Western免疫印迹（Western Blot）
是将蛋白质转移到膜上，然后利用
抗体进行检测的方法。对已知表达
蛋白，可用相应抗体作为一抗进行
检测，对新基因的表达产物，可通
过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法
类似，但Western Blot采用的是聚
丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋
白质，“探针”是抗体，“显色”用标记
的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转
移到固相载体（例如硝酸纤维素薄
膜）上，固相载体以非共价键形式
吸附蛋白质，且能保持电泳分离的
多肽类型及其生物学活性不变。以
固相载体上的蛋白质或多肽作为抗
原，与对应的抗体起免疫反应，再
与酶或同位素标记的第二抗体起反
应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表
达的蛋白成分。该技术也广泛应用
于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品
试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇
ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒
仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒
实验步骤一、试剂准备
1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。
二、蛋白样品制备
1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取
（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
前开离心机预冷）
（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取
（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于
0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
三、蛋白含量的测定
1. 制作标准曲线
（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）混匀后，室温放置2 min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 检测样品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。室温放置30 min后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl 溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，
加样孔的最大限度可加20 μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3. 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
五、转膜
1. 转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬
时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
六、免疫反应
1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
七、化学发光，显影，定影
1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
八、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
收起
注意事项1. 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2. 显色液必须新鲜配置使用，最后加入
H2O2。
3. DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
其他一、免疫反应
1. 用0.01 M PBS洗膜，5 min ×3次。
2. 加入包被液，平稳摇动，室温2 h。
3. 弃包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。
4. 加入一抗（按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃放置12 h以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5. 弃一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分别洗膜，5 min×4次。
6. 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01 M PBS稀释），平稳摇动，室温2 h。
7. 弃二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 min×4次。
8. 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
展
实验
材料
蛋白质样品
试剂、试剂盒裂解液PBS G 250考马斯亮蓝溶液NaCl SDS上样缓冲液电泳缓冲液转移缓冲液丽春红染液封闭液TBST TBS 洗脱抗体缓冲液显影液定影液抗体化学发光试剂
仪器、耗材高压锅玻璃匀浆器高速离心机分光光度仪-20℃低温冰箱垂直板电泳转移装置恒温水浴摇床多用脱色摇床
实验步骤一、操作步骤：
1. 蛋白样品制备
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
①倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
②每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动
1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
③按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）
④每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
⑤裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）
⑥于4℃下12000 rpm离心5 min 。（提前开离心机预冷）
⑦将离心后的上清分装转移倒0.5 min 的离心管中放于-20℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
①将少量组织块置于1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
②加400 l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
④裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml 离心管中，然后在4℃下12000 rpm 离心5 min ，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于-20℃保存。
（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：
由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（1）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：
①将培养液倒至1.5 ml 离心管中，于2500 rpm 离心5 min。
②弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm 离心5 min 。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
③用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
④将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm 离心5 min，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于-20℃保存。
2. 蛋白含量的测定
（1）制作标准曲线
①从-20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
②取18个1.5 ml 离心管，3个一组，分别标记为0 μg，2.5 μg，5.0 μg ，
10.0 μg ，20.0 μg ，40.0μg。
④混匀后，室温放置2 min 。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。
（2）检测样品蛋白含量
①取足量的1.5 ml 离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml 。室温放置30 min后即可用于测蛋白。
②取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
③弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 ml），再用无菌水洗一次。
④取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 μl待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
3. SDS－PAGE电泳
（1）清洗玻璃板：
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样
①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
②按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml 枪吸取5 ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
④按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
⑥测完蛋白含量后，计算含50 μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样
样品至0.5 ml 离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
⑦加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
（3）电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4. 转膜
（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），
一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）
（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h 或40 V转移3 h。
（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
5. 免疫反应
（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml 离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS 洗一次，10 min。
（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
6. 化学发光，显影，定影
（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X －光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X-
光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
7. 凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
图解
实
验材
料
蛋白质样品 试
剂、试剂
盒
裂解液 PBS SDS 上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体 仪
器、耗
材
电泳仪 移液器 脱色摇床 显影仪 实
验
步
骤
一、实验步骤
↓
↓
↓
↓
↓
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经典教综多选题 100 道 1.学校的精神或观念文化是校园文化的核心，可以分解为（）。A.理想成分B. 认知成分C.情感成分D.价值成分 2.下列体现了个体身心发展不平衡性特点的有（）。 A.人的身体发育总是遵循从上到下、从中间到四肢、从骨骼到肌肉的顺序 B.人的身高 和体重的增长有两个高峰期，即婴儿期和青春期 C.人的神经系统成熟在先，生殖系统成熟在后 D.失明者的听力往往比视力正常者发达 3.班级目标管理是指班主任与学生共同确定班级总体目标，然后将总体目标转化为（） A.集体目标 B.小组目标 C.个人目标 D.年级目标 4.下列属于学生注意听讲的描述有（） A.注目凝视 B.交头接耳 C.屏息静气 D.若有所思 5.下列符合现代教育制度的发展趋势的有（）。
A.加强学前教育并重视其与小学教育的衔接 B.强化普及义务教育，延长义务教育年限 C.普通教育与职业教育朝着相互渗透的方向发展 D.学历教育与非学历教育的界限日益明晰 6.“你的鞭子下有瓦特，你的冷眼里有牛顿，你的讥笑中有爱迪生。你别忙着把他们赶跑，你可不要等到坐火车、点电灯、学微积分，才认识他们是你当年的小学生”。这段话对我们进行教育工作的启示是（）。 A.要因材施教 B.要对学生循循善诱 C.要加强对后进生的教育 D.要使所有学生包括差生都得到发展 7.以下关于独立形态的教学阶段的表述，正确的有（）。A.教育作为一门独立的学科提出来，始于德国哲学家康德 B.夸美纽斯的《大教学论》标志着近代独立形态教育学的开端 C.最早的教育学研究机构，始于德国普鲁士王朝的哥廷根大学 D.把教育作为一门课程，在大学里讲授，最早始于英国哲学家培根 8.下列属于正迁移的有（）。 A.数学审题技能的掌握对物理、化学审题的影响 B.在学校爱护公物的言行影响在校外规范自己的行为 C.外语学习中，词汇的掌握对阅读的影响 D.学习汉语字母发音对英语字母发音的影响 9.古罗马医生盖伦提出人的气质类型分为（）。 A.多血质 B.胆汁型 C.抑郁质 D.粘液质 10.激情是一种强烈短暂的情绪状态，其特点（）。 A.激动性 B.弥散性 C.冲动性 D.渲染性
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
多项选择题猛练 一、电学 1．关于家庭电路，下列说法中正确的是 （ ） A ．我国家庭电路的电压是220V B ．家庭电路中的用电器都是串联的 C ．家庭电路中用电器消耗的总功率越大，电路的总电流就越大 D ．家庭电路中保险丝熔断可能是由于电路的总功率过大造成的 2．如图9所示的“热得快”铭牌上标有“220V 1000W”字样，由此可知这种 “热得快”（ ） A ．正常工作的电压为220V B ．正常工作时电流为0.22A C ．正常工作10min 消耗的电能为6×105J D ．正常工作10min 产生的热量大于6×105J 3．在如图10所示的电路中，电源两端的电压保持不变，闭合开关S 后， 滑动变阻器的滑片P 向右移动，下列说法中正确的是（ ） A ．电压表的示数变大 B ．电灯L 的亮度变暗 C ．电流表A 1的示数变小 D ．电流表A 2的示数变小 4．在如图11所示电路中，电源两端的电压保持不变，当闭合开关S1、 S3，断开开关S2时，电流表的示数为1.2A ；当闭合开 关S1、S2，断开开关S3时，电流表的示数为0.3A ； 当闭合开关S2，断开开关S1、S3时，电流表的示数为 0.15A 。关于此电路工作情况的分析，下列说法中正确 的是（ ） A ．只闭合开关S 1时，电流表的示数为0.3A B ．只闭合开关S 2时，电阻R 2消耗的电功率是电阻 R 3消耗的电功率的2倍 C ．开关S 1、S 2、S 3都闭合时，电流表的示数为3A D ．只断开开关S2与只闭合开关S2两种情况下电压 表的示数之比为2:1 5．用锰铜合金制成甲、乙两段电阻丝，它们长度相同，但是甲比乙细。若将它们连接在同一 电路中，通过甲、乙两段电阻丝的电流分别为I 甲、I 乙；甲、乙两段电阻丝两端的电压分别为U 甲、U 乙。下列关系可能成立的是 A ．I 甲＝I 乙 B ．I 甲＞I 乙 C ．U 甲＞U 乙 D ．U 甲＝U 乙 6．在如图6所示的实验中，用酒精灯给试管加热，试管内水的温度 逐渐升高直至沸腾。水沸腾后，橡胶塞从试管口飞出，试管口附 图10 S A 1 A 2 V L R P 图 11 甲 R 1 R 3 S 3 A S 1 甲 S 2 R 2 V 图9
充电不?时，秒针会每两秒?动?下。按照“充电时间指南”（第64页）?节 中的说明，给?表充电。 请每??次地将?表较长时间置于直射阳光下 充电。 ?
本表可以在时间模式（TME ，三个位置）和当地时间模式（L -TM ）内接收电 波。不能在任何其他模式内接收电波。 定时接收（?动接收） ?需操作按钮可进?定时接收。 本表会在每天上午2点接收电波。如在上午2点没有接收到电波，则会在上午4点 再次?动接收，据此调节时间和?期。 强制接收（?动接收） 可在任何时间接收电波。 因接收环境的变化不能进?定时接收时请利?此功能。进?强制接收时请勿移动 ?表以确保正确接收电波。（最多需要?约13分钟。） ???<接收电波>从?腕上取下?表，将其置于易于接收电波的窗?附近的稳定的平?上，并将6点位置对准电波发讯基地台?向。按下位于4点位置的(A )钮两秒以上开始强制接收。确定?响起并且秒针?到RX ：接收就绪位置（12点）后，放开按钮。在?出和?落前后可能难以接收电波。请勿在此时间段内接收电波。有关接收电波的详情，请参照“电波接收”（第18页）。在定时接收时不必按下右下侧(A )钮。<确认接收状态>要确定接收电波是否正确，请在试图接收电波后按位于4点位置的(A )钮。正确接收电波时，秒针显?H 、M 或L 。此时，本表可以使?。没有正确接收电波时，秒针显?NO 。改变?表位置再次接收。??? 电波接收的步骤
?表因被收起或因被?服遮盖?不受光照30分钟或更长，秒针将停在12点位置以 省电。 其他表针将继续正常?动。 ?旦?表再次接受光线照射，节能功能将取消，秒针开始正常?动。 * 有关细节，请参阅“节能功能”（第62页）。 ???录1. 您的?表........................................................................................122. 操作表把........................................................................................133. 使?之前........................................................................................14A . 电波接收功能 ..........................................................................14<为了提?接收效果>......................................................................14<接收需要的时间> .........................................................................15<接收较差区域> .............................................................................16电波接收4. 电波接收........................................................................................18A . 接收时的秒针位置 ...................................................................21B . 确认接收状态 ...........................................................................22C . 接收程度和接收状态................................................................23D . 接收区域说明 ..........................................................................24节能功能
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
多选题 31．专业的公关人员务必具备的公共关系观念应当包括（BCD ）P84 A．社会意识B．公众观念C．形象观念D．互惠观念E．整体意识 32．“传播沟通”是公共关系的本质属性。理解这一命题的角度应当包括（CDE ）P7-8 A．公共关系的形象性质B．公共关系的舆论性质 C．公共关系的关系性质D．公共关系的职能性质 E．公共关系的学科性质 33．树立组织形象的好处在于（BCE ） A．增强组织的应变潜力 B．组织形象是组织的无形资产 C．良好的组织形象能够激励士气 D．良好的组织形象是组织的有形资产 E．良好的组织形象有利于营造和谐的组织社区环境 34．根据公众发展的不一样阶段，能够将公众分为（BCDE ）P114 A．正式公众B．非公众C．潜在公众D．知晓公众E．行动公众 35．作为舆论主体的公众具有的特点有（ABCDE ） A．有共同话题B．参与议论过程 C．自发性D．松散性E．层序性 36．组织公关效果评估中，新闻舆论分析报告主要包括的资料有（BCE ）P201-202 A．新闻报导趋势分析B．新闻报导量分析 C．新闻报导质分析D．新闻报导舆论分析 E．新闻报导时机分析 37．下列属于印刷类大众传播媒介的有（ADE ） A．书籍B．电子邮件C．电子报纸D．报纸E．杂志 38．下列属于社会公益活动的有（ABC ） A．设置奖学金B．捐赠慈善机构 C．修建期望小学D．资助贫困大学生E．资助学术研讨会
39．公共关系在企业中的作用突出表此刻（AB ） A．内求团结B．外求发展 C．提高企业经济效益D．提高产品市场占有率 E．提高企业发展潜力 40．口头语言交流的一般特点有（ABCD ）P285-286 A．直接性与随时性B．双向性与反馈性 C．情感性D．主观性E．真实性 1．现代组织经营管理的“四大支柱”是（BCDE） A．舆论B．人才C．公关D．资金E．技术 2．公共关系活动过程中的基本要素包括（ADE） A．公众B．个体C．群体D．传播沟通E．组织 3．公共关系产生与发展的社会条件有（ACDE） A．人性文化的兴起B．军事技术的突飞猛进C．民主政治深入发展D．市场经济高度发达E．大众传播技术的日趋普及与提高 4．专业公关公司服务的特点有（ABCDE） A．较为客观公正B．技术全面，专业性强C．较灵活，适应性强 D．关系较疏远 E．运作成本较高 5．公众的基本特征包括（ABCDE） A．整体性B．共同性C．相关性D．多样性E．变化性 6．霍夫兰认为人的态度改变主要取决于（ABC） A．说服者的条件B．信息本身的说服力 C．问题的排列技巧D．被说服者的条件 E．问题的性质和资料 7．拉斯韦尔把传播学的研究资料分为（ABCDE） A．控制分析B．资料分析 C．媒介分析D．对象分析E．效果分析
Western免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白，可用相应抗体作为一抗进行 检测，对新基因的表达产物，可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋 白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转 移到固相载体（例如硝酸纤维素薄 膜）上，固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质，且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；
SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000 rpm离心5 min。（提
Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃ 4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA） 12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟） 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。/凝胶/）将此滤纸3．
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。 7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。 8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜） 9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。 10．将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。 11．按步骤9洗涤。 12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。 注意事项： western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒 进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生
1．美育的内容主要包括（） A．艺术美 B．心灵美 C．社会美 D．科学美 E．自然美答案：ACDE ★2．小学课外活动的基本组织形式有（） A．群众性活动 B．小组活动 C．班级活动 D．文化艺术活动 E．个人活动答案：ABE 3．同其他形式的教育相比，家庭教育具有（） A．先导性 B．感染性 C．终身性 D．个别性 E．针对性答案：ABCDE 4．家庭教育、学校教育、社区教育三教结合的基本形式有（） A．互相访问 B．通讯联系 C．家长会 D．教育讲座 E．家庭学校答案：ABCDE 5．教师劳动具有下列特点（） A．复杂性 B．创造性 C．示范性 D．长期性 E．权威性答案：ABCD 6．关于学生在教育过程中的地位，教育史上曾出现过下列观点（） A．教师中心论 B．个人本位论 C．社会本位论 D．儿童中心论 E．教育万能论答案：AD 7．下述对小学生个性发展方面的描述，正确的说法有（） A．个性已基本形成 B．性格已基本定型 C．兴趣广泛，但不稳定 D．学习动机较为单纯 E．性格外向、活泼好动答案：CDE
1．教育的具体而实在的规定性主要体现在（） A．教育是人类所特有的一种有意识的社会活动 B．教育具有经济功能 C．教育具有政治功能 D．教育是人类有意识地传递社会经验的活动 E．教育是以培养人为直接目标的社会实践活动答案：ADE 2．教育实验作为一种研究方法，具有哪些基本特征？（） A．有理论假说 B．变量控制 C．有变革 D．可重复操作 E．能促进学生发展答案：ABCD 3．杜威实用主义所提倡的主要教育观点有（） A．教育即生活 B．学校即社会 C．教学为中心 D．儿童为中心 E．从做中学答案：ABDE 4．下列哪些教育理论著作属于教育学萌芽时期的作品？（） A．《学记》 B．《论语》 C．柏拉图的《理想国》 D．赫尔巴特的《普通教育学》 E．赞可夫的《教学与发展》答案：ABC 5．我国古代社会教育具有下列特点（） A．产生了专门的教育机构和执教人员 B．鲜明的阶级性和严格的等级性 C．教育与生产劳动的分离和对立 D．教育方法崇尚书本，呆读死记 E．官学、私学并行的教育体制答案：ABCDE 6．自然环境对教育的直接影响主要表现在（） A．适应自然的教育的价值取向 B．自然环境制约着一定的教育内容选择 C．影响教育的组织机构和组织形式 D．影响教育发展战略的选择 E．制约教育发展的规模和速度答案：ABC 7．现代教育所独有的教育功能有（） A．政治功能 B．人口功能 C．文化功能 D．生态功能
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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
中文增强特点和功能指南
增强特点和功能指南 1 2 3 4 目 录 5 6 7
1.如何使用速度计 速度计通常用于测量汽车行驶过一段已知距离 之后的大概速度。 例）根据汽车行驶1公里或1英里所花费的秒 数（可用的最大测量范围为60秒）， 可计算该距离内的平均速度。 1）当汽车开始行驶时启动秒表。 2）在汽车行驶了1公里/1英里之后，停止秒表。通过观察秒针的当前位置和外表盘的读数，可确定该距离内的大概平均速度。 注意：速度计指示可能出现在刻度盘上，而非外表盘上（根据机型而定）。 如图所示，汽车行驶1公里或1英里花了45秒，因此大概平均速度为每小时80公里（每小时50英里）。
中文 〈检查剩余时间〉 将“▼”标记设到计划的时间。 ·您现在就可以看出直到计划点之前的剩余时间。 注意：符合ISO或JIS标准的潜水者手 表的旋转表盘仅可逆时针旋转，以减少出现错误的危险。 3.如何使用旋转表盘测量时间 〈检查经过时间〉 1）将旋转表盘上的零标记“▼”对到 分针的位置。 2）然后，读出旋转表盘上分针指向的 刻度以得出经过时间。如图中所 示，经过时间为10分钟。 经过时间
中文 4.如何使用计算器功能 注意：在某些机型中，内圈和外圈刻度是相反的。请确保对以下指示做正确 的更替。4-1. 简单计算 ［如何相乘］ 问：20 × 15 答：调整外圈刻度20使其指向内圈刻度10。 您可以从对应于内圈刻度15的外圈刻度上读出数字30，加上一个单位就
中文 ［如何相除］问：250 ÷ 20 答：调整外圈刻度25使其指向内圈刻度20。 您可以从对应于内圈刻度10的外圈刻度上读出数字12.5，得出答案12.5。 ［如何计算比率］问：30/20 = 60/A 答：调整外圈刻度30使其指向内圈刻度20。 您可以从对应于外圈刻度60的内圈刻度上读出数字40，并且在刻度上的所
1.压缩气体和液化气体包括（） A．易燃气体 B.不然气体 C.有毒气体 D.助燃气体 2.易燃固体的危险性与易燃固体自身的（）等因素有关 A．燃点B．熔点C．自燃点 3.腐蚀品主要包括（） A．一级无机酸性腐蚀物质和一级有机酸性物质 B．二级无机酸性腐蚀物质和二级有机酸性腐蚀物质 C．无机碱性腐蚀物质和有机碱性腐蚀物质 D．其他无机腐蚀物质和其他有机腐蚀物质 4.燃烧三要素是（） A．点火源B．冲击波C．助燃物D．可燃物 5.乙炔气体在（）情况下可发生爆炸 A．与空气形成爆炸性混合物，遇点火源时B．高压下 C．在爆炸极限上限以上的空气混合物，遇点火源时D．在其容器遇高温时 6.爆炸的主要破坏形式有（） A．直接的破坏作用B．冲击波的破坏作用C．造成火灾D．造成中毒和环境污染7.易燃固体的危险特性主要有（） A．易燃性 B.可分散性 C.热分解性 D.自然性 8浓硫酸不得与下列物质中的（）混合存放 A．氢氧化钠B．盐酸C．丙酮D．乙醇 9.电石不得与下列物质中（）混合存放 A．硫酸B．硫磺C．过氧化钠D．氰化钙 10.氧气钢瓶不得与下列物质中的（）混合存放 A．乙炔钢瓶B．氩气钢瓶C．氮气钢瓶D．液化钢瓶 11.易燃易爆作业场所，作业人员应穿戴（） A．防静电服B．防静电鞋C．棉布防护服D．绝缘鞋 12．若所有逃生线路被大火封锁时该怎么办？（） A、要立即退回室内 B、用打手电筒、挥舞衣物，呼叫等方式向窗外发送求救信号，等待救援 C、千万不要盲目跳楼，可利用疏散楼梯、阳台、落水管等逃生自救 D、也可用绳子或把床单、被套撕成条状连成绳索，紧拴在窗框、暖气管、铁栏杆等固定物上，用毛巾、布条等保护手心，顺绳滑下，或下到未着火的楼层脱离险境 E、若有电梯赶快乘电梯逃生。 13. 以下哪些措施可用作正确的避难措施？（） A、关闭迎火的门窗，打开背火的门窗进行呼吸，等待救援； B、用湿毛巾、床单等物堵住门窗缝隙或其它孔洞，或挂上湿棉被或不燃物品，并不断洒水，防止烟火渗入； C、赶快打开门窗跳楼逃生； D、用湿毛巾捂住口鼻，防止被浓烟呛伤和热气体灼伤； E、大火进入房间，利用阳台或爬出窗台，避开烟火和熏烤； F、积极与外界联系呼救； 14. 火灾中致人死亡的原因有哪些？( ) A.有毒气体 B. 缺氧 C. 烧伤 D. 吸入热气 15. 油锅着火后怎么办？（）
多项选择题 1、以“如果渎职，则犯法”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是（1）渎职（4）没犯法 2、以“如果天下雨，那么地湿”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是（3）并非没有下雨（4）地不湿（5）下雨 3、在“有的不道德的行为是不合法的行为”这个判断中，主项和谓项都是（2）普遍概念（3）负概念(4）集合概念 4、下列对概念限制错误的是 (1)判断限制为概念 (3)论证限制为论题 (5)复合判断限制为负判断 5、下列推理中，根据对当关系中的反对关系而进行推理的有效式是 (1)SAP→并非SEP (3)SEP→并非SAP (5)SAP→并非SOP 1、在"中国是世界上人口最多的国家"这一判断中,主项和谓项都是(1)单独概念 (3)集合概念(4)正概念 2、下列对概念限制错误的是(1)判断限制为概念 (3)论证限制为论题(4)间接推理限制为类比推理 3、"我们不靠天吃饭,而靠天吃饭是做自然界的奴隶,所以,我们不做自然界的奴隶"这个三段论(35 ) (3)犯大项不当周延的逻辑错误(5)违反"前提中不周延的大项和小项,在结论中也不得周延"的规则 4、下列各组判断中,具有等值关系的是(1)"如果p,那么q"与"只有q,才p"(2)"必然非p"与"不可能性p"(3)"并非有S不是p"与"所有的都是p"(4)"没有s是p"与"并非有s都是p"(5)"p并且非q与并非(如果p,那么q)" 5、下列逻辑错误属于违反同一律要求的是(1)定义过窄(2)多出子项(3)推不出 1．“屈原是伟大的诗人”这句话中划有横线的概念是属于②普遍概念④肯定概念 2．下列各组概念在外延上具有反对关系有（）。 ①假言判断、选言判断②类比推理、归纳推理③间接推理、类比推理 3．违反“划分必须是相应相称的”这一划分规则所犯的逻辑错误是①多出子项②划分不全 4．下列概念不能划分和限制的是①泰山④月亮 5．下列各组概念依据箭头所指示的推演关系，属于错误限制或错误概括的是 （②关系判断→简单判断→复合判断③大学→北京大学→北京大学历史系 6．概念和语词的关系可表达为①语词是概念的语言表达形式②概念是语词的思想内容 ③任何概念都要用语词来表达⑤有的语词不表达概念 7．如果所有的a是b，那么a与b的外延关系可能是①全同关系③真包含于关系 8．当SAP真而SOP假时，S与P的外延关系应是①全同关系③真包含于关系 9．违反“定义项外延与被定义项外延之间必须是全同关系”这一定义规则，所犯的逻辑错误有④定义过宽⑤定义过窄11．下列各组概念中a真包含于b的有①三段论、间接推理②性质判断、简单判断③判断、推理④联言判断、复合判断⑤定义、逻辑方法 1．一个有效的三段论的小项、中项、大项分别为S、M、P，如P在结论中周延，则其大前提不能是（）。 ③MAP ④POM ⑤PIM 2．以“所有P是M”、“所有的S不是M”为大、小前提进行三段论推理，可必然推出①所有的S不是P③有的S不是P 3．当肢判断“p”、“q”均真时，下列判断为真的是（）。 ①p∧q ②p→q ③p←q ④p∨q ⑤p←→q ①②③④⑤ 4．当“p←→q”为真时，则其肢判断的真假情况是①p真q真②p假q假⑤p假q真 5．当p真q真时，下列复合判断为真的有（）。 ①p∧q ②p∨q ③p←→q ④p→q ⑤p←q ①②③④⑤ 6．已知“p∧q”为真，则（）为假。④p←q ⑤p∨q 7．以“如果贪污腐化，就会构成犯罪”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是（）。 ③并非没有贪污腐化④末构成犯罪⑤贪污腐化③④⑤ 8．以“只有反腐倡廉，才能搞好党风”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是①没有反腐倡廉②搞好党风 9．以“如果受贿，么犯法”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是①受贿②末犯法 2、当p假q假时，下列复合判断为假的有（(1)p∧q (2)p∨q (3)p要么q 3、以“如果受贿，那么犯法”为前提进行假言直言推理，其小前提可以是（1）受贿（2）末犯法 4、不矛盾律的适用范围是（1）具有矛盾关系的判断（2）具有反对关系的判断（4）具有下反对关系的判断 5、下列判断作为推理结论，可用完全归纳推理推出的是 2 3 4
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920290946.4 (22)申请日 2019.03.07 (73)专利权人 上海崇越航空科技有限公司 地址 201304 上海市浦东新区书院镇万松 路88号9幢12号楼地上1至3层 (72)发明人 赵崇超 (74)专利代理机构 上海昱泽专利代理事务所 (普通合伙) 31341 代理人 孟波 (51)Int.Cl. G01C 23/00(2006.01) (54)实用新型名称 一种转盘式航空计算尺 (57)摘要 本实用新型公开了一种转盘式航空计算尺， 包括尺子本体，尺子本体包括正面盘和反面盘， 正面盘和反面盘由定位夹条连接固定，正面盘包 括正面底盘和正面转盘，正面转盘可转动的固定 在正面底盘上，反面盘包括反面底盘和反面转 盘，反面转盘可转动的固定在反面底盘上；定位 夹条包括左定位夹条和右定位夹条，左定位夹条 和右定位夹条之间设有插卡，插卡可在左定位夹 条和右定位夹条、正面底盘和反面底盘之间抽插 移动，插卡分别与左定位夹条和右定位夹条连 接；右定位夹条靠近插卡的一侧设有阻尼发生装 置。采用上述技术方案制成了一种耐磨、防水、轻 薄便携且精度高的转盘式航空计算尺。权利要求书1页 说明书3页 附图7页CN 209372087 U 2019.09.10 C N 209372087 U
权 利 要 求 书1/1页CN 209372087 U 1.一种转盘式航空计算尺，其特征在于，包括尺子本体，所述尺子本体包括正面盘和反面盘，所述正面盘和反面盘通过定位夹条连接固定，所述正面盘包括正面底盘和正面转盘，所述正面转盘可转动的固定在正面底盘上，所述反面盘包括反面底盘和反面转盘，所述反面转盘可转动的固定在反面底盘上；所述定位夹条包括左定位夹条和右定位夹条，所述左定位夹条的上表面与正面底盘的下表面连接固定，所述左定位夹条的下表面与反面底盘的上表面连接固定，所述右定位夹条的上表面与正面底盘的下表面连接固定，所述右定位夹条的下表面与反面底盘的上表面连接固定；所述左定位夹条和右定位夹条之间设有插卡，所述插卡可在左定位夹条和右定位夹条、正面底盘和反面底盘之间抽插移动，所述插卡分别与左定位夹条和右定位夹条连接；所述右定位夹条靠近插卡的一侧设有阻尼发生装置。 2.根据权利要求1所述的一种转盘式航空计算尺，其特征在于，所述正面底盘和正面转盘的材质为透明塑料。 3.根据权利要求1所述的一种转盘式航空计算尺，其特征在于，所述反面底盘和反面转盘的材质为透明塑料。 4.根据权利要求2所述的一种转盘式航空计算尺，其特征在于，所述正面底盘的下表面和正面转盘的下表面上均印有刻度和文字，所述正面底盘下表面上的刻度和文字上覆盖有油墨层，所述正面底盘下表面的油墨层上贴有保护膜，所述正面转盘下表面的刻度和文字上覆盖有油墨层，所述正面转盘下表面的油墨层上贴有保护膜。 5.根据权利要求3所述的一种转盘式航空计算尺，其特征在于，所述反面底盘的上表面和反面转盘的上表面上均印有刻度和文字，所述反面底盘上表面上的刻度和文字上覆盖有油墨层，所述反面底盘上表面的油墨层上贴有保护膜，所述反面转盘上表面的刻度和文字上覆盖有油墨层，所述反面转盘上表面的油墨层上贴有保护膜。 2
1：影响管理幅度的因素主要包括（） 1.工作环境 2.工作特征 3.工作能力 4.工作条件 5.工作时间 答案为： 1 2 3 4 2：下列表述中，哪些是人本原理的主要内容？（） 1.人是管理的主体 2.有效管理的关键是员工参与 3.现代管理的核心是使人性得到最完美的发展 4.人与自然的和谐统一 5.管理是为人服务的 答案为： 1 2 3 5 3：管理的法律方法的特点是（）。 1.概括性 2.规范性 3.强制性 4.稳定性 5. 针对性 答案为： 1 2 3 4
1.人 4：管理的基本问题包括（） 2.财 3.物 4.计划 5.组织 答案为： 1 5 5：目标管理法是对管理人员和专门职业人员进行绩效评估的首选方 法。那你认为企业采用目标管理的优点在于：（） 1.有利于组织全面提高管理水平 2.有利于改善组织结构 3.有利于诱发人们的责任感 4.有利于开展有效的控制工作 5.只有 A+C 答案为： 1 2 3 4 6：按照职能空间的分类标准，计划的类型有：（） 1.业务计划 2.非程序性计划 3.财务计划 4.人事计划 5.战略计划
1.人 答案为： 1 3 4 7：管理的二重性是指（）
1. 管理的科学性 2.管理的社会属性 3.管理的应用性 4.管理的自然属性 5.管理的艺术性 答案为： 2 4 8：列哪些特征属于结构性问题 ( ) 1.发生的频率很少 2.结果可以预测 3.具备以往的经验 4.B+C 5.信息不够完备 答案为： 2 3 4 9：)是组织中参谋人员发挥作用的主要方式。 1. 确定型决策
1. 管理的科学性 1.协商权 2.建议权 3.指挥权 4.传递权 5.职能权 答案为： 1 2 4 5 10：从环境因素的可控程度看，可以把决策分为( 1. 确定型决策
沈阳工程学院 课程设计 设计题目：用于带式输送机的一级圆柱齿轮 减速器设计 系别机械学院班级机制专121 学生姓名学号 指导教师郭维城朱爽职称讲师起止日期：2014 年 6 月 30 日起——至 2014 年月 11 日止
沈阳工程学院 机械设计课程设计成绩评定表 系（部）：机械学院班级：机制专121 学生姓名： 指导教师评审意见 评价内容具体要求权重评分 加权 分 调研论证能独立查阅文献,收集资料；能制定课程设计方案 和日程安排。 0.1 5 4 3 2 工作能力态度工作态度认真，遵守纪律，出勤情况是否良好，能 够独立完成设计工作， 0.2 5 4 3 2 工作量按期圆满完成规定的设计任务，工作量饱满，难度 适宜。 0.2 5 4 3 2 说明书的质量 说明书立论正确，论述充分，结论严谨合理，文字 通顺，技术用语准确，符号统一，编号齐全，图表 完备，书写工整规范。 0.5 5 4 3 2 指导教师评审成绩 （加权分合计乘以12） 分加权分合计 指导教师签名：年月日 评阅教师评审意见 评价内容具体要求权重评分 加权 分 查阅 文献 查阅文献有一定广泛性；有综合归纳资料的能力0.2 5 4 3 2 工作 量 工作量饱满，难度适中。0.5 5 4 3 2 说明书的质量说明书立论正确，论述充分，结论严谨合理，文字 通顺，技术用语准确，符号统一，编号齐全，图表 完备，书写工整规范。 0.3 5 4 3 2 评阅教师评审成绩 （加权分合计乘以8） 分加权分合计 评阅教师签名：年月日课程设计总评成绩分
沈阳工程学院 课程设计任务书 课程设计题目：用于带式输送机的一级圆柱齿轮 减速器设计 系别机械学院班级机制专121 学生姓名刘天河学号 13 指导教师郭维城、朱爽职称讲师 课程设计进行地点：实训E312 任务下达时间： 2014年6月29日 起止日期： 2014年6月30日起——至2014年7月12日止 教研室主任年月日批准 用于带式输送机的一级圆柱齿轮减速器设计的原始资料及要求
多选题汇总 1、行政赔偿要件是（）。 A、请求人的赔偿申请必须先向赔偿义务机关提出 B、请求人必经有请求权 C、必须法定期限内提出 D、所提赔偿请求必须是法律规定的赔偿范围之内 答案：BCD 2、下列哪些是执行职务范围的行为？（） A、公安机关违法限制公民人身自由 B、为执行职务而采取不法手段 C、利用职务之便，为个人目的所实施的行为 D、于执行职务时间或处所内实施的行为 答案：ABCD 3、根据我国《宪法》的规定，关于动员和紧急状态的决定权，下列哪些选项是正确的？ A.全国人民代表大会常务委员会有权决定全国总动员 B.全国人民代表大会常务委员会有权决定全国进入紧急状态 C.国务院有权决定个别省、自治区、直辖市进入紧急状态 （国务院依法决定省、自治区、直辖市的范围内部分地区进入紧急状态）
D.国务院有权决定局部动员 答案：AB 4、根据我国《宪法》和法律的规定，下列哪些人员是国务院组成人员？ A.外交部副部长 B.国家发展和改革委员会主任 C.国有资产监督管理委员会主任 D.审计署审计长 答案：BD 5、关于行政处罚的执行，说法错误的是（）。 A：行政处罚决定依法作出后，当事人应当在行政处罚决定的期限内，予以履行。 B：当事人对行政处罚决定不服申请行政复议或者提起行政诉讼的，行政处罚停止执行。 C：作出罚款决定的行政机关应当与收缴罚款的机构分离。 D：当事人应当自收到行政处罚决定书之日起（十五日内）七日内，到指定的银行缴纳罚款。 答案：BD 6、行政机关进行行政处罚时，收集证据的做法正确的是（）。 A：依照法律、法规的规定进行检查 B：采取抽样取证 C：将证人传唤到行政机关提供证言