单核细胞增生李斯特菌 形态特征： ①革兰氏阳性的类球形杆菌 ②大小约为0.4~0.5μm x 0.5～2.0μm ③两端钝圆 ④在有些培养基中稍弯，单个、成V形或成对平行排列 ⑤在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性 ⑥兼性厌氧，无芽孢，一般不产生荚膜 ⑦在20~25℃时以4根周毛运动，在37℃时只有较少的鞭毛或1根鞭毛 培养特性： ①需氧和兼性厌氧 ②生长范围为2-42℃ ③最适温度为35-37℃ ④pH中性至弱碱性（pH9.6） ⑤在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 ⑥在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 ⑦在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。
⑧在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 ⑨在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 生化特性：（甘露醇、木糖为阴性，其他为阳） 1.该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 2.发酵多种糖类，产酸不产气。 发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 3.不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 4.吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 5.MR-VP试验和精氨酸水解阳性。 生化试验： ①动力试验+ 原理：有动力的细菌扩散生长，培养基浑浊，无动力的细菌培养基澄清。（结果：有动力，呈伞状生长，底为弯月牙形）
食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析 发表时间：2019-10-30T11:36:20.520Z 来源：《健康世界》2019年13期作者：杨瑞娟 [导读] 结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。 云南省丽江市疾病预防控制中心 674100 摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。 关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法 连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。 1.材料与方法 1.1仪器和试剂 标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。每进行稀释一次菌液，都要换用1次1ml的无菌吸管[2]，依次稀释到10-9，将2ml菌悬液分别加入2个无菌平皿，将单增李斯特显色培养基放满平皿，培养24小时，温度控制在36℃，计数平皿中天蓝色、大小适中，周围有白色晕环的菌落数，作好空白对照。 1.2制备样品和检验样品 制备样品：从市场采集10份熟食制品，检验阴性结果使用细菌培养法，得出检验结果为阴性结果后，按照每份50g分为5份，分别加入每个标准菌液混合拍打，再取出样品25g，加入225ml混合搅匀。将剩余的25ml保存在冰箱中。检验样品：将LB1增菌液取出40ml保存在冰箱，剩余的LB1按照单增李斯特的检验方法用MPN计数法进行定量检测和细菌培养法检测。将LB1和LB2分别进行荧光定量RCR检测。按照2d至6d后，将样品进行MPN计数法定量检测。 1.3统计学分析 利用统计学软件SPSS20.0对数据进行统计并加强分析，用（x±s）表示计量资料，组间差异用t进行检验，用（%）表示计数资料，组间比较用X2检验，P＜0.05具有统计学意义。 2.结果 2.1比较两种方法检测结果 在研究中，样品增菌LB1经过24小时培养和LB2经过18小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法检测。在10-7细菌培养法和PCR法LB1增菌培养比较时，10-7具有统计学意义（P<0.05）。细菌培养法和PCR法LB2增菌培养后进行比较，差异不具有统计学意义 （P>0.05），具有可比性。 2.2不同时间MPN计数法检验结果比较 经检测，加标识的样品定量检测同时进行MPN计数法定量检测，2d后用冷藏的LB1增菌液定量检测结果和MPN定量检测结果一致，6d 后冷冻加标样品和冷冻6d后重新取样定量检测的结果有差别，差异具有统计学意义（P<0.05）。 表1比较两种方法检测结果（x±s） 3.讨论 利用实时荧光定量PCR法检测单增李斯特具有准确性和快捷性。国标中单增李斯特菌常用的三种检验方法为单核细胞增生李斯特氏菌定性检验、单核细胞增生李斯特菌MPN计数法和单核细胞增生李斯特菌平板计数法[3]，主要通过制备培养基、处理样品增菌和生化试验等，用时较长，分离培养受到多种因素的影响。实时荧光定量PCR法是利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过标准的曲线对未知模板进行定量分析，有效解决PCR污染问题，使结果更加直观明确。 在本次检测中，实时荧光定量PCR法优于细菌分离培养法。样品增菌LB124小时和LB218小时培养后，分别进行实时荧光定量PCR法
食品中单增李斯特检测技术 李斯特氏菌属包括七个种： 单核细胞增生李斯特氏菌 绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 默氏李斯特氏菌 其中单核细胞增生李斯特氏菌对人类致病性强，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定的致病性，其余李斯特氏菌无致病性。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。
它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх 1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状。 兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性。 该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2－5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8－4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。 在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 发酵多种糖类，产酸不产气。 如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes） 荧光定量PCR检测试剂盒说明书 规格：48份/盒 用途：单核细胞增生李斯特氏菌PCR体外检测。 检测原理： 试剂盒中含有单增李斯特氏菌特异的引物，当样品中含有单增李斯特氏菌时，前增菌后提取的单增李斯特氏菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中单增李斯特氏菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交,同时被Taq酶水解,把探针上的荧光基团和淬灭基团分开,从而通过荧光增量来实时判断单增李斯特氏菌的存在。 产品盒组成： 试剂盒的保存条件及有效期： 1．本试剂盒于-20℃保存。 2．有效期为6个月。 适用仪器： ABI7500，9600系列，MJopticon2，Bio-Rad等荧光定量PCR仪均可。 实验方法： 1．取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；采纳经典酚氯仿提取法，将提取到的模板进行检测或保存于-20℃以待检测。 2．将PCR反应液置室温平衡，融化后取Taq酶,按2U/管加入Taq酶，即每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.5ul+0.4ulTaq 酶。 3．加入模板：将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min。阴、阳性对比使用前置室温解冻。在每个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的模板或阴、阳性对比各2ul，盖好管盖，置于PCR仪上，记录相应样品号。 4．上机扩增、检测区：反应条件为95℃：3min，1个循环；95℃：5sec，60℃：40sec〔信号采集〕，40个循环。反应体系设为25ul。 关于多通道荧光PCR仪，信号采集时设定为Fam荧光素。 结果分析： 关于MJOpticon2系列荧光定量PCR检测仪进行结果分析时，扣除本底后再输入1-15之间的荧光值，进行Ct值的设置或拖动基线到合适的位置以确定ct值。 关于ABI7500，9600系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线的确定：取3-10或3-15个循环的荧光值，阈值设定原那么为阈值线刚好超过正常阴性对比品扩增曲线的最高点，而不显示Ct值为宜。 质控标准： 本试剂盒灵敏度为100拷贝/ml。定量检测线性范围为：10-1010拷贝/ml。 阴性对比无Ct值显示或Ct值为40，阳性对比的Ct值≤30.0，否那么为实验失败。 结果判断： 1．检测样本Ct值≤35.0时，报告阳性。 2．检测样本Ct值>35.0且Ct值<40时，需重复检测一次，假如Ct值仍<40，但曲线有明显的对数增长特性，报告本阳性，否那么报告阴性。 3．样本不显示Ct值时，报告阴性。 试剂盒使用本卷须知 1．本试剂盒仅用于体外检测和研究用途，开始使用前请认真阅读本说明书全文。 2．实验必须严格分区操作：PCR前预备区——预备实验试剂；样本处理区——待测样本、模板处理；检测区——PCR扩增、检测。
李斯特氏菌 李斯特菌 李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的 李斯特菌快速检测试剂盒 1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。 2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较
长时间生长繁殖。 3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。 4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌 单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况 李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。 单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有 1、形态与染色
单增李斯特氏菌 一、单增李斯特氏菌是什么 单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogens，以下简称单增李斯特氏菌)是李斯特氏菌属的8个菌种中对人类致病的力最强的菌种，绵羊李斯特氏菌对人类也有一定致病性，其余李斯特氏菌均无致病性。单增李斯特氏菌是一种革兰氏阳性小杆菌，有13种血清型，其中1/2a，1/2b，4b是最常见的食物中毒型别。其引起的食源性李斯特菌病相对少见但十分严重，是致死率非常高的食源性致病菌。 单增李斯特氏菌在0℃～45℃都能生存，生命力非常顽强，在冰箱的冷藏温度4～6℃下仍可以大量生长繁殖，这意味着食物在冰箱内冷藏也无法将单增李斯特氏菌置于死地，也是该菌不同于其他食源性致病菌的重要特征。 二、危害、典型症状、易感人群 单增李斯特氏菌感染分两种： (1)肠道型感染。肠道型的潜伏期很短，通常从食入污染食物的8～48小时，病人会出现发热、肌肉酸疼、恶心、呕吐等症状，几天即可痊愈。 (2)侵袭型感染。侵袭型的潜伏期非常长，2～12周。单增李斯特氏菌入侵神经系统和循环系统，引起严重的脑膜炎和败血症，发病率虽低，病死率却高达30％～70％。单增李斯特氏菌是一种细胞内寄生菌，人体主要靠细胞免疫功能对其进行清除，因此，易感人群为免疫系统未发育完全或有缺陷的新生儿、孕妇、慢性病患者、老年人等。其中，孕妇感染李斯特氏菌本人只会表现出轻微感冒症状，但却能引起胎儿感染，造成胎停、流产等严重后果，据统计约1/3的感染孕妇会发生流产。 三、最常见的污染食品 单增李斯特菌广泛分布于自然界，在土壤、污水、粪便、植物、饲料、原料乳中都能被离出。WHO的调查表明，4％～8％的水产品、5％～15％的乳及乳制品、30％的肉及肉制品均被单增李斯特氏菌污染。同时，该菌还能寄居在人类肠道中，一般人群粪便带菌率为2～10％。我国近几年食品安全风险监测结果显示，单增李斯特菌在生肉和即食食品中污染率最高。 单增李斯特氏菌通过食物污染传播，经消化道感染。引起中毒的原因往往是食用未经彻底加热的污染食品。例如冰箱内冷藏的牛奶、冰淇淋，若受到生肉表面李斯特氏菌的交叉污染，取出直接食用就会导致食物中毒。 四、流行状况 1 / 2
DBS22 DBS22/019-2012 吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测 2013年发布 2013年实施 吉林省卫生厅发布
前言 本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写。 本标准分为两种检测方法： 第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法； 第二法：MPN计数法。 其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。 本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。 本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇
吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测 1 范围 本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2℃～5℃和-18℃。 2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。 2.3 均质器。 2.4 显微镜：10×～100×。 2.5 电子天平：感量0.1 g。 2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。 2.8 无菌平皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。 2.10 离心管：30 mm×100 mm。 2.11 无菌注射器：1 mL。 2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。 2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。 2.14 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。 3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。 3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。 3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。 3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。 3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。 3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。 3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。 3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。 3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。 3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。 3.13 李斯特氏菌显色培养基。 3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。
单增李斯特氏菌显色培养基使用说明书CRM013 单增李斯特显色培养基 单增李斯特ATCC19115 (Chromogenic Listeria monocytogenes Agar ) 【包装规格】 环凯货号CRM013（干粉）；SR0590(配套试剂) ；（平板） 包装形式47.3g/瓶；10支/盒；20套（φ9cm) /盒【产品用途】 用于分离和初步鉴别单增李斯特菌。 【检验原理】 蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;色素与单增李斯特氏菌具有的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在平板上，单增李斯特氏菌呈现绿~蓝绿色的光滑规则的小菌落;抑制剂和配套试剂可抑制杂菌的生长。 【培养基配方成分】 配方（每升）含量 蛋白胨15.0g 酵母膏粉 5.0g 琼脂15.0g 氯化钠 5.0g 色素 2.3g 抑制剂 5.0g 去离子水（平板）1000ml 最终pH 7.1±0.2（25℃） 【使用方法】
1.称取显色培养基干粉47.3g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，充分溶解，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右。 2.取10支配套试剂分别加入1mL无菌水，使之完全溶解。 3.将配套试剂加入到已冷至48℃左右基础培养基中，充分混匀后倾注无菌平皿。 4.按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液，进行增菌培养后，用接种环取1环增菌液，划线接种于显色平板上，置于36±1℃培养24-48小时。 5.观察结果。致病性李斯特24h后开始出现蓝绿色，至36～48h蓝绿色明显。挑取显色平板上呈蓝绿色光滑规则，直径约1～2mm的可疑单菌落进行进一步的试验。 6.对疑似单增李斯特氏菌菌落可使用HK-MID Listeria或API20E或生化管进行下一步的鉴定。 注：如产品类型为干粉，按上述1-6进行操作;若为即用型平板，按4-6进行操作即可。
作者单位:1 沈阳农业大学免疫研究所,沈阳110161;2 辽宁出入 境检验检疫局;3 中国检验检疫科学研究院 作者简介:熊国华(1980-),男,湖南常德人,硕士在读,研究方向:分 子免疫学。 通讯作者:曹际娟 文章编号:1001 0580(2008)02 0248 02 中图分类号:R 151.1 文献标志码:A 检验技术 单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测 熊国华1,于莉1,曹际娟2,曹远银1,王静 3 单核细胞增生李斯特菌(L isteria monocytogenes,单增李斯特菌),是李斯特菌属(L isteria)中最重要的人类食源性病原菌!1?。目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离培养和生化鉴定,该方法费时费力!2,3?。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体外诊断技术!4?。近年来该方法发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用,但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。1 材料与方法 1 1 材料 (1)菌株:单增李斯特菌5株;鼠疫菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O 157#H 7、假结核耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、葡萄球菌各1株(分别由军事医学科学院流行病研究所和中国检验检疫科学研究院卫检所提供)。(2)试剂:脑心浸液(BHI)、营养琼脂(北京陆桥商检新技术公司)培养基;N C 膜(美国M illiplore 公司);玻璃纤维、吸水滤纸(北京华美公司);氯金酸(上海国药集团化学试剂有限公司);其余试剂(军事医学科学院药品器材供应站)。(3)主要仪器:隔流喷金划线机(美国I magen Ar ista 公司);切膜机、压壳机、划线机(天津科矩公司);N D-1000超微量蛋白定量仪(美国N ano Drop 公司);超纯水发生器(美国M illipo re 公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司)。1 2 方法 1 2 1 单增李斯特菌抗体与胶体金制备 单增李斯特菌多克隆抗体为本实验室制备。采用柠檬酸钠还原法!5? 制备25 nm 的胶体金。 1 2 2 胶体金标记抗体最佳条件测定 (1)最佳pH 值:采用文献!6?方法。(2)最佳标金量:采用试管观察法!7?。1 2 3 胶体金探针的制备 采用文献!8,9?方法。 1 2 4 抗体最佳包被浓度和封闭浓度确定 用0 01mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7 2)把单增李斯特菌抗体稀释为4 0,3 0,2 0,1 5,1 0,0 5mg /ml 的抗体,而且每个浓度的抗体均含有2 0%,1 5%,1 0%,0 75%,0 5%小牛血清(BSA)的各1管。取稀释好的单增李斯特菌抗体(T 带)和羊抗兔抗体(C 带)用隔流喷金划线机在NC 膜上划线,置于37?干燥2h 。然后进行检测。 1 2 5 胶体金试纸条的组装和检测结果判读 胶体金试纸条由样品垫、胶金垫、NC 膜和吸收垫4部分组成。将其组装好后用切条机切割成4mm/条后进行检测。加样10min 后,检测带和质控带均出现红色的为阳性,只有质控带出现红色的为阴性,检测带和质控带均不显色则试纸条无效。 1 2 6 胶体金试纸条性能试验 (1)敏感性试验:脑心浸液(BHI)培养基37?培养18h 的单增李斯特菌,4? 8000 r/min 离心10min,再以PBS 稀释成不同数量级的菌悬液,涂布血平板进行菌落记数,同时进行检测。(2)试纸条的特异性试验:单增李斯特菌用BHI 培养基培养,其余菌株用溶菌肉汤(LB)培养基培养,4?8000r/min 离心10min,再用含1%土温20(T w een-20)的PBS 样品稀释液制成菌悬液进行检测。(3)试纸条的稳定性试验:将胶体金免疫层析试纸条于37?存放,并分别在3,4,5,6,7d 时取单增李斯特菌悬液(浓度为106CFU /ml)、小牛血清(浓度为1mg /ml)和金黄色葡萄球菌(浓度为109CFU /ml)进行检测,并与同样的P BS 溶液做为样品空白对照。 1 2 7 检测模拟污染样品 火腿肠50mg 、奶粉50mg 、牛奶250 l 和人血清100 l,分别加入到1ml 含单增李斯特菌的样品稀释液中,混匀,静置10min 或短暂离心(8000r/mi n 离心15s),再取1份培养后的菌液,用PBS 10倍系列稀释进行检测。2 结 果 2 1 胶体金标记抗体最佳条件 2 1 1 pH 值 pH %7 5各管中溶液颜色呈不同程度的蓝色,pH &7 5,各管中溶液颜色无变化,离心后pH %8 0的标记管中沉淀不能完全溶解,pH &8 5的标记管中沉淀完全溶解,溶液呈透明紫红色。因此,胶体金标记的最佳p H 值为8 5。2 1 2 最佳标金量 静置后观察,含抗体量少的管呈现出由红变蓝的聚沉现象,而加入抗体达到或超过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。使红色保持不变的抗体含量最低的试管的抗体量就是抗体的最适保护量,在此基础上增加20%为稳定胶体金的抗体最佳标金量。当抗体加入量低于12 g/ml 的各管颜色均变蓝,都发生了不同程度的聚沉。所以抗体的最佳标金量为15 g /ml 。 2 2 抗体最佳包被浓度和封闭浓度 用不同浓度的单增李斯特菌的菌悬液检测不同包被浓度和封闭浓度的试纸条。结果可见,能检出106CF U /ml 单增李斯特菌的最低包被浓度为1 0mg /ml,BSA 最高封闭浓度为2 0%。空白对照结果显示,包被浓度过高和封闭浓度过低会产生假阳性。所以,考虑到储存和运输对试纸条的影响,选定最佳包被浓度为2 0mg/ml,封闭浓度为1 0%。 2 3 敏感性试验(图1) 优化检测带、质控带抗体浓度和胶体金探针浓度以及层析条的层析特性后,从1 0?109 CFU /ml 单增李斯特菌样本10倍系列稀释,不含单增李斯特菌的样品液为空白对照。结果可见,免疫层析条检测灵敏度为1 0?106CF U /ml 。 2 4 特异性试验(图2) 以样品稀释液同样分别处理金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌O 157:H7、鼠伤寒沙门菌,阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、表面葡萄球菌、鼠疫菌、假结核耶尔森菌至1?107CFU /ml,以制备好的胶体金免疫层析试纸条检测,并与同样菌数的单增李斯特菌样品对照,同时检测空白对照。
单增李斯特氏菌及其检测方法 一、单增李斯特氏菌 单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。 二、单增李斯特氏菌检测方法 1.细菌培养法 该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。 2.生化鉴定法 该菌主要生化特性如下： ①触酶阳性； ②氧化酶阴性； ③发酵多种糖类； ④产酸不产气； ⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤 维二塘； ⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解； ⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性； ⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；
Testing Methodology for Listeria species or L. monocytogenes in Environmental Samples October 2015, Version 1
U.S Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition 5100 Paint Branch Parkway College Park, Maryland 20740
Testing Methodology for Listeria species or L. monocytogenes in Environmental Samples October 2015, Version 1 U.S. Food and Drug Administration I.Introduction The method described here is for the purpose of testing environmental samples for Listeria species or L. monocytogenes. This method has been utilized by FDA’s Compliance Program for testing the environmental samples and is based on procedures described in the Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) of U.S. Department of Agriculture (USDA)1 and FDA’s Bacteriological Analytical Manual (BAM)2. A.Equipment and materials 1.Electronic top-loading balance capable of weighing a minimum of 25 ± 0.1 g (500 g capability recommended) 2.Incubator, 30 ± 2°C 3.Incubator, 35 ± 2°C 4.Incubator, 20 or 25 ± 2°C 5.Vortex mixer 6.Phase-contrast microscope (40X and 100X objectives) 7.Fluorescent desk lamp or natural spectrum light source 8.Sterile sample preparation supplies: scalpels, chisels, knives, scissors, spatulas, forceps, disposable or reusable dishes, pans or trays 9.Sterile, filter or non-filter bags 10.Pipets (e.g., 1 ml) 11.Pippettor and sterile disposable tips for dispensing 100 μl 12.Microscope slides, cover slips and immersion oil 13.Disposable plastic and/or platinum inoculating needles and loops 14.Wax and waterproof ink marker 15.Sterile cotton-tipped applicators (i.e., swabs) 16.Non-bactericidal sampling sponges, polyurethane, or cellulose 1 U.S. Department of Agriculture (USDA), Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 8.09, effective date: 05/01/2013 2Bacteriological Analytical Manual, Chapter 10. Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods, Version of April 2011, Current content as of September 25, 2015
食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测 实验目的 1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。 2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。 基本原理 单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。 该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5μm ′0.5～2.0μm。多单在，有时是V字型排列。无芽孢，不产生荚膜。在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20μm或更长的丝状。在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。 本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。 在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。不形成菌环、菌膜。 在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。粗糙（R）型菌落表面起伏不平，边缘不整齐，细菌难以乳化。 在血液琼脂培养基上，可形成狭窄的β-溶血环，常不超出菌落边缘，移去菌落才可见。弱溶血或疑似溶血菌株可用协同溶血试验(CAMP)鉴定。 半固体培养基：沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩散，在培养基表面下3～5mm处呈伞状。 该菌接触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨糖，不发酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纤维二糖和侧金盏花醇。不利用枸橼酸盐。不还原硝酸盐，不产生靛基质和硫化氢。甲基红及VP试验呈阳性。不液化明胶和凝固血清。可水解七叶苷和马尿酸钠。 实验材料 仪器恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃；均质器；显微镜：10×～100×；电子天平：感量0.1 g ；锥形瓶：100 mL、500 mL；无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）；无菌平皿：直径90 mm；无菌试管：16 mm×160 mm；离心管：30 mm×100 mm；无菌注射器：1 mL；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）；马红球菌（Rhodococcus equi）单增李斯特氏菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）、英诺克李斯特氏菌(L.innocua) 培养基和试剂 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）；含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）；李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）；盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附
__________疾病预防控制中心 单核细胞增生李斯特氏菌检验原始记录 共 页 第 页 检验者： 审核者： 年 月 日 样品编号 样品名称 检验依据 GB/T4789.30-2003 检验环境 温度 ℃ 湿度 %RH 检验日期 仪器设备名称、规格型号、精度、编号 电子天平: YP-1002 0.01g 105 有计量合格标识，并在检定有效期内. 恒温培养箱: DH6000 0.1℃ 88 有计量合格标识，并在检定有效期内. 样品复苏 __月__日_____ 无菌操作，将待检样品磁珠置于10mL 无菌营养肉汤中37℃温育24h 复苏。 样品制备 __月__日 _____按无菌操作取待检肉汤1mL 置于10mL LB 1增菌液中 增菌 1．将上述均质好的LB 1增菌液，于30±1℃培养24h 。 2．__月__日 ____取LB 1增菌液0.1ml 转种于10ml LB 2增菌液内,于30±1℃培养24h 。 选择性琼脂平板 观察现象 结果 分离 MMA 琼脂 要求 36℃±1℃；48h 。 培养 ___日____时至___日____时。 ＿＿显色培养基 要求 36℃±1℃；24h ～48h 。 培养 ___日____时至___日____时。 初筛 TSI 琼脂 要求 36℃±1℃；18h ～24h 。 培养 ___日____时至___日____时。 TSA-YE 培养基 要求 30℃±1℃；24-48h 。 培养 ___日____时至___日____时。 动力试验 SIM 动力培养基 要求 25℃±1℃；18～24h 。 培养 ___日____时至___日____时。 血平板溶血实验 要求 36℃±1℃；18h ～24h 。 培养 ___日____时至___日____时。 染色镜检 现象 结果 API （Listeria 10300）生化 鉴定试剂盒 编码 结果 实验结果 样品中 单核细胞增生李斯特氏菌 备注