接种、穿刺接种均以获得良好的纯种微生物为目的。其中，穿刺接种可以检测出菌体是否有鞭毛以及哪个方向运动。
二、思考题
1、接种前为什么要灼烧接种环？
答：为了保证纯种微生物在接种过程中不被污染（接种前），以及实验操作用的微生物不污染周围环境（接种后），接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。
2、为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上冷却？如何知道接种环是否已经冷却？
答：若不冷却，会烫死菌种；不能直接放台子上冷却，会引入杂菌，若要冷却接种环可以将其在试管内壁上或者未长菌的培养基上接触一下。当无嗞嗞声或者培养基不熔化是接种环冷却。
3、若你接种的培养物出现杂菌，如何分析引起杂菌的原因？
答：①培养基及相关器皿是否灭菌彻底；②接种器具及接种环境是否干净；③接种操作是否正确规范；④接种后菌的培养是否正确。
4、斜面培养物出现水膜现象，请问如何避免水膜的行成？
答：①斜面培养基灭菌后经过干燥再用于接种；②接种后试管的塞子不要塞的太紧，以防灭菌后所余水及菌种生长旺盛生成的水留在试管内行成水膜。
5、为什么平板培养时需要倒置？
答：空气不易进入，从而不易引入杂菌，特别是在培养厌氧菌时，倒置可隔绝氧气的进入，从而可以使厌氧菌更好的生长。另外，平板培养时倒置可防止平板内
微生物进入周围环境中，从而污染空气，特别是一些致病菌。而且，若不倒置，会行成水膜，影响划线。
实验十二微生物计数技术——平板菌落计数法
一．思考题
1、为什么融化后的培养基要冷却到45℃左右才能倒平板？
答：温度过高会烫死菌种，温度过低则培养基会凝固，不利于培养基与菌液混合均匀
2、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪些关键？
答：（1）菌悬液细胞密度适宜，稀释倍数适宜；（2）吸样量准确；（3）混合均匀；（4）更换吸管；（5）加培养基时立即摇匀；（6）涂布均匀；
3当平板上的菌落不均匀而是集中的你认为问题在哪？
答：（1）涂布或倾注不及时；（2）涂布不均匀；（3）没有立即摇匀；（4）菌液过少不易涂布；
4、用平板倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同？为什么平板倾注要培养较长时间后观察结果？
答：（1）平板倾注法：菌落出现在平板表面及内部；涂布法：只在平板表面；（2）培养时间长，菌落的形态特征才明显，便于观察计数。
5平板计数的优缺点有哪些？
答：优点：可直接反映样品中活细胞数量；计数的线性范围大；菌落分布均匀，能较好的反映疏密程度，重复性强，平行性好。
缺点：操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素影响。
微生物实验思考题Last revision on 21 December 2020
微生物实验思考题1、用油镜观察时应该注意哪些问题在载破片和镜头之间加滴什么油起什么作 用 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油. 加滴香柏油。作用：增加,也就是增加了显微镜的分辨率. 2、根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进 行有效的观察。 答：细菌用油镜,真菌用高倍镜.都是先用低倍镜找到目标后,再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度. 放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大 40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大 1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 3、哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性其中最关键的环节是什么 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节。 4、进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出 现什么问题 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌。 5、革兰氏染色时，初染前能加碘液吗乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色
答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对实验结果造成影响。脱色后复染前，革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌无色。 6、不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 答：不行。在复染之前，革兰氏阴性菌是无色透明的，在显微镜下很难观察到；或者脱色过度，也会造成阳性菌脱色，不经过复染，无法进一步区别。 7、你认为制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节 答:1制备适宜的培养基 2在超净工作台上进行,保持无菌环境 3对培养基,接种环等物品的高温高压灭菌. 4倒置培养基,防止冷凝水内流 8. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察 答:1、若未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头。镜头非常精密,被污染后不利于下次观察；2、若未完全干燥，水滴会影响油与玻璃之间折光率，造成视野不够清晰。 9. 如果涂片未以热固定,将会出现什么问题加热温度过高、时间太长，又会怎么样呢答:如果没有加热固定的话，水分蒸发太慢或者在染色时菌体会被冲洗掉；如果加热时间过久，菌体变形或形态破坏，无法染色。 10. 制备培养基的一般程序是什么 答：称量——溶解—调 PH 值—融化琼脂—过滤分装—包扎标记——灭菌——倒平板11. 做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题 答：溶解配料的水要适量；PH 要调到左右；要小心手提式高压锅的使用；倒平板时要防止培养基被污染
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
（生物科技行业）微生物实验思考题参考答案及知识 要点
微生物实验思考题参考答案及知识要点 （可能在整理时部分问题未能考虑全面，若有异议，请同学们自行从网络或课本上搜索查找）微生物实验思考题参考答案 一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别 1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 美蓝浓度高了，代谢不太活跃的活细胞也会被染色，从而使观察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。 二.细菌的简单染色和革兰氏染色 1.革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？ 革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？ 自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。 3.不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？ 能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰
兽医微生物学实验复习题 1、兽医微生物实验室注意事项是什么？ 答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序 2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？ 答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。 3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？ 答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂， 4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？ 答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。 5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？ 答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。 6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？ 答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止 注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢 2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜 7、微生物绘图要求有哪些？ 答：①绘出一个视野，圆形。 ②细菌大小比例合理，必须标明名称。 ③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。 ④绘图一律用铅笔。 8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？ 答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。 9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。 注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。固定方法：火焰固定和化学固定。 10、细菌染色的原理是什么？ 答：细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 11、试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。革兰氏染色的原理是什么？ 答：原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈蓝紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
微生物实验思考题参考答案及知识要点 一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别 1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此,具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色,借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 美蓝浓度高了,代谢不太活跃的活细胞也会被染色,从而使观察到的死细胞较多,活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝,不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。 二.细菌的简单染色和革兰氏染色 1.革兰氏染色中那一步是关键？为什么？你是如何操作的? 革兰氏染色的关键步骤是:乙醇脱色(是脱色时间）。如果脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s)。 2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同? 自然死亡的菌体本身已经部分自溶,结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。 ３. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？ 能。在酒精脱色后,不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋),被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。 4．涂片为什么要固定,固定适应注意什么问题? a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上;b增加其对染料的亲和力。 固定时应注意：手持玻片,菌膜朝上,在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜),固定时应尽可能维持细胞原有形态,防止细胞膨胀或收缩。 三. 霉菌、放线菌的形态观察 1．镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？ 一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状,比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮,可看到横
名词解释： 微生物、微生物学、纯培养、纯培养物无菌技术、灭菌、消毒、过滤富集培养 简答题： 1、微生物的特点有那些？ 2、Mullis的贡献对我们有什么启发？ 3、列文虎克对微生物学有什么贡献？4 、巴士德和柯赫对微生物学的发展有什么贡献？5、柯赫证病律的具体内容是什么？6 、拂来明对微生物学的贡献是什么？7 、我国著名的微生物学家有那些？分别作出了什么贡献？8、干热灭菌和高压蒸汽灭菌有什么差别？9、举出几种常用的消毒药品和方法？10、纯培养有几种方法？11、为什么活菌记数和直接记数有很大的差别？12、按照功能和营养成分培养基有几种类别？13、菌种保藏的基本原理是什么？1 4、保藏微生物的基本方法有那些？1 5、已发现的微生物的形态有几种？1 6、芽孢杆菌和芽孢梭菌有何异同？1 7、举例说明非芽孢杆菌的特点？1 8、古细菌有那三大类？1 9、根霉、曲霉和青霉的形态特征如何？20、吃什么食用菌可以预防感冒？21、吃什么食用菌可以增加智力？22、原核微生物和原核微生物的主要类群有那些？23、球菌的基本形态有几种？24、细菌的基本结构组成有那些？25、细菌的特殊结构有那些？26、细胞壁及其功能是什么？27、肽聚糖的基本组成是什么？28、G+ 和G-细胞壁的结构有和异同？29、Gram染色的基本过程如何？30、细菌为什么可以分为G+ 和G-两种？31、无壁细胞有那几种？32、聚-B-羟丁酸有什么功能？33、气泡有什么功能？34、什么是糖被、根据物理特征不同可以分为几类？35、糖被的化学组成和功能是什么？36、鞭毛有何功能和种类？37、鞭毛的一般结构和基体的组成如何？38、什么是芽孢、有何特点？39、芽孢耐热的分子机制如何？40、为什么放线菌介于真菌和细菌之间而更接近于细菌？41、放线菌的繁殖方式有几种？42、在什么条件下使用火焰灭菌？43、稀释倒平板法和涂平板法有什么差别？
自来水大肠菌群的检测 ***1* （南京工业大学生物与制药工程学院南京 211800） 【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次 产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。 【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色 前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严 格的常规监测。但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培 养条件苛刻，分离鉴定比较困难。因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在， 并且检测方法简单。因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。 大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。该方法适用于各种水样，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。能产酸产气者说明水样中含有大肠杆菌群细菌。再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。平板分离试验是对于发酵乳糖产酸产气的阳性管用接种环以无菌操作技术取一环其中的培养物，在伊红美蓝平板做划线接种，培养。若菌落呈深紫红色，为典型的大肠菌落菌群；菌落为粉红色、粘液状、不透明，为非典型的大肠菌群菌落；否则其他特征菌落均为非大肠菌群菌落。因此，通过平板分离试验可进一步确认水样中大肠菌群细菌的存在。复发酵试验是取典型或非典型的菌落，进行革兰氏染色并镜检，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则再将其接种于乳糖蛋白胨培养基中，培养。如果产酸产气则证实存在大肠菌群细菌。 1、材料与方法 1.1材料 1.1.1实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。 1.1.2 培养基：乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨 2.0g、乳糖1.0g、牛肉膏0.6g、氯化钠1.0g、 1.6%溴甲酚紫溶液0.2ml、蒸馏水200ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管） 3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨0.75g、乳糖0.375g、牛肉膏0.225g、氯化钠0.375g、 1.6%溴甲酚紫溶液0.075ml、蒸馏水25ml、PH7.4。（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）
2013-2014（2）《食品微生物学与实验》思考题 期末考试题型： 1、单选题（四选一） 2、多选题（两个以上） 3、填空题 4、简述题 5、绘图说明题 6、试述题或分析题 第0章绪论 1. 概念： 细胞型微生物、非细胞型微生物、单细胞微生物、多细胞微生物、原核微生物、真核微生物、种、菌株、变种、型、模式种、柯赫原则。 细胞型微生物：具有典型的细胞结构，即细胞含有真正的细胞核，有核膜、核仁和染色体。 非细胞型微生物：没有典型的细胞结构、不具备代必须的酶系统、只能在各种活的细胞中生长繁殖，病毒就属此类。 单细胞微生物：仅由一个细胞构成的生物。 多细胞微生物：由许多形态和功能发生了分化的细胞群构成的生物。 原核微生物：具有细胞结构的微生物中，原核微生物是指一类不具有细胞核膜，只有核区的裸露DNA的原始单细胞生物，核区只有一条双螺旋结构的脱氧核糖核酸构成的染色体。 真核微生物：在微生物中，大多数种群具有真核生物(Eukaryotes)的细胞结构，即细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器这些微生物被称为真核微生物。 种：是分类单元的最基本单位，是显示高度相似性、亲缘关系极其相近、与其他种有明显差异的一群菌株的总称。 菌株：它是指来源不同的同一个种的纯培养物。 变种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，必须与文献上记载的典型种的特征完全一致，才能鉴定为同一个种。实际上有时分离到纯种，除了大多数指标符合典型种的特征外，还有某一个显然不同的特征，而此特征又是稳定的。就把这种微生物称为典型种的“变种”。 型：同一细菌种显示很小生物化学与生物学差异的菌株，常用于细菌中紧密相关菌株的区分。型是细菌亚种的细分。 模式种：微生物学中种带有抽象的种群概念，但在具体分类时常用一个被指定的、能代表这个种群的模式菌株或典型菌株作为该种的模式种来定种。它往往是定为一个新种的第一个种或第一批种之一，也可以是在某一已知数任意指定的种。 柯赫原则：对病原菌的研究证明了炭疽病是由炭疽菌引起的，结核病是由结核菌引起的，创立了确定某一微生物是否为相应疾病病原的基本原则——柯赫法则 2. 什么是微生物，它包括几大类群？其特点是什么？
第二章 1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？ 2、微生物的最显著特征就是个体微小，通常只能通过显微镜进行观察。试列举在显微观察中通过改变样品的反差以改善观察效果的技术及方法。 第四章： 试比较营养物质进入微生物细胞的几种方式的特点。 第五章 不同营养类型的微生物在不同条件下产生ATP和还原力的方式与特点。 第六章 细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同？ 其典型生长曲线可分几期，其划分依据是什么？ 第七章 思考题：试结合一步生长曲线分析病毒的特点，并与细菌进行比较。 第八章 1、如果二个不同营养缺陷标记（a - b - c + d + 和 a + b + c - d -）的菌株经混合后能产生在基本培养基平板上生长的原养型重组菌株，请设计一个实验来决定该遗传转移过程是转化、转导还是接合? 2、自然遗传转化与人工转化之间有什么关系?为什么在一般情况下它们转化质粒的成功率有如此大的差别? 第十章 1）基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及到微生物的参与？ 2）为什么说微生物学不仅为基因工程提供了理论基础，同时也提供了操作技术？ 第十一章 1）试论微生物与水体富营养化作用，你认为对此类污染该如何进行防治？ 2）试用一些典型例子说明微生物与生物环境之间的相互关系。 第十二章 1. 为什么能用生物大分子作为衡量生物进化的标尺？有哪些选用原则？建立16 S r RNA 系统发育树的意义何在？ 2. 为什么在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据？你知道有哪些项目已被用于细菌学分类和鉴定？
实验一显微镜的使用及微生物大小测定的方法 二、基本原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小. 两重合线间镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每格长度= 两重合线间目镜测微尺格数 思考题 1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 答（1）应先用摖镜纸将镜头摖干净，以防止实验的污染。使用油镜时，应先用低倍镜再用高倍镜，然后再是油镜，用完之后也要用摖镜纸将油镜摖掉。（2）滴加香柏油 （3）作用是增加折射率，即增加了显微镜的分辨率，油的折射率和分辨率成反比，同时与波长成正比。 2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：显微镜的分辨率指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小分辨距离越小，分辨率越高，最小可分辨率距离=λ／2NA且NA=n.sin,所以，分辨率由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，当然还有介质的折射率。 3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 答：不同放大倍数，目镜测微尺每小隔所代表实际长度不一样，必须用镜台测微尺进行重新校正，这样目镜测微尺测量的长度才是目前状态的准备长度。 4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？ 答：相同的，不同的放大倍数，目镜测微尺每小格所代表实际长度不一样，必须重新校正，才能得到目前状态的准确长度。 实验二显微镜直接计数法 二、基本原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），其优点是直观、快速、操作简单。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器及Hawksley 计菌器等。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。此法是将单细胞微生物的悬液或孢子悬液，注入血球计数板载玻片与盖玻片
《微生物学》复习大纲 一、考试性质 微生物学研究生入学考试科目是为我校招收微生物学硕士研究生而实施的水平考试，选拔具有较全面的微生物学理论知识和分析能力的学生。其指导思想是有利于国家对高层次人才的选拔，促进微生物学课程教学质量的提高。考试对象为2006年起参加我校硕士研究生入学微生物考试的考生。 二、考试基本要求 要求学生比较系统的理解和掌握微生物学的基本概念及基本理论，掌握各种微生物的形态、结构、功能及微生物的营养、生长、代谢、遗传育种等内容，能综合运用所学知识分析问题和解决问题。因此笔试内容包括具体实验方法等。 三、考试方法和考试时间 硕士研究生入学微生物学考试为笔试，总分150，考试时间为3小时。 四、参考书 《微生物学教程》第二版周德庆编高教出版社 《微生物工程》曹军卫马辉文编科学出版社 五、试题类型 1、填空题 2、是非与说明题 3、名词解析 4、问答题及论述题 六、考试内容、考试要求 第一部分微生物形态、结构与功能 掌握：微生物的概念及研究范畴；四大类微生物的基本形态特征（个体、菌落），细菌的基本形态、共同构造、特殊构造及功能，细菌的群体形态及繁殖方式；革兰氏染色的理论及实践意义；放线菌的形态构造、繁殖方式，放线菌的群体特征；酵母菌的特点、分布及与人类的关系，酵母菌的形态构造、繁殖方式与生活史，酵母菌菌落的特点；掌握霉菌细胞的形态构造、繁殖方式及菌落特点。 熟悉：，微生物对人类的影响及人类对它的认识，微生物学史中关键人物的贡献，微生物的五大共性与科研生产的关系； 第二部分病毒与亚病毒 掌握：病毒的特性、病毒的典型形态构造，噬菌体繁殖的几个阶段，噬菌体效价的测定，烈性噬菌体、温和噬菌体的概念，一步生长曲线的意义，噬菌体溶源性的概念，掌握噬菌体对发酵工业的危害与防治 熟悉：了解AIDS的相关知识，了解昆虫病毒用于生物防治的意义，了解病毒在基因工程中的应用 第三部分微生物的培养 掌握：微生物培养基的6大要素；培养基的设计原则，选择培养基、鉴别培养基的原理与实践意义；灭菌法的种类与应用；微生物生长量的测定方法，单细胞微生物的典型生长曲线，微生物连续培养的模式与优缺点，影响微生物生长的3要素在工业生产中的应用，微生物的实验室培养法 熟悉：微生物营养类型划分的依据和结果；高密度培养的方法和应用价值；了解化学杀菌剂、消毒剂、治疗剂的种类与应用。
实验一、微生物的简单染色思考题 1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 答：油镜在使用时必须在载玻片与物镜之间滴加镜头油。油镜使用过程中要注意两点：（1）、使用后镜头的清洁：镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度，用完油镜必须进行“三擦”（观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯（或者乙醇乙醚溶液）擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原）。 （2）、.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 2、使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 答：在使用普通显微镜时，当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 答：低倍镜视野比较大，能看到的范围大，容易找到观察的目标，然后在用放大倍数高的高倍镜或油镜有目的的观察。 实验二、革兰氏染色 （1）为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏染色？ 答：24h以内的菌体处于活跃生长期，菌体细胞壁具有典型特征，而处于老龄的革兰氏阳性细菌壁结构开始发生变化，染色时会被染成红色而造成假阴性 （2）要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？答：应注意如下几点： 其一，选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性； 其二，涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性； 其三，脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性 （3）当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 答：当要确证未知菌的革兰氏反应时，可用已知菌进行混合涂片，使二者染色条件保持一致，如果已知菌的结果与预期相符，则证明操作操作正确，结果可靠。 实验三、微生物的显微镜直接计数法 1、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？ 答：1）优点：直观、快速、操作简单。 2）缺点：
南京工业大学微生物实验自来水大肠菌群的检 测 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
自来水大肠菌群的检测 ***1* （南京工业大学生物与制药工程学院南京 211800） 【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次 产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。 【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色 前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严 格的常规监测。但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培 养条件苛刻，分离鉴定比较困难。因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指 标。大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在， 并且检测方法简单。因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。 大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。该方法适用于各种水样，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。能产酸产气者说明水样中含有大肠杆菌群细菌。再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。平板分离试验是对于发酵乳糖产酸产气的阳性管用接种环以无菌操作技术取一环其中的培养物，在伊红美蓝平板做划线接种，培养。若菌落呈深紫红色，为典型的大肠菌落菌群；菌落为粉红色、粘液状、不透明，为非典型的大肠菌群菌落；否则其他特征菌落均为非大肠菌群菌落。因此，通过平板分离试验可进一步确认水样中大肠菌群细菌的存在。复发酵试验是取典型或非典型的菌落，进行革兰氏染色并镜检，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则再将其接种于乳糖蛋白胨培养基中，培养。如果产酸产气则证实存在大肠菌群细菌。 1、材料与方法
食品微生物学技术思考题答案1.如何区别高倍镜和油镜 答：（1）油镜更接近标本片（2）油镜与标本间的介质是香柏油（3）油镜刻有“oil”或“Hi”字样，也刻有一圈红线或黑线为标记。 2．为什么在使用高倍镜及油镜是应特别注意避免粗调节器的错误操作答：使用高倍镜及油镜时镜头距离标片很近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的错误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3.用油镜观察时应注意哪些问题在载破片和镜头之间加滴什么油起什么作用 答：（1）应该先用擦镜纸将镜头擦干净，以防止上次实验的污染，操作时，先低倍再高倍，用完要擦掉油。（2）在转换油镜时，从侧面水平注视镜头注视镜头与玻片的距离。使镜头浸入油中而不以压破载玻片为宜。（3）从目镜内观察，把孔径光阑开到最大，使其明亮。然后用微调将镜台下降，直至视野内物象清晰。如油镜已离开油面仍未见物象，需重复操作。加的是香柏油。作用是增加折光率，增加显微镜的分辨率。 4.在调节焦距时，往往出现一些疑似观察标本的物象点，物象点可能是目镜或物镜上的杂质，也可能是标本片上的观察对象，如何通过操作判断这些物象点是否在标片上 答：移动标本片，看物象点是否移动，如果不移动，则不在标本片上。 5．如果涂片未经热固定或固定温度过高、时间过长，会出现什么现象答：固定时间是杀死菌体，使菌体蛋白质凝固黏附于载玻片上，增加菌体对染色剂的结合力，易于着色。但是如果没固定，不容易着色，且容易被清水冲走。
温度过高会使细胞收缩变形，时间过长会导致菌体变形或形态破坏，难以着色，从而导致难以着色。 6.为什么要培养18-24h的细菌菌体进行革兰氏染色 答:此时菌体进入比较活泼的繁殖生长期，细胞壁比较好着色。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应，关键在于细胞壁的通透性的改变。如果菌龄过老，不便于显微镜下观察时阴性还是阳性菌。 7．如何操作才能保证革兰氏染色结果正确，其中的关键环节是什么答：具体操作步骤为（1）涂片，与简单染色法相同，要求薄而均匀。（2）干燥、固定，在空气中自然晾干，或将涂面朝上，在酒精灯微小火焰上干燥；在酒精灯火焰上通过3-4次，温度不宜过高。（3）染色，用结晶紫进行初染1min,然后水洗。用碘液进行媒染，用碘液覆盖染色部位1min,水洗。在涂有细菌的部位连续滴加95%乙醇，约30s，水洗脱色。用番红溶液复染1min,水洗。（4）干燥，自然干燥或用吸水纸吸干，也可以用电吹风吹干。（5）镜检。 关键环节是酒精脱色。 8．为何常用插片法培养放线菌观察个体形态 答：放线菌的营养菌丝生长在培养基表面或插入培养基里面，不易被接种针挑取制片。采用插片法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长时期的形态。 9.在显微镜下，如何区分基内菌丝和气生菌丝 答：一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。 10.放线菌与细菌的菌落最显着的差异是什么
微生物学实验原理及思考题答案.txt铁饭碗的真实含义不是在一个地方吃一辈子饭，而是一辈子到哪儿都有饭吃。就算是一坨屎，也有遇见屎壳郎的那天。所以你大可不必为今天的自己有太多担忧。油镜便于观察的原理是什么? 用油镜观察时在油镜与载玻片之间加入了和玻璃折射率相近的香柏油，使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。 1.细调节器每旋转一周使镜筒上升或下降. 一。培养基的配制 原理：微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养物，为其生长发育提供所需营养的基质。培养基配制好以后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物实验。一次培养基的配制和灭菌是微生物实验室中最基本的操作，通过本次实验学习微生物实验室中常用培养基的配制方法和灭菌方法。 1.称药品的钥匙不要混用 称完药品应及时盖紧瓶盖，因为某些成分如蛋白胨极易吸水潮解 调PH时要小心操作，避免回调。 配制培养基应注意哪些问题？ 要选定合适的培养基;培养基成分要称量准确；PH要适宜；灭菌要严格。 培养基配制完成后为什么要立即灭菌？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？ 防止细菌污染培养基 一旦细菌污染了培养基，由于培养基有丰富的营养物质，细菌会段时间内大量产生 这样子就会跟培养物争夺营养物质，另一方面，细菌生长过程中会产生有毒物质致使培养物死亡。放在37℃的恒温箱中一两天后，培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见） 二。细菌的单染色技术 原理：单染色法师利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。 在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而使细菌着色。 制备染色标本时的注意事项？ 选择合适菌龄的细菌；固定时避免火焰直接烘烤破坏细菌形态；染色时间要适宜；水洗时水不能直接冲在涂片处。 制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？ 油和水之间会分层，油就不能与标本接触还有光会发生折射等等原因，这样不利于油镜观察三。细菌的革兰氏染色法 原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，为G+，有的可被脱去，为G-. 1.革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。脱色过度，阳性细菌被染成阴性细菌，脱色不足，阴性细菌被染成阳性细菌 涂片务必均匀，切忌过厚，以免脱色不彻底造成假阳性 要用活跃生长期的适龄菌，老龄菌因体内核算减少或菌体死亡，会使阳性菌被染成阴性菌，故不建议使用。 为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过24h？ 若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应,关键在于细胞壁的通透性的改变，使结晶紫染液可以脱色透出。
二. 细菌的简单染色和革兰氏染色 1.革兰氏染色中那一步是关键 ?为什么？你是如何操作的？ 革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误 认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。脱色时间 的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是 应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。 2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？ 自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。 3.不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？ 能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。 4.涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？ a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上； b 增加其对染料的亲和力。 固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过 3 次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三. 霉菌、放线菌的形态观察 1.镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？ 一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而 断裂成球状或杆状小体。 2.显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？ 放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。 细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。 霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。 四. 玻璃器皿的洗涤、包扎与灭菌 1. 高压蒸汽灭菌开始时为什么要将锅内排尽？灭菌后为什么要待压力降低到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物？
南京工业大学微生物实验课试题库及标准答案 选择题： 01.革兰氏染色的关键操作步骤是: A.结晶紫染色。 B.碘液固定。 C.酒精脱色。 D.复染。 答:(C) 02.放线菌印片染色的关键操作是: A.印片时不能移动。 B.染色。 C.染色后不能吸干。 D.A-C。 答:(A)。 03.高氏培养基用来培养: A.细菌。 B.真菌。 C.放线菌。 答:(C)。 04.肉汤培养基用来培养: A.酵母菌。 B.霉菌。 C.细菌。 答:(C)。 05.无氮培养基用来培养: A.自生固氮菌。 B.硅酸盐细菌。 C.根瘤菌。 D.A,B均可培养。 E.A,B,C均可培养。 答:(D)。 06.在使用显微镜油镜时,为了提高分辨力,通常在镜头和盖玻片之间滴加: A.二甲苯。 B.水。 C.香柏油。 答:(C)。 07.常用的消毒酒精浓度为: A.75%。 B.50%。 C.90%。 答:(A)。 08.用甲醛进行空气熏蒸消 毒的用量是: A.20ml/M3。 B.6ml/M3。 C.1ml/M3。 答:(B)。 09．高压蒸汽灭菌的工艺条 件是: A.121℃/30min。. B.115℃/30min。 C.130℃/30min。 答:(A)。 10．巴氏消毒的工艺条件 是: A.62-63℃/30min。 B.71-72℃/15min。 C.A.B.均可。 答:(C)。 11．半固体培养基的主要用 途是: A.检查细菌的运动性。 B.检查细菌的好氧性。 C.A.B.两项。 答:(C)。 12．半固体培养基的琼脂加 入量通常是: A.1%。 B.0.5%。 C.0.1%。 答:(B)。 13.使用手提式灭菌锅灭菌 的关键操作是: A.排冷气彻底。 B.保温时间适当。 C.灭菌完后排气不能太快。 D.A-C。 答:(A)。 14．目镜头上的"K"字母表 示: A.广视野目镜。 B.惠更斯目镜。 C.补偿目镜。 答:(C)。 15.目镜头上的"P"字母表 示: A.平场目镜。 B.广视野目镜。 C.平场补偿目镜。 答:(A)。 16.物镜头上的"PL"字母表 示: A.正低相差物镜。 B.正高相差物镜。 C.负高相差物镜。 答:(A)。 17.物镜头上的"UVL"字母 表示。 A.无荧光物镜。 B.照相物镜。 C.相差物镜。 答:(C)。 18．镜头上标有"对C"字母 的镜头是: A.相差调整望远镜。 B.摄影目镜。 C.相差目镜。 答:(A)。 19．"PA"表示: A.马铃薯培养基。 B.高氏培养基。 C.肉汤培养基。 答:(A)。 20.无菌室空气灭菌常用方 法是: A.甲醛熏蒸。 B.紫外灯照射。 C.喷石炭酸。 D.A.B.并用。 答:(D)。 21.干热灭菌的关键操作 是: