不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)
生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。
“工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。
Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。
一、Bio-Rad经典Mini系列
Bio-Rad Laboratories由David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州Hercules，下设三大部门——生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。
Mini-PROTEAN3电泳系统与Mini
Trans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展，SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。而且在操作手段方面也越来越简便，越来越准确。Mini Protein Cell的出现使得Western的制胶和电泳的消耗成本更经济、操作更简便快速——这种简便也间接促进了Western技术的更广泛采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生产出来那天就可以说是“踩在巨人的肩膀上”，因为它吸取了Bio-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直电泳仪的优点，并在其基础上进行了优化，所以获得了全球实验人员广泛的认同与喜爱。
Mini-PROTEAN 3的优点可以概括为8个字——用途广泛，操作简便。由于
Mini-PROTEAN 3可以用于SDS-PAGE变性电泳、非变性电泳、Tric-Tricine电泳、等电聚焦和酶谱分析，以及dsDNA、ssDNA和RNA的电泳分离，因此可以说只要实验室有一套Mini-PROTEAN 3，足以应付常规垂直电泳需要了。Mini-PROTEAN 3体现了Bio-Red不断改进的努力方向——设计人性化，令操作更简便——这在各个细节都可以体现，比如说为了防止制胶过程出错，Mini在玻璃板，夹合器（固定玻璃板的装置）以及电泳槽里等处分别都有注明正反位、夹板高度或正负极；方便的夹子取代了以前需要拧4个螺丝来固定玻璃板的麻烦。由于未交联的聚丙烯酰胺本身是神经毒素，因此每个实验者都希望操作能简单快速，尽可能减少讨厌的意外“事故”——漏胶的发生。Mini-PROTEAN 3巧妙的设计使得配胶快速方便的同时更大大减少漏胶的几率。除此之外，Mini的加样容量也是可以多样选择的，包括10-well (30 μl)，15-well (15 μl)，10-well (50 μl)，12-well (20 μl)，9-well (30 μl)，IPG comb (7 cm IPG strip)。
电泳结束后就要转膜。同系列的Mini Trans-Blot可以说是Mini-PROTEAN 3的“完美拍档”，它们组合在一起就是做Western印迹实验的最好选择之一了。说它好，当然是有原因的，由于Mini Trans-Blot在转移过程当中的三个关键步骤里设计巧妙，帮助转移顺利进行，提高了转膜效率，因此才会得到如此多的用户的赞赏。第一就是在夹板盒，由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响——试想一下，在特异带显色处正好有一个气泡，那么本来可以很漂亮的结果就付之一炬了，甚至可能会造成假阴性结果。Mini Trans-Blot的夹板盒通过两块海绵与封口式设计帮助减少气泡的存在，同时夹板盒多孔的设计也可以在压制过程中使缓冲液均匀的渗出，减少气泡。其次，转膜槽的人性设计。试问一下，在转膜中最怕什么，我想大部分人都会说是正负极弄错，Mini Trans-Blot为了防止这种造成整个实验完全失败的情况出现，在转膜槽的正负极上明确的用大范围的红与黑这两种颜色标志出来了，这样出错的可能性就大大降低了。第三，就是Mini Trans-Blot的冷却装置。Mini Trans-Blot 有一个冷却盒，听起来好像很复杂，其实就是一个塑料盒子，但是这个盒子在转膜过程中却
可以起重要作用，众所周知，转膜过程中发热不仅会造成气泡的形成，而且很有可能会影响蛋白的正常转移，因此大多数转移是在冰上进行的，但由于空气的隔热现象往往效果不是很明显，利用Mini Trans-Blot，实验人员可以在冷却盒中装入缓冲液将其冰冻起来，转膜时就可以起到冷却的作用。除了以上这些，Mini Trans-Blot还有一次可以转两块膜，低电压过夜转膜以及令人放心的外观设计等方面的优点。Mini-PROTEAN 3加上Mini Trans-Blot一套价格不便宜，要1000多美元呢。现在那个超薄硬质玻璃板也可以单买了，以前可是十套打包的。
Bio-Rad除了这个“镇店之宝”外，还有适合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列（Mini
系列是8.6 x 6.8 cm），这一系列无论是电泳系统还是转移系统都和Mini相似，但是它可以容纳更多块胶，为蛋白质组分析提供便利。而且有线电极和板电极两种方式供选择。除此之外，还有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)适合特别的需要的实验来选择。
二、电泳世家Hoefer
也许国内的研究人员不那么熟悉Hoefer，但是这个1967就成立的公司在电泳产品领域可谓赫赫有名。多年来一直专注于核酸和蛋白电泳分离技术，使得其产品质量和设计一直处于领先地位，在国外真正属于“顶级”口碑的电泳产品。被GE收购了的Amersham则是大家非常熟悉的品牌（包括独步天下的原法码西亚的蛋白纯化王国），而多年为Amersham代工生产单向电泳产品的正是Hoefer。2003年Hoefer成为著名的哈佛生命科学全资子公司，GE （Amersham）目前继续销售Hoefer的各种产品，而且8月期间还有6到7折的特别优惠，很值得看看（点击这里）。老实说GE的这一单向电泳系列一直算是良心价，和美国Hoefer 的价格差不多，如果算上这么大的折扣优惠，在美国也买不到这个价格呢！
GE（通用电气公司）有一个很有名的创始人——托马斯·爱迪生，自1896年爱迪生电灯公司和休斯顿电气公司合并成立GE公司以来，GE秉承着“梦想启动未来”的理念逐渐成为了一家多元化的科技、媒体和金融服务公司。2004年4月，GE宣布成功收购Amersham公司所有股票，自此GE Healthcare在生命科学领域的发展生机勃勃，充满朝气，继续拓展Amersham在基因组，蛋白质组，分离纯化，检测试剂等领域打下的王朝。
在蛋白电泳与印迹系统方面，Amersham做得标准全面，有各种的可以放置不同凝胶数目、凝胶面积和厚度的电泳槽可供选择，通常可以分成三类：微型、中型和大型，另外电转印迹系统也有多种选择，比如说如果你想做半干转移，那么就可以选择Hoefer TE70或Hoefer TE77，如果是要做全湿转移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考虑的购买对象。所以如果你刚开始接触蛋白电泳和Western印迹，那么可以考虑一下GE公司（Amersham）的产品，因为这些产品不仅购买放心，而且在产品服务方面也相当不错，能够找到众多有用的资料。
别具一格Hofer MiniVE
Amersham在电泳仪器方面挑选范围广，而在蛋白垂直电泳系统中一定要提及的就是Hofer MiniVE了，这一设计完整、使用方便的新一代电泳仪器融合了蛋白电泳与Blot两方面装置配备，设计独特，而且在前一段时间GE公司大减价活动中，全套MiniVE只要560美元，只用花一套仪器的钱就可以用作两种用途，这么著名的品牌，真是难得物美价廉啊（如果连同电泳电源还可以再打折哦，晕...）。
说它是好货，那么到底MiniVE是好在哪儿呢？其实在众多电泳仪器倍出的江湖，MiniVE 有三招让其独步武林，第一招就是操作简便，节省时间。由于有时蛋白电泳使用频率很高，所以实验人员当然会希望操作简单啦。MiniVE配胶过程就三步：load→ clamp→cast，只需把玻璃板放上去，夹紧，然后灌胶就完事了。漏胶？那是极少发生的事。细微之处见真功，MiniVE的设计有一些过人之处。比如Spacer有T边，大大减少侧边漏胶的几率；而将玻璃装到模块上的时候，两边底部的玻璃/Spacer/玻璃处都有Guide Foot，顶一下“三件套”的上面就可以保证足部完全对齐防止底部漏胶。装玻璃的时候如果传统的“插进模块”就容易导致Spacer和玻璃之间“走位”，MiniVE的模块两个侧边和底部都可以打开，将装好的玻璃平放，合上夹边再拧螺丝就行；底部的封边也很特别，有3档，一个是密封档，可以密封底边后直接倒胶；一个是半开的电泳档，允许电泳液均匀连通胶底部，另一个当然就是完全打开以便装卸玻璃了。所以MiniVE并没有单独的倒胶架子，将底部封条推到密封位置后就可以将模块“挂”在电泳主槽的边上倒胶了，不用担心胶面不平哦。Amersham产品做工精良，值得信赖的。
第二招，高品质大容量。MiniVE与一般蛋白电泳相比，有个很大优势，就是其蛋白胶可薄至0.5mm，而且凝胶大小是10×10.5cm(W×H)，比一般的10×8cm要长了30%，这样的好处就是增加了蛋白分辨率，使一些“难舍难分”的蛋白组分“分道扬镳”，达到更好的分离效果。
ViaFect转染试剂
第三招，Western印迹，MiniVE采用的转移槽是“盒式”的，润湿的转移膜和滤纸、海绵组成“三明治”结构夹在“盒式”的转移模块中，闭合后每个转移模块只用350毫升的缓冲液，放入主槽中；而电泳主槽里只放预冷的去离子水作为降温，就可以直接转膜了。这种转移方法不用整个电泳主槽装满电泳转移缓冲液，可以节约不少缓冲液（1.2—1.7升）呢，而且可以减少不均匀的发热。
Amersham除了这种微型的电泳系统，还有Hofer其它系列，比如SE250垂直电泳仪，这种电泳系统配有热交换模块，可以消除smile现象（一种由于热量交换不及时而引起的蛋白带波动现象，生物通注）。再比如凝胶大小为18×16cm的SE600 Ruby，以及为了蛋白质组学研究的需要开发的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，这两种电泳系统分别可以进行6
块和12块凝胶的电泳，这可以说是“库斯拉级”的电泳系统啊！
三、国产品牌
国产电泳仪，国内的老牌六一是大家非常熟悉的产品，价格的绝对优势令其历时数十年而屹立不倒。电泳仪这玩意本来技术含量不比芯片扫描仪什么的，只要设计合理好用，电极丝笔直耐用分离效果好，塑料槽晶莹剔透美观易清洗，价格合理就好。国内品牌现在材料都没话说，高透明度聚碳酸脂注塑成型，铸造模具非常精密。关键就是设计，好不好用，分离效果好不好。最近新冒头的后起之秀，北京百晶生物技术有限公司的产品就值得关注--越是新出品的电泳槽，在设计上就越值得期待，无他，只因具体设计上可以参考其他著名品牌优缺点，扬长避短，结合更多使用人多年的心得和期望进行改进--站在巨人的肩膀上自然有高度。
这个百晶其实是美国海湾基因集团公司在中国设置的以出口为主兼顾国内市场的外向型生产加工基地，专业研发和组装生产“Baygene”品牌电泳及配套仪器，将美国工程师的人性化设计理念和国外制造的高精度模具组合起来，核心进口器件及不同程度的国产化率集成的国产货。包括高、中、低压电泳仪电源；垂直、水平电泳仪；可整支高温消毒的移液器；超薄型磁力搅拌器；手掌式、台式离心机；高精度恒温循环器；常温、低温干式恒温器；显微镜数码图像系统等。其中最为值得称道的就是Baygene BG-verMINI 迷你垂直电泳仪。因为设计更人性化，操作更简便。
1．首先，跑蛋白电泳最重要是必须效果好。BG-verMINI 迷你垂直电泳仪（标配）凝胶尺寸是82×97mm(W×H)，分离长度比一般迷你型凝胶82×73cm长25%。由此增加了蛋白分辨率，分离了粘连的蛋白组分。同时又可以兼作82×73cm迷你型凝胶，达到省时省液、快速方便的效果。兼顾到了多种使用习惯。
2：其次，只是效果好就可以吗？在当今越来越讲究效率的今天光是效果好还不够，还得必须操作简单不漏胶。那么让我们来看看BG-verMINI 迷你垂直电泳仪如何实现简单方便的。它具有独特的灌胶装置，可同时灌1-2块胶。制胶过程只需三步：把带固定垫条的玻璃固定在主槽上，再将主槽放在独特的灌胶装置上，即可完全放心的灌胶。任何人都能在1分钟内操作完成，没有任何漏胶的可能。凝胶制成后卸掉灌胶装置，凝胶板无需二次移动（不用拆下玻璃板），将主槽整个放入壳体中即可电泳。最大限度避免了玻璃板移动过程的失误以及凝胶渗漏等等。在国内外相关产品都需二次移动的情况下，此特点更加彰显突出和有效。3．液体搅拌：槽体底部留有1cm空间，便于电泳或转印时放置磁力棒进行搅拌，以使温度和离子强度均匀，实现电泳或转印的最好效果。若不用此功能时，可放置减液板（电泳配件）填充其空间，以减少缓冲液量。
4．充分接触：电极的正极结构为V字形设计，两侧有气泡出孔，电泳时不会有气泡在电极周围存留，保证了电极与缓冲液的充分接触，达到了散热的良好效果。
5．缓冲液量自由放置：槽体宽大，充分达到了足量缓冲液带来的极佳散热效果。既避免了用户自制“冰盆”冷却的尴尬，又避免了凝胶谱带的“笑脸”现象。需要节省缓冲液时，减液板又可以发挥作用啦。上下槽合计最低缓冲液量为400ml。
6．多板制胶：需要提前制成大量凝胶板冷藏保存的用户，我们也准备了多板制胶器供选择，每次可制4块凝胶。
7．转印电泳：配套的聚碳酸脂模具成型BG-blotMINI迷你转移槽，内置冷却装置—冰盒，其快速吸收了转印过程的热量，克服了无冰盒转印的发热现象。具有限位功能的转移槽，配以颜色明显的转印夹和电极，确保了转印过程的正确定向。
生物通Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP 扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？
上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。
电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng
蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot 实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。
转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的
转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，
NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白
印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力
（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.
不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有
其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像
国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。
首先来比较下这几种膜的特点
NC膜尼龙膜PVDF膜
灵敏度和分辨率高高高
背景低较高低
结合能力80－110 ug/cm2>400 ug/cm2
125－200 ug/cm2（适合于SDS存在
下与蛋白质的结合）
材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高
溶剂耐受性无无有
操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿
检测方式
常规染色，可用放射性和非放射性
检测不能用阴离子染料
常规染色，比较于NC膜，可用考马斯
亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫
检测。
适用范围0.45um 一般蛋白
0.2um一分子量小于20kD蛋白
0.1um一分子量小于7kD蛋白
低浓度小分子蛋白、
酸性蛋白、糖蛋白和
蛋白多糖(主要用在
糖蛋白检测和蛋白质测序
核酸检测中)
价格价格较便宜便宜较贵
1. 硝酸纤维素膜
硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um 的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。
硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM 的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。Schleicher & Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往
返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。前者Protran一直是Schleicher & Schull自豪的产品，这种“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真是“路遥知马力”的典范）等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。
Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。NC膜除了一般的Discs、Rolls 和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC膜纸套成滤纸—NC膜—滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。不过，卷膜肯定是最实惠
的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。不知道为什么在国外硝纤膜会
被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n年——如
果非要给这个n加个期限，那就是......至少可以用到等我毕业之后。
2. PVDF膜
刚开始做WB的人也许会有这种疑问：为什么实验室的老师（或者师兄师姐们）在教我
们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角
角也舍不得丢掉呢？其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀
手锏”。
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。与硝
酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量
是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清学检
验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗
体检测糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化
学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳
道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分
离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”
的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。
所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。此外，个人经验，一些强疏水蛋白用PVDF膜
效果会更好一些。PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染
色都一样OK，但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）
再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这
种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影
响后继的抗体识别呢）。PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白
有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。
PVDF膜常见的有以下几个品牌
公司产品名孔径适用范围参考价格
Millipore Immobilon Transfer
Membranes
0.45um0.2um$212
Bio-Rad Immun-Blot PVDF
Membrane Chemiluminescent, colorimetric western blots,amino-terminal sequence and total amino acid composition
Pierce PVDF Membrane0.45um0.2um Western, Southern,
Northern, and dot blots
Pall Life Science BioTrace PVDF Transfer
Membrane
0.45um Nucleic acid and protein
transfers. Protein sequencing
$149
Invitrogen PVDF Membrane0.45um
0.2um Protein
sequencing,immunoblotting
￥1625.8
Whatman Westran Clear Signal
PVDF Membrane
0.45um Western blots
作为PVDF膜的鼻祖，Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分为Immobilon-P（0.45um）, -PSQ(0.2um), -FL(用于荧光显色)和Blotting Sandwiches for High Troughput四种。Immobilon-P膜孔径均一，具有极强的吸附能力，染色性能好、抗溶剂能力强和信噪比高，有助于提高检测灵敏度，而且开放的孔结构容易接近被吸附的蛋白质，并有助于去除背景上没有吸附的探针，可以说是免疫印迹检测理想的印迹膜。Immobilon-PSQ转印膜是印迹小分子蛋白质（<20KDa）的理想选择——优良的蛋白质吸附性能，渗漏少。内表面面积较大，可供蛋白质吸附从而提高蛋白质测序的得率。由于不含污染性支撑物或表面活性剂，Immobilon-PSQ层析谱上的背景峰值极小。Immobilon-FL也是Millipore值得骄傲的产品，因为这是第一个专门为荧光显色优化的转移膜。通过实验证明，这种膜在Kodak成像系统可以显示仅7ng的蛋白，听起来不错吧，有兴趣可以试一试。这几种膜除了一般的PVDF
膜的优点之外，最大特点就是一个字——快。按照Millipore的操作手册，Immobilon可以在保证质量的前提下缩短WB时间到2个小时——主要是缩短封闭和洗脱时间。这可真是个好消息，因为坐在那儿等WB结果多浪费时间啊！缩短这个费时而枯燥的过程，早出结果，可以提高实验效率，利于我们分析实验结果，考虑下步对策嘛。卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交，而预裁剪的即用膜更适合高通量等等“用金钱换时间”的实验。再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用MilliQ水或者纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。
Invitrogen公司的PVDF膜也有大家风范：膜是与两张预裁的滤纸同时提供，方便使用；虽然一般而言0.2um的膜渗漏少适用性会更强，但Invitrogen的0.45umPVDF膜自有自家优势——特别适合于低背景，高敏感度的印迹反应，同样需要在乙醇或者甲醇，或者异丙醇中浸泡5分钟就可以用了。
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3. 尼龙膜
尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹，比如dot blot，比较于NC膜来说，
它的优点是结合力强，特结实又柔软且不易卷曲，机械强度大，便于操作，缺点是背景高——由于尼龙膜电荷密度高，使得非结合区的封闭比疏水性NC膜困难，对于灵敏度高的检测方法，背景问题尤为突出（据分子克隆III说通过热处理的酪蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改善），而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此在许多情况下实验室人员进行WB实验不选择尼龙膜。
尽管如此，一些产品却能“取其精华，去其糟粕”，将尼龙膜一些不利于蛋白印迹的因素缩小或者去除，使其成为有效的蛋白转移介质。比如说，化学发光底物做得相当出色的Pierce 公司，其旗下的Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane就是这样一个产品。这种分为A，B 两型的尼龙膜做工精良，孔径大小一致，为了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺点，Biodyne采用了合适的signal-to-noise 比例来调整，从而达到了200ug/cm2的蛋白结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景。除此之外，B型的Biodyne对于一些带负电蛋白是一种理想的转移膜，因为它在A型的基础上提高了正电荷集团的浓度。另外Biodyne相对于NC膜来说还是一种“打不怕，撕不烂，烧不着（200℃一下）”
的“顽强”的转移膜。
摘要：
选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍。下面我们就来谈谈一些需要注意的细节。
续前：选好了膜，就该考虑如何做转膜了。经典的转膜方法是电转移，这个生物通在前面的WesternBlot仪器之选里面有提到过，因为电转移需要配套垂直电泳槽来进行。如何做这个“海绵—几层滤纸—胶—膜—几层滤纸—海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍，相信大家都很容易找到。一些细节：
1.记得全程手套操作，一则避免手印污染影响结果，二则保护自己（未交联的丙烯酰
胺、甲醛等等虽不立即致命但都会慢慢毒害你的身体，可不要这样白白为科学献身哈）
2.如果WB前没有可参考的资料——比如不知道是否有表达，比如抗体少还要摸条件
（稀释度），可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；
3.去掉积层胶后，预染的Marker可用以识别胶上下方向和膜的正反面（预染Marker
如果照着说明书用量，有可能在电泳时看不到条带，但转膜时有浓缩效应而且背景白就可以看到了。如果要电泳能看到就要参考电泳的那个用量，或者多加1—2倍的量）；如果目标蛋白小，指示剂也可以指示方向，但是如果蛋白大，指示剂已经跑出去了，就要留意分清胶上下方向，切个小角是常用的方法。膜上要做好标记，识别正反面和上下。剪一个小小角最方便。膜和滤纸一起裁最好（不过滤纸上下叠多了膜不好剪，硝纤膜容易裂，用利刀+尺子+垫厚报纸划比较容易）尽量和胶一样大小，胶用纯水冲洗一下后用电泳缓冲液平衡过再量。
我自己通常剪的时候会故意长宽各比胶少1mm，保证膜和胶不会碰到对方背后的滤纸就好。
4.对于特别小的蛋白，tricine SDS-PAGE电泳有助于提高蛋白大小在1KD—20KD间
的分辨率，不用甘氨酸，丙烯酰胺的浓度也不用太高（可参考2004年中国生物工程杂志上有一篇文章（有效分离1kD小肽的Tricine-SDS-PAGE方法），87年Anal.Biochem也有一篇文献）。
5.转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转
膜的杂质。还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。
6.膜漂在水面（或者甲醇液面）让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气，膜
彻底浸润后颜色会变深一点，任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志，会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了，万一不幸发生也用同样处理。
7.电转移缓冲液通常用Tris glycine系统，如果是转膜后有部分样品要蛋白测序，最好
用CAPS缓冲液，减少甘氨酸对测序的污染。
8.半干电转移（Semi-Dry）用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽，非常节约试剂，
而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中，半干转不单可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系（配方下面有，还可以加20 % (v/v) 甲醇，据说有助于增加转膜效率和减少胶变形的，但据说也有可能影响抗体识别）。半干转可以在30分钟内完成转膜（每平方厘米电流2.5—3.5mA，恒流，冷库。如果电流要求小可以延长到60—90分钟，但要防止过热。
如果有那种温度贴，可以贴上参考温度），即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。
各种大小的蛋白的转移效率都OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转（面积还是按照单个计算），或者并排放（2块胶的面积计算），只要控制好单位面积的电流强度和时间，防止过热就好了。
Discontinuous blotting buffer to be used:
Anode buffer I:300 mM Tris
Anode buffer II:30 mM Tris
Cathode buffer:25 mM Tris/HCl (pH 9,4)
40 mM 6-Aminocapronic acid
9.
10.有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜，我个人持保留意见，因为SDS等去
垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合，反而不好。
11.如果只做Western Blot，膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相，对后面的免疫反应
影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置，以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况，如果比目标分子大的Marker都已经转过去了，那就OK了。如果有能在Western结果显色的Marker（比如生物通前面特别推荐的别出心裁特别好用的蛋白分子量标准谁可小看“蛋白标准”（下））就更方便了。
12.有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序，如果要蛋白测序需要提前一天倒胶，并
说预电泳6小时（有还原剂如Glycolate）后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春
红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色，其他的比如测序和或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。没条件做，参考而已。
13.转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透
明的蛋白条带，有时这种快速的方法可以不用染色识别条带，避免染色膜影响后继实验。
转膜后的封闭注意：
14.转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限
于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方（实验太晚了还可以补充一下营养，哈哈），用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法（如果用了生物素标记的Marker而且结果背景较高，分析结果也有可能是受此影响），脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好，再加上HRP的底物选择范围也更宽，现在HRP是越来越普遍的选择。
但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记。封闭时间和封闭剂的量都要足够。封闭不完全，后面就全白忙活了。
15.如果选用AP作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS
干扰AP。再想起什么再补充吧。下一篇转到显色试剂的选择了。
蛋白质marker
“大”与“小”的界定真的很难，有时看起来就是无关紧要的细节却偏偏对于结果的影响最大，比如“发现号”的一块隔热材料松脱就有可能造成无法弥补的后果，再比如以前所认为是“垃圾”的DNA却作用强大，还有小小microRNA对整个分子生物学的影响犹如“麦莎”台风过境，可见千万不可忽视任何一个细节。在Western Blot过程中，分子量Marker就是这样一个小细节。这个Western Blot参照家族的一员（见Western Blot 为什么必须用内参？)的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker 也是Wb实验成功的必要条件之一。
环顾各个厂家，蛋白标准分子量产品争奇斗艳，各式各样，但总的来说可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准和修饰标记蛋白分子量标准三个级别，除此之外还有一些特殊的蛋白分子量标准。说起蛋白Marker这东西，想一想好像挺简单，但为什么会有不同的厂家不断推陈出新呢，到底新技术会给我们带给如何的便利呢，还是让生物通“一览众山小”，为您做个scan。
一. 未染色（pre mixed）蛋白分子量标准
未染色的蛋白分子量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指
示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条！数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker（pre-stained）好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。预染Marker要看下集啦。
①宽分子量蛋白标准
厂家产品名Protein
Ladder(kD)
包装价格用量
NEB Unstained
Protein Marker
212, 158, 116, 97,
66, 56, 43, 36, 27,
20, 14, 7, 2/3
0.56ml ￥335
1.12ml ￥756
5.6ml ￥3024
Mini-gel 7ul/well
Full length-gel
15ul/well
MBI Protein
Molecular
Weight Marker
116, 66.2, 45, 35,
25, 18.4, 14.4
2×1ml ￥420
Mini-gel 5ul/well
Full length-gel
10ul/well
GE Full MW Range10－250500ul $201
Bio-Rad SDS-PAGE
Standards,
(SYPRO Orange)
broad range
4.5-200
6.5-200
200ul
Precision Plus
Protein
250, 150, 100, 75,
50, 37, 25, 20, 15, 0
24 applications
100 applications
Invitrogen Mark12
Unstained STD
200, 116.3, 97.4,
66.3, 55.4, 36.5,
31.0, 21.4, 6.0, 3.5,
1ml（200 per
vial）￥1537
Mini-gel 5ul/well
Standard-gel
2.510ul/well
Novagen Perfect Protein
Markers
10-225
15-150
100 lanes $95
Promega Broad Range
Protein MW
Markers
225, 150, 100, 75,
50, 35, 25, 15, 10(其
中50KD浓度是其它的
三倍)
100 lanes
Pierce Bio.ColorMeRanger
Unstained
Protein MW
Marker Mix
3.5-20048-96 doses
如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是大包装，就应该考虑分装。多次反复冻融对于蛋白的危险，不用多说吧。另外要记得，宽谱的Marker不一定每条都能看到的，特别是Mini Cell。如果侧重大蛋白，那小的可能就已经跑掉了，不是质量不好哦。
这一系列的蛋白Marker一般相对贵点（由于制备蛋白比较繁琐）。相比而言NEB的这一宽分子量的蛋白Marker不仅分子量范围大——从2/3到212kD，而且不贵——如果是小胶，每次仅需4元左右，大胶将近9元（0.56ml包装）。而另一个美国公司MBI更是物真价实，每个孔只需1元！（mini-gel）。另外除了价格方面，有些产品作的也十分有特色，比如说Invitrogen公司的Mark12，这种蛋白Marker主要是用在Tris-Glycine 、Tricine或者NuPAGE三种胶上，特色是可以分离分子量十分相近的蛋白，像是在30kD附近，它可以分辨出31kD和37kD这样同在30kD级别分子量的蛋白，这对于有这一需要的实验室人员来说是十分有帮助的。但是记住了Invitrogen的蛋白Mark使用时需要室温溶解，不能煮沸。
②高分子量蛋白标准
厂家产品名Protein
Ladder(kD)
包装价格用量
Bio-Rad(Silver
Stain)
SDS-PAGE
Standards,
high range
45-200200ul
Invitrogen BenchMark
Protein
Ladder 220, 160, 120, 100,
90, 80, 70, 60, 50, 40,
30,25, 20, 15, 10
2×250ul
￥1271.9
Mini-gel 5ul
Full-sized gel 10ul
Silver
staining 0.2-0.5ul
HiMark Unstained Protein Stadard 500, 290, 240, 160,
116, 97, 66, 55, 40
250ul ￥2305Mini-gel(1.0mm)
5ul
(1.5mm) 7ul
Roche Premixed
Protein MW
Marker 39.2-200200ul Mini-gel 5ul
Full-sized gel 10ul
GE High MW
Range
14.3－220250ul $142
AMRESCO*High Range
Protein MW
Marker 212,116,97.4,66.2,40100ul ￥187
500ul ￥892
建议6-8%胶，
点样量：5ul/well
观看英文在线讲座：二代测序的技术、应用、和数据分析概述
*AMRESCO是一家来自美国，提供生物分子学、生命科学、临床医学、组织学研究用高质量的生化试剂的生产供应商。
检测大分子量蛋白经常使用到高分子量蛋白标准，这一类蛋白Marker价值也不菲，较便宜的就是AMRESCO的（一次大约9元）和Invitrogen的BenchMark（一次mini胶大约13块钱），而且后者还有15条蛋白带。而在应用上呢，各个厂家侧重点也不同，比较有特色
的是Invitrogen公司的HiMark（Invitrogen的蛋白标准命名十分贴切，比如前面的Mark12
就是指12条带的Mark，BenchMark就是基准的意思，这里的HiMark是High Mark的缩写），HiMark这种蛋白标准可以说是真真正正的做到了高分子量——它最大的分子ladder可达到500kD！这对于想要分辨200kD以上蛋白的顾客来说确实是个福音，当然这是有凝胶限制的，合适凝胶的是NuPAGE Novex3-8% Tris-Acetate Gel 和NuPAGE Novex 7% Tris-Acetate
Gel(有一定的误差)，另外如果你想分离300kD和400kD的蛋白，HiMark也爱莫能助，因为它的条带500kD以下就是290kD，无法正确分辨中间两个数量级的蛋白。
③低分子量蛋白标准
厂家产品名Protein
Ladder(kD)
包装价格用量
Bio-Rad Polypeptide
SDS-PAGE
Standards 1.4-26.6
1.4-97.4
200ul
MBI*Protein
Molecular
Weight
Marker 116, 66.2, 45, 35,
25, 18.4, 14.4
2×1ml￥420Mini-gel 5ul/well
Full length-gel 10ul/well
BBI*Low Range
Protein
Marker 4.1, 6.5, 9.5,
14.4, 20, 27, 35,
45, 66
30ul ￥120
100ul ￥295
用Hoefer电泳系统，
8x12cm胶，可供30次上样
（100ul包装）。(建议使用
分离胶浓度15%)
AMRESCO Mid/Low
Range
Protein
MW Marker 97.4，66.2, 40,
26.6, 21.5/19.7,
14.4
1ml ￥155
5ml ￥740
建议8-15%胶，
点样量：5ul/well
GE Low MW
Range 16.949, 14.404,
10.7, 8.159,
6.214, 2.512
250ul $142
上海西巴斯生物技术有限公司低分子量标准
蛋白
97, 66, 43, 31,
22, 14.4
冻干粉￥85加入缓冲液配成200ul，每次
用10ul。
*MBI: Mathematical Biosciences Institute (The Ohio University)（https://www.doczj.com/doc/4614026412.html,/）
*BBI: 属于赛多利斯的集团子公司，赛多利斯公司是德国股票上市公司中最大的生物技术供应商之一。
在一般的蛋白电泳当中，更常用的是低蛋白标准分子量，除了有指示蛋白大小的作用以外，有时还可以用作粗略的定量（说不定哪次实验就出现了预料不到的好结果，如果这时发现没加上蛋白Marker，那可真是浪费了）。这样看来，好像低蛋白标准选购时价格高低就代表了主要的筛选标准，其实更应该注重条带的清晰锐利与否，条带均匀与否——纯化不够的Marker会成“团”而不利于判断大小，所以不能单纯以“价格”论英雄。
实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中，经常用到的，看上去也是最便宜就是上海西巴斯生物技术开发有限公司的低分子量标准蛋白了，乍一听这个公司，恐怕很多人都不知道是什么来的，这家公司其实就是中科院上海生物化学研究所旗下的一所独立核算单位，其它自制试剂未见很有名，但它的低分子量标准蛋白和次高分子量标准蛋白在各个实验室中传用的相当广泛。然而实际上，与主流产品不同，蛋白标准Marker，有些进口产品反而要更便宜，比如说上表中MBI的Protein Molecular Weight Marker，仔细算下来，就算是大胶，每次也只要大概2块钱，比上海西巴斯的4元一次便宜了一半，而且MBI的Marker 质量在业内口碑一向也不错，虽然如此，可能由于是到货时间长短和服务方便度的一些原因，前者使用的仍然会比较多。除了MBI以外，目前正在打特价的Takara的Protein Molecular Weight Marker也不错，208元可以用大约200次，详情请见特价专栏。
除了价格以外，在低分子量蛋白标准这里还包括可特别小的蛋白标准，比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。其中GE的从2kD到16kD之间有6条带的蛋白标准挺不错，另外提醒一句，特别小的蛋白Marker条带如果要显色好，上样一定要上足够的量哦。
2. 预染蛋白分子量标准
预染蛋白分子量是一些纯化好的蛋白混合物，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染蛋白分子量的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况
下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。预染Marker的条带大小也是厂家根据多种条件下实验数据给出估算的结果——ABI的4色荧光测序可以精确到千位碱基的不也是“计算”出来的吗？
预染蛋白标准可以分为两种：单色预染和多色预染，见下表（表中蛋白ladder 是根据一般实验结果得出的），其实区别就在于帮助在实验过程中辨认某个条带的大小——Marker条带越多参考价值越大，可也就越难辨认区分，如果用不同的颜色来区别就比较好辨认啦。再说了，那么沉闷的电泳实验中跑出五颜六色的彩虹Marker，绚丽如同我们美丽的梦想，这时心情想必会愉快一些的哦，哈哈。单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的。还有一点特别要注意，由于转膜是一个将胶里的Marker浓缩在洁白的膜上，所以需要的上样量相对少一些，如果想要在电泳过程中看到美丽的“彩虹”，或者单色的Marker往往需要比说明书里多加一些Marker的。
①单色预染蛋白标准
①
厂家产品名Protein
Ladder(kD)
包装价格用量
Bio-Rad Precision Plus
Protein All Blue
Standard 250, 150, 100,
75, 50, 37, 25,
20, 15, 10
500ul可用50次
Prestained
SDS-PAGE
Standards,
broad range
7.1-209500ul可用50次
High range48-204500ul可用50次Low range20-103500ul可用50次
Invitrogen BenchMark
Fluorescent
Protein Standard 11-155125ul ￥2764Mini-gel 2-5ul
Standard 5-10ul
SeeBlue(Plus2) Prestained Standard 4-250
(plus2 多两条带)
500ul ￥1537Mini-gel:
10ul(electrophoresis)
3ul(blotting)
Standard-gel:
20ul(electrophoresis)
7ul(blotting)
NEB Prestained 175, 83, 62, 48, 0.53ml/￥475Mini-gel:
Protein Marker33, 25, 17, 7 1.05ml/
￥1080
5.25ml /
￥432015ul(electrophoresis) 6ul(blotting) Standard-gel:
30ul(electrophoresis 12ul(blotting)
Pierce BlueRanger
Prestained
Protein MWM Mix 220, 1.4, 76,
45, 33, 26, 18
48-96 gel lanes
BBI Pre-stained
Protein Marker 97.4, 66.2,
42.7, 31, 14.4
25 Appli.
￥168
200ul ￥120
可供50次上样，
可供20次上样
MBI Prestained
Protein
Molecular
Weight Marker 119, 19, 46, 31,
24, 19
2X0.25ml
￥420
Mini gel: 5ul/well
Large gel: 10ul/well
在以上这些当中比较便宜的是NEB、BBI和MBI的蛋白标准了，其它相对而言就比较贵了，像Pierce的BlueRanger Prestained Protein MWM Mix 每用一次光Marker就要大概人民币110元，真是令人咋舌，不过也是物有所值：首先这种蛋白标准包装十分方便携带和使用，它是常温储存在48孔板中，每次使用不需解冻，也不会降解，只要用枪头像将吸管插入刺穿外层薄片，然后将枪头中的10ul去离子水注入Marker干粉中再吸起来就可以了，这种独立包装也可以防止污染；其次这种蛋白Marker分子量范围较广，从18.5kD到215kD（4-20%SDS-PAGE），而且难得的是在凝胶上和转移膜上各条带分布水平和显色水平一致；还有就是这种Marker也可用于染色（考马斯亮蓝染色和银染）。这各种高品质的表现，也难怪Pierce要定位在这么高的价位了。
②多色预染蛋白标准
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厂家产品名Protein
Ladder(kD)
包装价格用量
Invitrogen BenchMark
Prestained
Protein Ladder 181.8, 115.5,
82.2, 64.2, 48.8,
37.1, 25.9, 19.4,
14.8, 6.0
2×250ul
￥1961
Mini-gel:
10ul(electrophoresis)
5ul(blotting)
Standard-gel:
20ul(electrophoresis)
10ul(blotting)
蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序） 转膜实验操作要点 1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine 系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）； 2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）； 3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。如果膜变干，须重复本步骤的操作）； 4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）； 5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中； 6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）； 7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色； 8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可； 转膜实验注意事项 1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量； 2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染； 3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液； 4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；
Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件：Windows 版本 第一步：软件安装 1.下载地址：https://www.doczj.com/doc/4614026412.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本，双击软件安装。 第二步：界面介绍 1.软件界面 第三步：图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片：File> Open> Sample1.jpg 图片导入后，Sample1.jpg在新的窗口中打开
3.图片类型设置：Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景：Process> Subtract Background> …
4.1Subtract Background 窗口：Rolling ball radius 设为50 pixels， 勾选light background，可选preview，点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”
6.最大化“Sample1.jpg”窗口，便于矩形选择，矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1：矩形选择后，调整矩形至合适大小，按下数字键 “1”，或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”：拖动“1”的矩形框，会出现两个矩形选框，拖动矩形框 至泳道2，调整位置，并按下数字键“2”，Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动，会出项新的“矩形选框”，调增至泳道3，并按下数字键“2” （注意：是按下数字键“2”），重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后，按下数字键“3”，出现分析图谱。
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。 Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。 其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。 现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因- - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决 反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 --- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 - - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5 -- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物*注6 高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 ---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8 --- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 --- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足- - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10 ---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长- - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11 - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高- - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa
免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结 阿木 1、western blot 的优点 答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白？ 答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很 清亮，为什么呢？
答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲 液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小（10KD）， 请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱，怎么加强？ 答：可以加大抗原上样量。这是最主要的。 同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改
变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。 7、目标带是空白，周围有背景，是为什 么？ 答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二 抗失活。
W e s t e r n B l o t结果条带 分析 Revised final draft November 26, 2020
W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白 原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有，如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，显色液失效。另外如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。 2.高背景 原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够。 解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带 原因：一抗非特异性与蛋白结合 解决办法：更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈 原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合 解决办法：封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾 原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长 解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景 原因：膜可能曾经干过 解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形 原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状 原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一 解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲 原因：电泳电流不均一 解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔 其他问题 （1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 （2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。 （3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。 （4）整个条带呈“︶”状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。 （5）整个条带呈“︵”：凝胶左右两头没有凝固好 （6）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。 （7）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒 （8）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。
Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？ 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。 电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot
western blot实验经验总结 1.抗体的选择 对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。 进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。 进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。 国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。 我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。 2.Western Blot设备 目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
western blot转移电泳一般操作流程 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： 槽式转印半干转印 Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 -
缓冲液要求450ml ≤200 ml 电极距离4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟 冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管- 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米- 13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个 凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
Western 转膜步骤操作方法 Western转膜步骤(建议用伯乐电泳系统来操作完成) 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ?Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051） ?电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cm*9cm） ?预先切割好的印记膜： 硝酸纤维素（Cat. no. LC2000或LC2001）， PVDF（Cat. No. LC2002）或Nylon+（Cat. No. LC2003） ?转印垫（Cat. No. EI9052） ?甲醇 ?去离子水 ?转移缓冲液（配方见下文） ?用于平衡膜，滤纸和转移垫的浅盘 II. 规格： 转印槽尺寸：14.5cm x 14cm x 11cm Blot Module容积：约200ml 下缓冲液槽容积：600ml Blot尺寸：约9cm*9cm 注意：在以下步骤中，应该始终使用手套以避免凝胶和膜的污染，并防止接触电泳和电转过程中常用的刺激物。 Ⅲ材料制备 a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印系统进行成功的转膜，0.5Xtowbin缓冲液就可以提供足够的离子强度，而不产生过多的热量。这种缓冲液可能不适合其它的转印系统，反过来也是这样。一升的转膜缓冲液制备方法如下（含20％甲醇的0.5X Towbin） 使用我们的Tris-Glycine转膜缓冲液：去离子水760 ml 转膜缓冲液（Cat. No. LC3675）40 ml (25×未稀释液) 甲醇200 ml 总体积1000 ml 自己制备Tris-Glycine转膜缓冲液： Tris 碱(12mM) 1.45 g 甘氨酸(96mM) 7.2 g 甲醇（20％终浓度）200 ml
*注1其具体问题有二：一是背景较高，二是没有条带?形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色，周围因背景H R P较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到
条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄，压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有 达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态，是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象，可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整，荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。 除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单，在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积（平方毫米）乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的 所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。（见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章），超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限，而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。 所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生
持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到文案大全
条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了） 文案大全
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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。