绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌Y13 UV在油茶体内的定殖金勤;朱丹雪;周国英;李河;何苑皞;张茜
【摘要】[目的]枯草芽孢杆菌Y13 UV对油茶炭疽病具有良好的防治效果,研究其
在油茶体内的定殖动态,为油茶炭疽病的防治提供依据.[方法]通过原生质体转化法
引入绿色荧光蛋白质粒,构建荧光标记菌株.通过喷叶、灌根、喷叶灌根结合处理多
种接种方式及重复接种,测定菌株在油茶体内不同组织部位的定殖数量,分析其定殖
规律及能力.[结果]标记菌株可以在油茶根、茎和叶内定殖,单次接种当天,根内回收
的标记菌株数量为1.07×105 cfu·g-1;喷叶灌根结合处理7天后,油茶根、茎和叶内标记菌株的数量分别为8.70×102、5.00×102和7.30×102 cfu·g-1,均高于喷叶、灌根单独处理.重复接种时,油茶根茎叶内标记菌株的定殖量在接种3~5天内达到高峰,然后呈现稳定趋势,20天时定殖量开始大幅下降,第30天喷叶灌根处理的油茶根内的定殖量仅为5.30×102 cfu·g-1.荧光标记菌株生长较好,稳定表达,对炭疽病菌
具有良好的抑制效果.[结论]枯草芽孢杆菌Y13 UV能通过喷叶灌根方式接种在油茶体内定殖并传导,有较好的定殖能力.%[Objective]Bacillus subtilis Y13 UV can control Colletotrichum gloeosporioides effectively. Studying its colonization dynamics could provide a scientific basis for controlling C. gloeosporioides. [Method]The GFP plasmid was introduced into cells by protoplasts conversion and to acquire GFP-tagged Y13 UV . Camellia oleifera plants were inoculated with the GFP-tagged Y13UV with different methods including foliar spray,root irrigation,foliar spray plus root irrigation, and single or multiple inoculations. The population numbers of GFP-tagged Y13 UV in different tissues of Camellia oleifera were quantified after inoculations to test the colonization ability of the GFP-tagged strain.
[Result]GFP-tagged Y13UV could colonize in root,stem and leaf tissues of Camellia oleifera. In the same day after single inoculation,the population numbers of the marked strain in root were 1. 07 × 105 cfu·g -1. Seven days after inoculation by foliar spray plus root irrigation,the population of marked strain in root,stem and leaf tissues of Camellia oleifera were 8. 70 × 102,5. 00 × 102 and 7. 30 × 102 cfu·g -1 ,respectively. And the population numbers were higher than inoculation by foliar spray or root irrigation alone. With multiple inoculations,the population numbers of the tagged strain reached their peaks about 3 -5 days after inoculation,the populations kept stable until they dropped dramatically 20 days after inoculation,. The population number of 30th day in root tissue of Camellia oleifera was 5. 30 × 102 cfu·g -1 when inoculated by foliar spray plus root irrigation. The results showed that GFP-tagged Y13UV grew
better,expressed stably and still had good inhibition to C. gloeosporioides. [Conclusion]After inoculated by foliar spray or root irrigation,GFP-tagged Y13UV could colonize and transfer in Camellia oleifera,and displayed good colonization ability.
【期刊名称】《林业科学》
【年(卷),期】2017(053)007
【总页数】7页(P111-117)
【关键词】绿色荧光蛋白;枯草芽孢杆菌;油茶炭疽病;定殖
【作者】金勤;朱丹雪;周国英;李河;何苑皞;张茜
【作者单位】森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点
实验室中南林业科技大学长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室中南林业科技大学长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室中南林业科技大学长沙410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验
室中南林业科技大学长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室中南林业科技大学长沙 410004;森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室中南林业科技大学长沙410004;湖南汽车工程职业学院株洲 412001
【正文语种】中文
【中图分类】S763.13
在油茶(Camellia oleifera)生产中，油茶炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)是一种最主要的病害，在各大产区普遍发生，造成严重的落叶、落果、落蕾，产量降低(杨华等， 2015)。目前，防治油茶炭疽病主要是采取化学
防治和生物防治手段(陈彧等， 2010)。但大量使用化学农药容易导致植物病原菌
产生抗药性，造成环境污染，引起人畜中毒等问题(周国英等， 2007)。国内外已
有不少关于生物防治植物病害的报道。周建宏等(2011)通过对40多种植物进行筛选，利用筛选出来的丁香(Syringa oblata)和黄苓(Scutellaria baicalensis)研制出了防治油茶炭疽病的纯植物源农药。宋光桃(2009)从油茶林土壤中分离出了对油
茶炭疽病具有拮抗作用的放线菌CF17。美国Agraquest公司(2001)将枯草芽孢
杆菌QST713制成生物杀菌剂，具有广谱性。
利用能够在寄主植物体内定殖的内生拮抗菌对病害进行防治具有独特的优势(杨光
道等， 2009)，实际应用中拮抗作用强并不一定是最好的生防因子，生防菌能否在
植株体内定殖才是取得防效的关键。研究内生细菌定殖的常用方法有同位素示踪法(葛银林等， 1995)、免疫学方法(刘云霞等， 1996)、抗生素标记法(吴蔼民等，2001)、荧光标记法(殷幼平等， 2010)。荧光标记中的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)荧光性能稳定、无需外源反应底物、对宿主细胞无毒
害作用、检测方便，成为研究微生物与宿主或环境互作的重要工具(王卿等，2015)。刘邮洲等(2014)发现绿色荧光蛋白基因标记的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在番茄(Lycopersicon esculentun)根际土壤中有一定的定殖能力，接种
30天后仍可检测到标记菌株。杜芳等(2015)研究了枯草芽孢杆菌Y10在白菜(Brassica rapa)根、茎及叶部组织的定殖情况，结果表明枯草芽孢杆菌在白菜体内有良好的定殖能力，且这种特性可能与其防治根肿病有关。Yang等(2013)将携带质粒gfpmut3a基因的穿梭载体pGFP4412 导入生防枯草芽孢杆菌中，通过浸种、蘸根以及灌根接种研究其在黄瓜(Cucummis sativus)根表的定殖，发现在根基部
和中部都有标记菌株聚集而形成膜状结构，在根的分叉和根冠处可观察到大量标记菌株。关于绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌在油茶体内定殖的研究，国内目前未见相关报道。
枯草芽孢杆菌Y13UV是本实验室经过诱变获得的优良菌株，本试验通过GFP标
记研究Y13UV在油茶体内的定殖及消长动态，为提高Y13UV防治油茶炭疽病效
果和制定施用方法提供理论依据。
1.1 供试材料
供试菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y13UV，本实验室分离、诱变保存。
供试质粒和内切酶： pHT315-GFP，高效表达绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌(Escherichia coli)一苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)穿梭载体，Hind Ⅲ
和XbaⅠ内切酶均由本实验室保存。
供试油茶苗：湘林210品种，2年生健康盆栽苗，购于湖南省林业种苗中心；长
势、苗高、大小一致。
1.2 GFP标记菌株Y13UV的构建及检测
参考陈燕红等(2014)的方法，本实验室自行构建标记菌株。
1.2.1 荧光显微镜检测挑取少许绿色荧光蛋白标记菌株菌体涂布固定，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测(激发光波长480 nm，发射光波长520 nm)，观察有无荧光
产生。
1.2.2 GFP标记菌株生长动力学测定挑取GFP标记菌单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、200 r·min-1培养24 h，按1%的接种量接种到100 mL新鲜的LB液体培养基中，每隔4 h测定OD600值。
1.2.3 GFP标记菌株抑菌活性测定采用平板对峙法：取炭疽病菌菌饼放在PDA平板中央，将GFP标记菌株接种至距离炭疽病菌1.5 cm处，置于28 ℃恒温培养箱中。待朝向标记菌株方向的病原菌菌落不再生长时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。
1.3 GFP标记菌株在油茶体内的定殖动态
1.3.1 单次接种监测GFP标记菌株在油茶体内的定殖动态采用喷叶法、灌根法和
喷叶灌根结合法接种标记菌菌悬液，浓度为3.2×108 cfu·mL-1，每处理3次重复，每处理100株，以无菌水处理为对照。喷叶法：用喷雾器将菌液均匀地喷洒到油茶叶片上，每株10 mL；灌根法：将GFP标记菌株菌液浇灌于油茶根部，每株
10 mL；喷叶灌根综合法：喷叶和灌根同时接种，分别为每株5 mL，共10 mL。分别于接种0，1，3，5，7天……对油茶根(主根与侧根混匀)、茎(茎下：地表
3～8 cm茎部；茎中： 8～13 cm茎部；茎上： 13～20 cm茎部)、叶(从上往下
不同部位的叶子混匀)进行取样回收，每处理随机抽取3株，每份组织样品0.5 g，直至回收不到标记菌株。
1.3.2 重复接种监测GFP标记菌株在油茶体内的定殖动态单次接种7天后，进行
第2次接种。采用的接种方法、菌液浓度及用量与1.3.1 相同。
分别于接种后1，3，5，10，15，20，30天对油茶根、茎、叶进行取样回收，每处理随机抽取3株，每份组织样品0.5 g，直至回收不到标记菌株。
1.3.3 标记菌株的回收与鉴定分别称取油茶苗根、茎、叶组织各0.5 g，经表面消毒后研磨成匀浆，分别取0.1 mL各梯度稀释液涂布LB氯霉素抗性平板，28 ℃培养2～3天，在荧光显微镜下观察荧光菌落数。用接种环挑取单菌落到10 ml LB 液体培养基中，37 ℃、180 r·min-1培养6 h，提取质粒，用HindⅢ和XbaⅠ从GFP两端切开验证回收的菌株是否为标记菌株。
1.4 数据统计分析
数据均为平均数±标准误差，采用Excel 2007和SPSS19.0软件处理，显著性水平采用Duncan’s新复极差法分析。
2.1 绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌Y13UV的构建及其检测
2.1.1 绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌Y13UV的荧光检测绿色荧光蛋白标记菌株构建好之后，挑取标记菌株于载玻片上涂布并固定，在荧光显微镜下检测到菌株发荧光(图1)，并将绿色荧光蛋白标记菌株记为Y13UV-GFP。
2.1.2 绿色荧光蛋白标记菌株Y13UV-GFP生长曲线测定从图2可以看出，绿色荧光蛋白标记菌株Y13UV-GFP的生长趋势与原始菌株Y13UV基本一致。这表明外源质粒的转入以及绿色荧光蛋白的表达对菌株Y13UV生长没有产生不利影响。
2.1.3 绿色荧光蛋白标记菌株Y13UV-GFP的抑菌效果测定从表1可知：标记菌株Y13UV-GFP和原始菌株Y13UV相比，对炭疽病的抑制效果无显著差异，因此Y13UV-GFP可以用来进行定殖动态和生防能力的研究。
2.2 标记菌株Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态
2.2.1 标记菌株的回收与鉴定从LB平板上挑取的Y13UV-GFP中提取出 pHT315-GFP(约7.2 kb)质粒，对质粒进行双酶切后可获得与GFP片段(约714 bp)长度相
当的片段。由此可以确定回收到的菌株是Y13UV-GFP。如图3： M为DL10000 marker，1为从回收菌株中提取的质粒pHT315-GFP，2为Hind Ⅲ和XbaⅠ双
酶切后的产物。
2.2.2 单次接种监测Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态如表2所示：灌根处理
当天，油茶苗根部能够检测到Y13UV-GFP，其定殖数量高达1.07×105 cfu·g-1。接种后第1天，在茎及叶组织可以检测到标记菌株；茎上部位及叶片，定殖数量
随时间递增逐渐减少。接种后第7天，叶片内定殖数量显著低于根部(P<0.05)；
并且回收的植株中，有的叶内已经检测不到标记菌株。表明Y13UV-GFP能够通
过油茶苗根部短时间内侵入并向上传递，但定殖时间有限。
喷叶处理后，根、叶片、茎下部位的Y13UV-GFP定殖数量呈现递减趋势。接种
后第1天叶内的定殖数量显著高于灌根处理(P<0.05)；茎上部位的定殖数量为
1.1×103 cfu·g-1，茎中部位仅有
2.1×102 cfu·g-1。在3，5，7天均出现了茎上部位的定殖量高于茎中，此现象在喷叶灌根结合处理后再次出现，且第7天回收
的大部分油茶苗叶片内检测不到Y13UV-GFP，说明通过叶部侵入的Y13UV-GFP 有一定向下传递的能力。
喷叶灌根结合处理后，接种后1天根部定殖数量为2.00×104 cfu·g-1，显著高于
灌根处理的数量3.00×103 cfu·g-1(P<0.05)；茎上部位的定殖数量高于茎中部位，此现象与喷叶方式处理相同。第7天根部定殖数量为8.70×102 cfu·g-1，仍然高
于灌根处理；叶内Y13UV-GFP定殖数量也高于喷叶处理的数量。
综合来看，3种接种方式下Y13UV-GFP定殖量存在显著性差异，喷叶灌根结合处理为最优接种方式。
2.2.3 重复接种监测Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态 1) 灌根接种标记菌株
Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态通过灌根处理，回收检测结果显示：在油茶
根茎叶组织中均可分离检测到标记菌株Y13UV-GFP，且根内的定殖量显著高于叶
(P<0.05)。在接种初期，根内的定殖量为3.73×103 cfu·g-1，高于茎和叶中的定殖量。随着接种时间的延长，在根中的定殖量逐渐下降，在30天时仅有
5.30×102 cfu·g-1。在茎的各部位(茎下、茎中、茎上)和叶中的定殖量呈现先上升后下降的趋势，茎下部位定殖量在第3天达到高峰，而茎中、茎上和叶的高峰期均为第5天。各组织中标记菌株的数量在第5～15天较为稳定， 20天后数量迅速减少。在第30天时，根内的数量高于茎内各部位和叶。
2) 喷叶接种标记菌株Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态采用喷叶法将标记菌株Y13UV-GFP接入油茶苗后，回收检测结果表明：在接种后第1天，标记菌株
Y13UV-GFP在油茶叶内的定殖数量为6.00×103 cfu·g-1，然后迅速下降；在无套袋处理、自然滴落的情况下，在接种1天后根部回收到的Y13UV-GFP数量为3.27×103 cfu·g-1，与灌根处理的油茶根部第1天的回收量基本一致。茎内各部位Y13UV-GFP的定殖量先增后减，茎下部的定殖量在第5天达到最大值
1.60×103 cfu·g-1，而茎中部和上部在第3天就达到最大值，3～10天茎上部位回收量均高于茎中部位。第30天时，根内的数量高于叶和茎内各部位；叶内
Y13UV-GFP的定殖数量为4.00×102 cfu·g-1，略高于灌根处理叶内30天的定殖量。
3) 喷叶灌根接种标记菌株Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态通过喷叶灌根接种处理，根内标记菌株的定殖数量高于喷叶或灌根单独处理的数量。在接种后第1天，根部标记菌株Y13UV-GFP数量达8.67×103 cfu·g-1，然后降低，第30天的数量与灌根接种处理的相同。茎各部位的定殖量呈现先上升后下降的趋势，高峰期分别为3天和5天。接种后1天，叶内Y13UV-GFP的数量较高，第3天有所下降，第5天出现第2次高峰，之后下降。第30天时，叶内的定殖量高于其他2种处理方式。
采用喷叶法、灌根法、喷叶灌根结合法3种接种方法接种，均能使标记菌株侵入
油茶根茎叶内，并在油茶植株体内繁殖和传导。单次接种时，3种接种方式下标记菌株的定殖时间短，不同接种方式的定殖量存在差异。重复接种使标记菌株在油茶体内的定殖时间长达30天，喷叶灌根结合处理30天后，根部定殖量为5.3×102 cfu·g-1，叶部为6.7×102cfu·g-1，茎各部(茎上、茎中和茎下)的定殖量均高于其他2种处理方法。经酶切鉴定分析，回收菌株均为标记菌株Y13UV-GFP。
王瑞芹(2014)用抗利福平标记Y13菌株，虽然抗利福平标记的菌株与绿色荧光蛋
白标记的菌株在油茶体内定殖没有显著性差异，但抗性菌株接种到植物后，部分菌株会因为在植物体内没有了选择压力而在增殖过程中丢失了抗利福平的能力(范晓静， 2007)，再者植物内生菌有些也可能对利福平具有抗药性，从而造成分离到的细菌数量不准确，绿色荧光蛋白基因标记就减小了分离菌量与实际定殖菌量的差异。研究中发现，单次接种时Y13UV-GFP定殖时间短，重复接种时叶部回收并未出
现5天和7天就已检测不到标记菌株的情况，由此猜想，重复接种的方式更易于
内生拮抗细菌对植株生境的适应并稳定定殖。重复接种延长了Y13UV-GFP在油
茶体内的定殖时间，也有报道(王卿等， 2015)指出强化接种1次可能会使生防菌
保持一定的种群优势，进而将可能对植物有较长的保护作用。彭袆等(2010)研究
发现多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)能在番茄根表面形成生物膜，国外也有研究(Timmusk et al., 2005)报道多黏芽孢杆菌可以在植物根尖形成生物膜，生
物膜所包被的细菌群体，对不良环境有较强的耐受力(Costerton et al., 1995)。至于枯草芽孢杆菌Y13UV是否能在油茶根部形成生物膜则有待进一步研究。
喷叶灌根结合处理30天后，叶片中的定殖数量比根部多，相比喷叶灌根单独处理的效果好。出现这一结果，笔者分析其原因可能是综合处理增强了菌株在叶内的定殖效果。叶内的标记菌株包括从根部进入并传递到叶片的标记菌株和直接从叶片侵入的标记菌株，更多的标记菌株与其他内生菌竞争生态位，在油茶体内繁殖，具有生长优势。针对此结果，笔者展开了后续试验，研究Y13UV菌株在油茶体内定殖
对叶内微生物的影响。
国内外研究表明，生防菌能否在植物体内有效定殖是其发挥防病作用的重要因素(Kloepper et al., 1981；连玲丽等， 2011)。本试验初步明确了Y13UV菌株能
够在油茶体稳定定殖，不同部位定殖量也有较大差异，这说明对特定部位有所偏好，可能与各部位分泌的营养物质有关(李世贵等， 2009；杜芳等， 2015)。本试验
也只研究了Y13UV-GFP在油茶体内的定殖动态，能否在其他植物体内稳定定殖，进而发挥防治效果，还需进一步研究，为大范围推广Y13UV提供依据。
将绿色荧光蛋白基因导入到枯草芽孢杆菌Y13UV中，标记菌株Y13UV-GFP在蓝光激发下可以发出强而稳定的绿色荧光、生长好、具有较好的抑菌效果。标记菌株可以通过灌根和喷叶的方式侵入油茶体内，并进行繁殖和传导； 20天后达到稳定定殖状态，定殖时间长达30天，为制定枯草芽孢杆菌Y13UV的林间施用措施提
供了理论基础。
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(Zhou G Y，Song G T，Li H，et al. 2007. Present Situation and Countermeasures to Control Camellia oliefera Pest and Disease. Journal of Central South University of Forestry & Technology，27(6)： 179-182. [in Chinese])
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(Zhou J H，Liu J A，Deng X J，et al. 2011. Inhibition effects of plant extracts against major diseases of Camellia oleifera. Journal of Central South University of Forestry & Technology，31(4)： 42-45. [in Chinese]) Costerton J W，Lewandowski Z，Caldwell D E，et al. 1995. Microbial biofilms. Annual Reviews in Microbiology，49： 711-745.
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绿色荧光蛋白标记枯草芽孢杆菌Y13 UV在油茶体内的定殖金勤;朱丹雪;周国英;李河;何苑皞;张茜 【摘要】[目的]枯草芽孢杆菌Y13 UV对油茶炭疽病具有良好的防治效果,研究其 在油茶体内的定殖动态,为油茶炭疽病的防治提供依据.[方法]通过原生质体转化法 引入绿色荧光蛋白质粒,构建荧光标记菌株.通过喷叶、灌根、喷叶灌根结合处理多 种接种方式及重复接种,测定菌株在油茶体内不同组织部位的定殖数量,分析其定殖 规律及能力.[结果]标记菌株可以在油茶根、茎和叶内定殖,单次接种当天,根内回收 的标记菌株数量为1.07×105 cfu·g-1;喷叶灌根结合处理7天后,油茶根、茎和叶内标记菌株的数量分别为8.70×102、5.00×102和7.30×102 cfu·g-1,均高于喷叶、灌根单独处理.重复接种时,油茶根茎叶内标记菌株的定殖量在接种3~5天内达到高峰,然后呈现稳定趋势,20天时定殖量开始大幅下降,第30天喷叶灌根处理的油茶根内的定殖量仅为5.30×102 cfu·g-1.荧光标记菌株生长较好,稳定表达,对炭疽病菌 具有良好的抑制效果.[结论]枯草芽孢杆菌Y13 UV能通过喷叶灌根方式接种在油茶体内定殖并传导,有较好的定殖能力.%[Objective]Bacillus subtilis Y13 UV can control Colletotrichum gloeosporioides effectively. Studying its colonization dynamics could provide a scientific basis for controlling C. gloeosporioides. [Method]The GFP plasmid was introduced into cells by protoplasts conversion and to acquire GFP-tagged Y13 UV . Camellia oleifera plants were inoculated with the GFP-tagged Y13UV with different methods including foliar spray,root irrigation,foliar spray plus root irrigation, and single or multiple inoculations. The population numbers of GFP-tagged Y13 UV in different tissues of Camellia oleifera were quantified after inoculations to test the colonization ability of the GFP-tagged strain.
PGPR在植物根际的定殖机理研究 摘要：随着人口速度的快速增长、环境的日益破坏，人类在面临粮食短缺的生存危机的同时，粮食安全问题也严重影响着我们的生活质量。农药、化肥的大量施用所带来的粮食高产，越来越引起人们的关注，思考如何在保证粮食高产的情况下，生产出健康的食品，成为近年研究的热点。生物防治在保护生态环境的同时，能够很好地把田间杂草、病害虫等除去，符合可持续发展的要求。植物根际促生菌（PGPR）通过在植物根际定殖，发挥防病、促生的作用。研究PGPR的定殖机理，对影响其定殖因素进行人为干预，使PGPR在根际定殖数量显著增加，从而获得粮食大丰收，具有很大意义。 关键词：粮食安全PGPR 定殖 根际是指受植物活根影响的土壤微区，它的范围是围绕根表面1～2mm厚的土壤。根据其对植物的作用，根际细菌(rhizobacteria)分为有益(2％～5％)，有害(8％～15％)和中性(80％～90％)3类。PGPR属于有益的一类，相对于PGPR，DRMO（DRMO=deleterious rhizosphere microorganisms）则是根际有毒有害的微生物。由于植物根系不断地分泌各种代谢产物，包括糖类、氨基酸、有机酸、脂肪酸和甾醇、生长素、核苷酸、黄酮、酶类以及其他化合物，为微生物提供营养；加上根表组织陆续死亡和脱落，改良周围土壤的物理和化学性质，丰富了土壤有机质，也为微生物的大量繁殖创造了条件，使植物根际具有很高的生物活性，因而植物根际是土壤微生物生活特别旺盛的区域根际中微生物的数量和活性远高于远离根的土壤，由于细菌对各种根分泌物的利用率及敏感性远远超过放线菌、真菌和原生动物等，因而在根际中占主导地位。PGPR作为对植物有益的微生物群体，对它的研究可以获得更大的生态、经济和社会价值。PGPR指的是植物根际促生菌，英文名称为Plant growth-promoting rhizobacteria，它是指能够促进植物对矿质营养的吸收和利用，或者产生促进植物生长的代谢物，甚至抑制有害微生物的根际细菌。一般具有固氮、溶磷、解钾能力，或能产生植物激素、分泌抗生素等功能的细菌、蓝细菌等。其具有的特色功能是防病、增产。这对于提高目前的粮食产量以及改善日益恶化的土壤环境具有重要的意义。正是由于PGPR的重要性，才吸引世界上各国的科学家对其争相研究。由于PGPR不是单独地生长在土壤中的，它是通过与植物的相互作用，即PGPR定殖到植物体上才能发挥其作用，因此，PGPR定殖机理的研究又成为研究的热点中的特点。关于定殖，不同研究者有不同的概念，有的学者将细菌能在植物根际建立相对大的群体的能力称为该菌的定殖能力[1]，另一些则认为定殖包括细菌在根际的移动、竞争力，也包括繁殖能力[2]。无论是何种概念，定殖都包括以下几个方面：一时能够在植物根际生存下来，二是能以植物根际作为细菌本身适合的环境繁殖，随着植物根系的发达而繁殖，通过与其他生物竞争而形成一个较大的群体[3]。 1 PGPR的研究背景 自从1978年Burr等人首先在马铃薯上报导PGPR以来，国内外已发现包括荧光假单孢菌、芽孢杆菌、根瘤菌、沙雷氏属等20多个种属的根际微生物具有防病促生的潜能，最多的是假单胞菌属(Pseudomonas)，次为芽胞杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、埃文氏茵属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巴斯德氏菌属(Pasteuria)、沙雷氏菌(Serratia)、肠杆菌(Enterobacter)等。国际上这一领域的研究非常活跃，每3年开一次国际性专业性研讨会议[4]。目前研究的促生PGPR主要有：芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、根瘤菌属、放线菌、木霉，可以看出细菌的研究最多。据统计，从
枯草芽孢杆菌的研究进展 摘要 枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的革兰氏阳性杆状细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋、动植物的体表，细胞壁不含内毒素，没有致病性，具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分泌到培养基中，是一些重要工业酶制剂的生产菌[1]。在营养缺乏的条件下，枯草芽孢杆菌停止生长，但同时加快代谢作用，产生多种大分子的水解酶和抗生素，并诱导自身的能动性和趋化性，从而恢复生长。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，具有较强的抗逆性。作为革兰氏阳性细菌的典型代表，对于其生理、生化、遗传及分子生物学的研究已有40多年的历史。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。 关键词：枯草芽孢杆菌；启动子；绿色荧光蛋白；载体；表达；异源基因 1 枯草芽孢杆菌基因组研究 枯草杆菌有以下一些优点: ①非致病性，不具有热源性脂多糖和细胞内毒素，具有较好的生物安全性，炭疽杆菌和蜡样芽孢杆菌除外，多数芽孢杆菌对人畜无害[2]；②遗传学特性先进，很多噬菌体和质粒适合于用作克隆载体；转化外源DNA的感受态系统也同样适用于转化重组DNA[3]。③较强的蛋白分泌能力，当分泌蛋白跨过细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中，使回收和纯化目的蛋白较为简单[4]。④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。枯草杆菌能在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。细胞的生长特性和生理学性质都被广泛、深入研究。⑤细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素（热源性脂多糖），而这一点是大肠杆菌无法比拟的。 2 枯草芽孢杆菌基因表达特性 2.1 多σ因子 原核基因的转录主要由RNA聚合酶完成。该酶由5个亚基组成，二个α亚基、一个β亚基、一个β′亚基和一个Sigma（σ）因子。5个亚基组成全酶，除去σ因子为核心酶（E）。σ因子的主要功能是帮助核心酶识别特定的启动子而结合到转录的起始部位，转录开始后σ因子就不起作用了［5］。 1
2019年度国家科学技术奖拟推荐项目公示表 一、项目名称：重要林木病害绿色药（菌）剂新产品研发与应用技术 二、提名单位及提名意见
三、项目简介 本项目属森林保护技术领域。 森林承载着国家生态安全、林业产业和景观文化等多项功能。我国人工林规模世界第一，松、杨、油茶等人工纯林，生态结构比较脆弱，但病害频发，具有爆发性和潜伏性，对森林生态和林业产业带来毁灭性破坏。林木病害专用绿色药剂匮乏，药剂使用技术单一，防控难度大。本项目围绕重要林木病害绿色防控的重大需求，研发了具有自主知识产权的4个绿色高效防控药剂新产品并完成了产业化，创制了系列林木健康生态调控的微生物菌剂，创建了精准、高效、安全的药剂使用技术，集成创新了以绿色药（菌）剂防控为核心的林木病害综合防控技术体系，实现了松材线虫病、杨树溃疡病、油茶炭疽病、山核桃干腐病的高效绿色防控，攻克了重要林木病害防控难度大的难题，推动了森林保护技术发展，对我国森林生态安全、食品安全和山区脱贫致富具有重要意义。 主要创新点体现在： ①研发了5%阿维菌素乳油和2.3%甲维盐微乳剂绿色注干药剂新产品，创新了基于药剂系统传导的注干施药技术，解决了爆发性重要林木全株性病害的绿色药剂防控难题。针对林木爆发性病害侵染途径复杂、施药困难大等问题，阐明了树木蒸腾作用驱动阿维菌素、甲维盐在树体内传导扩散和动态分布等规律，明确了基于快速传导、稳定长效的药剂形态，创制了5%阿维菌素乳油、2.3%甲维盐微乳剂等绿色注干药剂，完成了2个农药新产品登记和产业化，实现了松材线虫病等爆发性林木病害的高效绿色防控，扭转了过去依赖国外药剂的局面，提高了效果，降低了成本。 ②研发了0.3%四霉素水剂和50%喹啉铜可湿性粉剂绿色药剂新产品，创新了药剂成膜施药技术，解决了潜伏性重要林木病害绿色药剂防控难题。针对林木病害潜伏能力强、防控困难等问题，阐明了四霉素、喹啉铜等药剂在树干表皮成膜特征和渗透规律，明确了四霉素、喹啉铜等药剂抑制病菌孢子萌发扩散和深入皮层组织抵达靶向部位的作用机制，创制了0.3%四霉素水剂、50%喹啉铜可湿性粉剂等绿色药剂，完成了2个农药新产品登记和产业化，创新了树干喷药、涂抹成膜等实用技术，实现了杨树溃疡病、山核桃干腐病等潜伏性病害的高效绿色防控。 ③研发了高效防病促生的系列微生物菌剂，实现了林木病害长效安全防控和减药增效。建立了重要林木有益微生物资源库，获得了一批具有高效拮抗、稳定定殖、促进生长、诱导抗病、加快病斑愈合等功能的微生物菌株并阐明了其机理，创制了枯草芽孢杆菌Y13、多粘类芽孢杆菌CF05、放线菌J10、苏云金芽孢杆菌ZJ85等系列微生物制剂，建立了绿色、安全的林木健康生态调控新模式，实现了油茶炭疽病、山核桃干腐病病害长效防控和减药增效，提高了产品品质。 ④集成创新了以绿色药（菌）剂防控为核心的林木病害综合防控技术体系。形成了以绿色药（菌）剂防控为核心，以遏制病害流行关键环节为目标，以检疫检验、监测预警、绿色药剂防控、生态调控、技术规程为手段的“五位一体”林木病害防控技术体系，在多省市重要生态公益林、经济林以及重要风景区中完成了示范和推广应用，为森林病害绿色防控提供了典范。 项目历经20余年，在重要林木病害绿色防控方面获得了创新性、先进性和实用性成果，获得省部级一等奖2项，获得农药新产品登记4个，完成了产业化，近三年新增工业产值2.5亿元，新增税收4000余万元，授权发明专利25件，发表学术论文156篇，其中SCI收录44篇，专著2部。项目实施以来，推广总面积累计2800万亩次，挽回经济损失18.79亿元，实现生态和社会效益47.65亿元，保活了西湖、黄山、庐山、九华山等重点风景区的古松树，取得了显著的生态、经济和社会效益。
生防枯草芽孢杆菌Kct99的GFP标记及其在甘蓝根部的定殖 示踪 田兆丰;刘伟成;董丹;李永丹;张涛涛;刘德文 【摘要】Marked strain gfp-Kct99 with luminous phenotype fluorescent was obtained by transmitting plasmid pGFP4412 containing green fluorescent protein gene. The heredity test showed that the stability of plasmid pG-FP4412 in engineering strains was 89% ; The confrontation culture and pot experiment proved that marked strain gfp-Kct99 maintained the original antagonistic activity to cabbage fusarium oxysporium; The control efficiency of the marked and wild strains were 87. 7% and 90. 2% against cabbage wilt disease respectively when they were vaccinated 5 d ahead of pathogenic bacteria, no significant differences between the two strains, but significantly superior to that of the two treatments when the antagonistic and Pathogenic bacteria were vaccinated simultaneously or the antagonistic bacteria was vaccinated 5 d later. The results showed that the activity of the marked strain gfp-Kct99 a-gainst cabbage blight was not influenced by GFP marking. Observing by fluorescence microscope showed that the marked strain was able to colonize in the root skin of the cabbage to stop the invasion of the pathogen.%将含有绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412,电击转人生防菌株枯草芽孢杆菌Kct99,获得具有良好发光表型的荧光标记菌株gfp-Kct99.经稳定性测定表明,质粒pGFP4412在gfp-Kct99中的遗传稳定性为89％.平板对峙培养和温室盆栽接种试验显示,标记菌株gfp-Kct99对甘蓝枯萎病菌保持了原有的拮抗活性；
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的研究 进展 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究进展 生物技术 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.mylolique~aciens) 的研究进展 车晓曦1,2李校望 (1吉林农,I大学,长春130118;2教育部生物反应器与药物开发_丁程研究中心,长 春130118) 摘要近年对解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylolique~ciens)的研究与探索越来越多,由 于其自身具有广泛地抑制真菌 与细菌的能力,因而成为具有生物农药开发潜力的微生物.文章对近几年关于解淀 粉芽孢杆菌的新发现与新应用,基因 功能与分子研究方法的探索,发酵条件与培养基配方的研究进行了总结. 关键词解淀粉芽孢杆菌;新发现;新应用;基因功能;分子研究方法;发酵条件:发酵 培养基培养 中图分类号S182文献标志码B
TheResearchonDevelopmentofBacillusamylotiquefaciens CheXiaoxiLiXiaokun AbstractBacillusamyloliquefacienshadbeenresearchedandexploredmoreand morewidel ywiththeabilityto inhibitfungiandbacteriatherebyitbecomingapotentialmicrobialbio— pesticidesinrecentyears.Articleswas summarizedontheBacillusamyloliquefaeiensanewdiscovm~andnewapplicatio ns,genef unctionandmolecular researchmethodsofexploration,fermentationconditionsandmediumformulat ionoftheres earchinrecentyears. KeywordsBacillusamyloliquefaciens;newdiscovmT;newapplications;genefu nction;mo lecularresearch methods;fermeutationconditions:fermentationculturemedium 解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌.在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物.这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性因此,近些年大量学者在对解淀粉芽孢杆菌的新发现与新应用以及基因功能研究和发酵条件的优化做了大量的探索为了有利于后人对解淀粉芽孢杆菌进行研究.将近些年国内外的研究归结于下 1解淀粉芽孢杆菌新发现与新应用