1.异染现象：染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到
被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。
2.自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同
颜色的荧光，这是自发荧光。
3.诱发荧光：细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始
可呈现一定颜色的荧光，称为诱发荧光。
4.点计数：计数落于所测图像（轮廓面）内的测点数。
5.交叉点计数：计数侧线与所测图像的周界线之间形成的交叉点的数目。
6.DAB：是3，3ˊ-二氨基联苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黄色产
物，可在光镜和电镜下观察。
7.形态计量术(morphometry)：是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种
成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量。
8.各向同性：是指特征物在各个方向上都分布均匀的特性。
9.各向异性：是指特征物在各个方向上分布不均匀的特性。
10.饲养细胞：在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，
必须加入其他活的细胞才能使其生长繁殖，加人的细胞称为饲养细胞(feeder cell)。
11.不完全抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝
大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。
12.生物素标记法：将生物素用酶学方法或化学方法连接在核酸探针上，分子杂
交后利用抗生物素对生物素具有高度亲和力的特性，用标记的生物素蛋白或链酶抗生素蛋白进行检测。
13.灰度：是指一个像素色泽的深浅，它以整数值的形式表示，可表示为
K=0,1,2…K个级别，称量化级别。灰度值越小，表示染色深度越强，物质含量越高。
14.特征物：就是指要定量研究的形态结构，即感兴趣的某种组织结构，它具有
一定的形状和分界，在肉眼或显微镜下可以识别或分辨。
15.荧光免疫组化：采用荧光素标记已知抗体，在适合的情况下，与组织细胞中
的靶抗原（或抗体）反应，可在荧光显微镜下观察结果。
16.原位杂交组化：是应用已知碱基顺序并带有标记物核酸按碱基配对的原则进
行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。
二、简答题
1、试述荧光显微镜的原理、结构及生物学应用
答：①原理：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素A呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色～金黄色荧光。但是,细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光；如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的DNA 呈绿～黄绿色荧光，细胞质及核仁内的RNA呈桔黄～桔红色荧光。
②结构：它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显
微镜。
③应用：是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。
2、免疫组织化学中如何进行抗原修复，其方法有哪些？
答：①蛋白酶消化：a、胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。b、胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示。
②抗原热修复：可根据实验室的具有条件，选用微波炉抗原修复、高压
锅抗原修复或水浴高温抗原。（例：石蜡切片微波炉抗原修复的具体步骤）
3、酶组织化学的方法通常有哪些，注意事项，举例说明细胞色素氧化酶的原理。（不全）
答：免疫酶组织化学法是抗原抗体的特异性与酶的高效催化作用相结合的一种免疫标记法。通过用酶标记抗原或抗体的示踪，对呈色反应后的有色化合物进行分光光密度的测定，可对免疫阳性产物做半定量的分析。
①标记酶法：1)辣根过氧化物酶（HRP）易获得,分子小,易穿透到细胞内；2)碱性磷酸酶(ALP)；3)葡萄糖氧化酶
②非标记抗体免疫酶法：1）PAP法；2)双桥PAP法；3)APAAP法
③亲和免疫组织化学技术
④放射自显影标记法
⑤胶体金法
酶组织化学技术的注意事项：①选择最适温度、ph值及缓冲液；②为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长；③有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂；④进行对照试验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照。
细胞色素氧化酶显示法的原理：细胞色素氧化酶被认为是线粒体膜固有的酶，在含有大量线粒体的细胞内都具有高度活性。此酶活性往往作为细胞内氧化代谢的指标，亦作为线粒体的标志酶之一。细胞色素氧化酶的抑制剂是氰化物和叠氮化物。此酶对固定剂敏感，故需使用新鲜切片。本实验用N-苯基-对-苯二胺为底物，在有氧存在的情况下，经酶作用可与萘酚生成靛酚，称为Nadi反应。
4、什么是单克隆抗体与多克隆抗体，试比较它们的优缺点。
答：①由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称为单克隆抗体，具有特异性强、纯度高的特点。
②将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体。
③比较:单克隆抗体结构均一，纯度高，特异性强、效价高，而且一旦制备成功就可以永续生产完全一致的抗体。多克隆抗体在特异性方面无法与单克隆抗体相比，易出现交叉反应，而且是即便是用相同抗原制备的不同批次的多抗也不能保证其一致性，因而多抗在特异性、一致性方面有很大局限。但多抗有制备时间短、首次制备成本低的优点。
5、免疫酶组织技术常用于标记物的酶有哪些，试比较其优缺点。
答：①常用的标记酶：1)辣根过氧化物酶（HRP）易获得,分子小,易穿透到细胞内；2)碱性磷酸酶(ALP)；3)葡萄糖氧化酶
②比较（百度去吧）
6、免疫组织化学中实验结果的判断如何进行
答：免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。
①阳性反应的染色特征：1)阳性细胞分布呈灶性和弥漫性；2)阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
②假阳性及其处理：1)所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别是使用多克隆抗血清时较易出现；2)组织细胞内含有DAB沉淀相类似的色素;3)假过氧化物酶活性：组织中存在红细胞时，即不加过氧化物酶，也可出现阳性结果。
③非特异性染色特征:1）组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称非特异性背景染色；2）常出现在切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，表现为无一定的分布规律，常呈现某一部位成片的均匀着色。
7、简述体视学中抽样设计时应该注意的事项。（书P.110）
答：①确定总体或参照空间，样本要取自整个参照空间；②样本含量不是由参
照空间的大小确定的，是由特征物在参照空间内的分布情况、抽样方法和拟获得的一定的准确性确定的；③样本的抽取应该是随机的，应排除主观影响；④抽取切片、视野等研究一定条件下的某种生物器官时，实际用于计算平均估计值、标准差等的样本是生物器官构成的样本，样本含量就是生物的数目。切片仅是估计某一生物器官的样本，视野仅是某一切片的样本；⑤阶段抽样的重点是较初级阶
段的抽样，阶段抽样的原则是：宁多而粗，勿少而精；⑥若最终计数的测点数已达100—200个，则样本含量已足够；⑦注意选择适当的显微放大倍数；⑧做一试点研究或实际考察对于抽样设计是很有用的，尤其对于一项新开始的研究。
8、简述细胞凋亡研究在免疫学中的重要意义，细胞凋亡的检测方法和原理。
答：①在免疫学中的意义：细胞凋亡对于淋巴细胞的成熟和维持免疫系统的功
能至关重要。在淋巴细胞的发育分化过程中，自身反应性B细胞克隆的清除以及通过一系列阳性选择和阴性选择，形成CD4+辅助性T淋巴细胞和CD8+抑制性T 淋巴细胞的过程，都是通过细胞凋亡来实现的；LAK等免疫活性细胞可以通过诱导细胞凋亡来杀伤靶细胞；为了防止过高的免疫应答，受抗原刺激而活化的T 淋巴细胞自身可以通过诱导细胞死亡过程走向凋亡。
②检测方法：
1）形态学方法，包括光学显微镜观察、视频时差显微技术、电子显微镜观察等。原理：凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体；在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，与周围细胞分离，不引起炎症反应。
2）生物化学方法，测定染色体DNA断裂及其细胞形态。
原理：细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，染色质DNA在核小体间被切割成50—300kb的片段，或180—200bp整数倍的单或寡核苷酸片段。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的连续的梯形DNA图谱。
3）免疫化学方法。
原理：细胞凋亡时，细胞染色体DNA断裂，断裂的DNA与组蛋白H2A、H2B、H3和H4，形成复合物，保护其DNA不被核酸内切酶降解。采用抗组蛋白和抗DNA 的单克隆抗体酶联免疫分析法进行测定，即可显示细胞凋亡。
4）分子生物学方法。
原理：细胞凋亡时，由于DNA的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量大的DNA上形成单的断裂。此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苷酸3，-OH端予以显示。
9、实验设计：碱性蛋白酶在细胞中的分布，定位的原理、方法及结果显示。
另四道题
1、组织化学技术的基本要求。
答：①尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。②化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位的准确性。为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不移位，不弥散。③反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。④反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。⑤反应物有灵敏性和特异性,以利于对比观察。⑥反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。
2、免疫组织化学技术包括哪些？（或参照书P.15）
答：①根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类：
1）直接法将标记物与第一抗体结合后，直接加到细胞或组织上，在适当条件下，抗体与抗原反应。
2）间接法与（待检物）抗原特异性结合的第一抗体未被标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体金等标记。
②根据标记物或呈色物的不同分类：
1)免疫荧光法
2)免疫酶组织化学法
3、荧光标记/抗体标记中，其主要作用是消除或降低非特异性荧光和交叉荧光染色的影响，其方法和步骤是什么？（书P.61)
答：①用于标记的抗体应该特异性强并且效价高，标记后通过层析或透析的方法去除游离的荧光素。
②载玻片、盖玻片应清洁，无自发荧光。
③非免疫血清，如10%牛血清白蛋白先孵育切片，再进行荧光抗体的反应。如条件允许，可采用与二抗同种属的动物血清预先孵育。
④将抗体的浓度调整到高度稀释，并且是相应抗原-抗体反应的适合浓度，如1:1000和1:2000均有免疫阳性，则应采用1:2000的浓度。
⑤观察标本时，必须用无自发荧光的镜油。
4、琥珀酸脱氢酶，，，，，，硝基蓝四氮唑，，，，（什么问题来）
第一章绪论 一、选择题 [A型题] 1.PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂肪 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原 2.体外用人工方法使两种细胞融合成的一个细胞称为： A.多倍体细胞 B.杂交细胞 C.多核细胞 D.巨核细胞 E.巨细胞 3.普通光学显微镜的分辨率一般为： A. 0.2nm B. 2.0nm
C. 0.2μm D. 2.0μm E. 0.2mm 4.透射电镜的最高分辨率是： A. 0.1～0.2nm B. 1.0～2.0nm C. 0.1～0.2μm D. 1.0～2.0μm E. 0.1～0.2mm 5.光镜组织切片和电镜组织切片： A.均为超薄切片 B.均用化学染料染色 C.均可制冷冻切片 D.均为固定组织 E.均可摄彩色照片 6.扫描电镜主要用于观察： A.生物膜内部结构 B.细胞器的内部结构 C.组织和细胞的表面结构
D.细胞内的多糖 E.细胞核内的结构 7.观察体外培养活细胞首选： A.一般光镜 B.倒置相差显微镜 C.相差显微镜 D.暗视野显微镜 E.偏光显微镜 8.活细胞体外长期保存方法： A.干冰内冻存 B.甘油内保存 C.冷冻干燥 D.固定保存 E.液氮内冻存 9.普通光镜观察的石蜡包埋组织切片厚度一般是： A. 50～100μm B. 10～50μm C. 5～10μm D. 1μm左右
E. 0.1～0.5μm 10.透射电镜观察的组织切片厚度一般是： A.1μm左右 B.100～500nm C.50～100nm D.5～10nm E.1～5nm [X型题] 11.组织固定的意义是： A.使蛋白质迅速凝固 B.防止细胞自溶 C.保持生活状态下的结构 D.使组织坚硬 E.防止组织腐败 12.冷冻切片的特点是： A.用树脂快速包埋 B.组织块可不固定 C.制片较迅速 D.细胞内酶活性保存较好
《生物化学》期末考试题 A 一、判断题（15个小题，每题1分，共15分）( ) 2、糖类化合物都具有还原性( ) 3、动物脂肪的熔点高在室温时为固体，是因为它含有的不饱和脂肪酸比植物油多。( ) 4、维持蛋白质二级结构的主要副键是二硫键。( ) 5、ATP含有3个高能磷酸键。( ) 6、非竞争性抑制作用时，抑制剂与酶结合则影响底物与酶的结合。( ) 7、儿童经常晒太阳可促进维生素D的吸收，预防佝偻病。( ) 8、氰化物对人体的毒害作用是由于它具有解偶联作用。( ) 9、血糖基本来源靠食物提供。( ) 10、脂肪酸氧化称β-氧化。( ) 11、肝细胞中合成尿素的部位是线粒体。( ) 12、构成RNＡ的碱基有Ａ、Ｕ、Ｇ、T。( ) 13、胆红素经肝脏与葡萄糖醛酸结合后水溶性增强。( ) 14、胆汁酸过多可反馈抑制7α-羟化酶。( ) 15、脂溶性较强的一类激素是通过与胞液或胞核中受体的结合将激素信号传递发挥其生物() 二、单选题（每小题1分，共20分） 1、下列哪个化合物是糖单位间以α-1，4糖苷键相连：( ) A、麦芽糖 B、蔗糖 C、乳糖 D、纤维素 E、香菇多糖 2、下列何物是体内贮能的主要形式( ) A、硬酯酸 B、胆固醇 C、胆酸 D、醛固酮 E、脂酰甘油 3、蛋白质的基本结构单位是下列哪个：( ) A、多肽 B、二肽 C、L-α氨基酸 D、L-β-氨基酸 E、以上都不是 4、酶与一般催化剂相比所具有的特点是( ) A、能加速化学反应速度 B、能缩短反应达到平衡所需的时间 C、具有高度的专一性 D、反应前后质和量无改 E、对正、逆反应都有催化作用 5、通过翻译过程生成的产物是：( ) Ａ、ｔRNA Ｂ、ｍRNA Ｃ、ｒRNA D、多肽链Ｅ、DNA 6、物质脱下的氢经NADH呼吸链氧化为水时，每消耗1/2分子氧可生产ATP分子数量( ) Ａ、１Ｂ、２C、3 Ｄ、４．E、5 7、糖原分子中由一个葡萄糖经糖酵解氧化分解可净生成多少分子ATP？( ) A、1 B、2 C、3 D、4 E、5 8、下列哪个过程主要在线粒体进行( ) A、脂肪酸合成 B、胆固醇合成 C、磷脂合成 D、甘油分解 E、脂肪酸β-氧化 9、酮体生成的限速酶是( )
第二章 蛋白质 1、凯氏定氮法：蛋白质含量＝总含氮量－无机含氮量）×6.25 例如：100%的蛋白质中含N 量为16%，则含N 量8%的蛋白质含量为50% 100% /xg=16% /1g x=6.25g 2、根据R 基的化学结构，可将氨基酸分为脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸、杂环氨基酸和杂环亚氨基酸。 按照R 基的极性，可分为非极性R 基氨基酸、不带电荷的极性R 基氨基酸、极性带负电荷（1）一般物理性质 无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。氨基酸是两性电解质。 氨基酸等电点的确定： 酸碱确定，根据pK 值（该基团在此pH 一半解离）计算： 等电点等于两性离子两侧pK 值的算术平均数。
（2）化学性质 ①与水合茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm （黄色）定量测定（几μg）。 ②与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法 ③与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应：形成黄色的DNP-氨基酸，用来鉴定多肽或蛋白质的N 端氨基酸，又称Sanger法。或使用5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl，又称丹磺酰氯）也可测定蛋白质N端氨基酸。 ④与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应：多肽链N端氨基酸的α-氨基也可与PITC反应，生成PTC-蛋白质，用来测定N端的氨基酸。 4、肽的结构 线性肽链，书写时规定N端放在左边，C端放在右边，用连字符将氨基酸的三字符号从N 端到C端连接起来，如Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu。命名时从N端开始，连续读出氨基酸残基的名称，除C端氨基酸外，其他氨基酸残基的名称均将“酸”改为“酰”，如丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸。若只知道氨基酸的组成而不清楚氨基酸序列时，可将氨基酸组成写在括号中，并以逗号隔开，如（Ala，Cys2，Gly），表明此肽有一个Ala、两个Cys和一个Gly 组成，但氨基酸序列不清楚。 由于C-N键有部分双键的性质，不能旋转，使相关的6个原子处于同一个平面，称作肽平面或酰胺平面。 5、、蛋白质的结构 （一）蛋白质的一级结构（化学结构） 一级结构中包含的共价键主要指肽键和二硫键。 （二）蛋白质的二级结构 （1）α-螺旋（如毛发） 结构要点：螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。（2）β-折叠结构（如蚕丝） （3）β-转角 （4）β-凸起 （5）无规卷曲 （三）蛋白质的三级结构（如肌红蛋白） （四）蛋白质的司机结构（如血红蛋白） 6、蛋白质分子中氨基酸序列的测定 氨基酸组成的分析： ?酸水解：破坏Trp,使Gln变成Glu, Asn变成Asp ?碱水解：Trp保持完整，其余氨基酸均受到破坏。 N-末端残基的鉴定：
一、组织学的主要研究方法有哪些？ 答题要点： 1．常用光镜标本制备技术 切片标本的制备。这是最常用的方法。应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时，首先应把所有要观察的材料制成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蜡切片更为常用。其制备程序大致如下：（1）取材与固定。将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块，立即浸入固定液（如甲醛溶液等）中进行固定，防止离体后结构发生变化，使其尽可能保持活体时的结构状态。 （2）脱水与包埋。为了使石蜡能浸入组织内，把固定好的材料用乙醇等脱水，经二甲苯透明后，再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬。 （3）切片与染色。将包埋的组织蜡块，用切片机切成5-10μm左右的薄片，贴在载玻片上，脱蜡后进行染色。最常用的染色法是苏木精和伊红染色，简称HE染色。 （4）封固。在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。 在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，可用火棉胶代替石蜡进行浸透包埋，再进行染色。为了较好地保存细胞内酶的活性，可选用冰冻切片，将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。 2．涂片、铺片、磨片标本的制备 血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸（稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片外，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。 3．组织化学和免疫组织化学方法 组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法，对组织、细胞内某些化学成分的定性、定位和定量进行研究，从而探讨与其相关的机能活动。 （1）组织化学。其原理是在组织切片上或被取材料上，加某种试剂，使它与组织或细胞内某些物质起化学反应，形成最终反应产物。光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着物；电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。观察其沉着物的颜色、深浅或电子密度，可对某种物质进行定性、定位和定量。 （2）免疫细胞化学。是将免疫学基本理论与细胞化学技术相结合而建立起来的新技术。主要是应用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某些肽类和蛋白质等大分子物质的分布。肽类和蛋白质种类繁多，均具抗原性。提取动物的某些肽类和蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，则产生与抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白），从血清中制备该抗体。如使抗体与荧光素结合，则形成荧光标记抗体。常用的荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC），当用该荧光素标记抗体处理组织切片时，则与组织内相应抗原发生特异结合，在荧光显微镜下呈黄绿色荧光部分，即为抗原抗体复合物，称此为荧光标记抗体法。如抗体与辣根过氧化物酶（HRP）等酶标记，与抗原结合后呈棕红色，可在光镜或电镜下观察，此即酶标抗体法。 4．组织培养 组织培养或细胞培养是在体外研究活组织或活细胞的形态结构和生理功能动态变化的一种很有价值的研究手段，已广泛应用于生物医学的各个领域。组织培养是在无菌条件下进行，从机体取得的活组织或活细胞，或者长期传代培养的细胞株，放入盛有营养液的培养基（天然的或人工合成的）的培养瓶（板）内保持一定温度、适宜的O2与CO2浓度、pH值等条件进行培养。可在倒置显微镜下直接观察细胞的增殖、分化、运动、吞噬等动态变化，并可用显微录像或显微电影真实地记录下活细胞的连续变化过程。 5．放射自显影 放射自显影是研究追踪某些物质在体内或细胞内的代谢径路与结构的关系。
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
安溪卫校药学专业生物化学期末考试卷选择题 班级 _____________姓名 _____________座号 _________ 一、单项选择题（每小题 1 分，共30 分） 1、蛋白质中氮的含量约占 A 、 6.25% B 、10.5%C、 16% D 、19%E、 25% 2、变性蛋白质分子结构未改变的是 A 、一级结构B、二级结构C、三级结构 D 、四级结构E、空间结构 3、中年男性病人，酗酒呕吐，急腹症，检查左上腹压痛，疑为急性胰腺炎，应测血中的酶是 A 、碱性磷酸酶 B 、乳酸脱氢酶C、谷丙转氨酶D、胆碱酯酶E、淀粉酶 4、酶与一般催化剂相比所具有的特点是 A 、能加速化学反应速度 C、具有高度的专一性 E、对正、逆反应都有催化作用B、能缩短反应达到平衡所需的时间D、反应前后质和量无改 5、酶原之所以没有活性是因为 A 、酶蛋白肽链合成不完全C、酶原是普通的蛋白质E、是已 经变性的蛋白质B、活性中心未形成或未暴露D、缺乏辅酶或辅基 6、影响酶促反应速度的因素 A 、酶浓度B、底物浓度C、温度D、溶液pH E、以上都是 7、肝糖原能直接分解葡萄糖，是因为肝中含有 A 、磷酸化酶 B 、葡萄糖 -6-磷酸酶C、糖原合成酶D、葡萄糖激酶E、己糖激酶 8、下列不是生命活动所需的能量形式是 A 、机械能B、热能C、 ATP D、电能E、化学能 9、防止动脉硬化的脂蛋白是 A、CM B 、VLDL C、 LDL D、 HDL E、 IDL 10、以下不是血脂的是 A 、必需脂肪酸 B 、磷脂C、脂肪D、游离脂肪酸E、胆固醇 11、一分子软脂酸在体内彻底氧化净生成多少分子ATP A、38 B、 131 C、 129 D、146 E、 36 12、没有真正脱掉氨基的脱氨基方式是 A 、氧化脱氨基B、转氨基C、联合脱氨基D、嘌呤核苷酸循环E、以上都是 13、构成 DNA 分子的戊糖是 A 、葡萄糖B、果糖C、乳糖 D 、脱氧核糖E、核糖 14、糖的有氧氧化的主要生理意义是： A 、机体在缺氧情况下获得能量以供急需的有效方式 B 、是糖在体内的贮存形式 C、糖氧化供能的主要途径 D 、为合成磷酸提供磷酸核糖 E、与药物、毒物和某些激素的生物转化有关 15、体内氨的主要运输、贮存形式是 A 、尿素B、谷氨酰胺C、谷氨酸 D 、胺E、嘌呤、嘧啶 16、DNA作为遗传物质基础，下列叙述正确的是 A 、 DNA 分子含有体现遗传特征的密码 B 、子代 DNA 不经遗传密码即可复制而成
1．糖异生和糖酵解的生理学意义: 糖酵解和糖异生的代谢协调控制，在满足机体对能量的需求和维持血糖恒定方面具有重要的生理意义。 2.简述蛋白质二级结构定义及主要类别。 定义：指多肽主链有一定周期性的，由氢键维持的局部空间结构。 主要类别：α-螺旋，β-折叠，β-转角，β-凸起，无规卷曲 3.简述腺苷酸的合成途径. IMP在腺苷琥珀酸合成酶与腺苷琥珀酸裂解酶的连续作用下，消耗1分子GTP，以天冬氨酸的氨基取代C-6的氧而生成AMP。 4．何为必需脂肪酸和非必需脂肪酸？哺乳动物体内所需的必需脂肪酸有哪些？ 必需脂肪酸：自身不能合成必须由膳食提供的脂肪酸常见脂肪酸有亚油酸、亚麻酸非必须脂肪酸：自身能够合成机单不饱和脂肪酸 5.简述酶作为生物催化剂与一般化学催化剂的共性及其个性？ 共性:能显著的提高化学反应速率，是化学反应很快达到平衡 个性：酶对反应的平衡常数没有影响，而且酶具有高效性和专一性 6．简述TCA循环的在代谢途径中的重要意义。 1、TCA循环不仅是给生物体的能量，而且它还是糖类、脂质、蛋白质三大物质转化的枢纽 2、三羧酸循环所产生的各种重要的中间产物，对其他化合物的生物合成具有重要意义。 3、三羧酸循环课供应多种化合物的碳骨架，以供细胞合成之用。 7．何为必需氨基酸和非必需氨基酸？哺乳动物体内所需的必需氨基酸有哪些？ 必需氨基酸：自身不能合成，必须由膳食提供的氨基酸。（苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸） 8．简述蛋白质一级、二级、三级和四级结构。 一级：指多肽链中的氨基酸序列，氨基酸序列的多样性决定了蛋白质空间结构和功能的多样性。 二级：指多肽主链有一定周期性的，由氢键维持的局部空间结构。 三级：球状蛋白的多肽链在二级结构、超二级结构和结构域等结构层次的基础上，组装而成的完整的结构单元。 四级：指分子中亚基的种类、数量以及相互关系。 9.脂肪酸氧化和合成途径的主要差别？ β-氧化：细胞内定位（发生在线粒体）、脂酰基载体（辅酶A）、电子受体/供体（FAD、NAD+）、羟脂酰辅酶A构型（L型）、生成和提供C2单位的形式（乙酰辅酶A）、酰基转运的形式（脂酰肉碱） 脂肪酸的合成：细胞内定位（发生在细胞溶胶中）、脂酰基载体（酰基载体蛋白（ACP））、电子受体/供体（NADPH）、羟脂酰辅酶A构型（D型）、生成和提供C2单位的形式（丙二酸单酰辅酶A）、酰基转运的形式（柠檬酸） 10.酮体是如何产生和氧化的？为什么肝中产生酮体要在肝外组织才能被利用？ 生成：脂肪酸β-氧化所生成的乙酰辅酶A在肝中氧化不完全，二分子乙酰辅酶A可以缩合成乙酰乙酰辅酶A：乙酰辅酶A再与一分子乙酰辅酶A缩合成β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA），后者分裂成乙酰乙酸；乙酰乙酸在肝线粒体中可还原生成β-羟丁酸，乙酰乙酸还可以脱羧生成丙酮。 氧化：乙酰乙酸和β-羟丁酸进入血液循环后送至肝外组织，β-羟丁酸首先氧化成乙酰乙酸，然后乙酰乙酸在β-酮脂酰辅酶A转移酶或乙酰乙酸硫激酶的作用下，生成乙酰乙酸内缺乏β-酮脂酰辅酶A转移酶和乙酰乙酸硫激酶，所以肝中产生酮体要在肝外组织才能被
原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st randed, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是DNA探
《生物化学》期末考试题 A 1、蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面形成水化膜,并在偏离等电点时带有相同电荷 2、糖类化合物都具有还原性 ( ) 3、动物脂肪的熔点高在室温时为固体，是因为它含有的不饱和脂肪酸比植物油多。( ) 4、维持蛋白质二级结构的主要副键是二硫键。 ( ) 5、ATP含有3个高能磷酸键。 ( ) 6、非竞争性抑制作用时，抑制剂与酶结合则影响底物与酶的结合。 ( ) 7、儿童经常晒太阳可促进维生素D的吸收，预防佝偻病。 ( ) 8、氰化物对人体的毒害作用是由于它具有解偶联作用。 ( ) 9、血糖基本来源靠食物提供。 ( ) 10、脂肪酸氧化称β-氧化。 ( ) 11、肝细胞中合成尿素的部位是线粒体。 ( ) 12、构成RNＡ的碱基有Ａ、Ｕ、Ｇ、T。 ( ) 13、胆红素经肝脏与葡萄糖醛酸结合后水溶性增强。 ( ) 14、胆汁酸过多可反馈抑制7α-羟化酶。 ( ) 15、脂溶性较强的一类激素是通过与胞液或胞核中受体的结合将激素信号传递发挥其生物() 1、下列哪个化合物是糖单位间以α-1，4糖苷键相连： ( ) A、麦芽 B、蔗糖 C、乳糖 D、纤维素 E、香菇多糖 2、下列何物是体内贮能的主要形式 ( ) A、硬酯酸 B、胆固醇 C、胆酸 D、醛固酮 E、脂酰甘油
3、蛋白质的基本结构单位是下列哪个： ( ) A、多肽 B、二肽 C、L-α氨基酸 D、L-β-氨基酸 E、以上都不是 4、酶与一般催化剂相比所具有的特点是 ( ) A、能加速化学反应速度 B、能缩短反应达到平衡所需的时间 C、具有高度的专一性 D、反应前后质和量无改 E、对正、逆反应都有催化作用 5、通过翻译过程生成的产物是： ( ) Ａ、ｔRNA Ｂ、ｍRNA Ｃ、ｒRNA D、多肽链Ｅ、DNA 6、物质脱下的氢经NADH呼吸链氧化为水时，每消耗1/2分子氧可生产ATP分子数量( ) Ａ、１Ｂ、２ C、3 Ｄ、４． E、5 7、糖原分子中由一个葡萄糖经糖酵解氧化分解可净生成多少分子ATP？ ( ) A、1 B、2 C、3 D、4 E、5 8、下列哪个过程主要在线粒体进行 ( ) A、脂肪酸合成 B、胆固醇合成 C、磷脂合成 D、甘油分解 E、脂肪酸β-氧化 9、酮体生成的限速酶是 ( ) A、HMG-CoA还原酶 B、HMG-CoA裂解酶 C、HMG-CoA合成酶 D、磷解酶 E、β-羟丁酸脱氢酶 10、有关G-蛋白的概念错误的是 ( ) A、能结合GDP和GTP B、由α、β、γ三亚基组成 C、亚基聚合时具有活性 D、可被激素受体复合物激活 E、有潜在的GTP活性 11、鸟氨酸循环中，合成尿素的第二个氮原子来自 ( ) A、氨基甲酰磷酸 B、NH3 C、天冬氨酸 D、天冬酰胺 E、谷氨酰胺 12、下列哪步反应障碍可致苯丙酮酸尿症 ( )
一、蛋白质 1.蛋白质的概念：由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物，由C、H、O、N、S元素组成，N的含量为16%。 2.氨基酸共有20种，分类：非极性疏水R基氨基酸、极性不带电荷R基氨基酸、带正电 荷R基氨基酸（碱性氨基酸）、带负电荷R基氨基酸（酸性氨基酸）、芳香族氨基酸。 3.氨基酸的紫外线吸收特征：色氨酸和酪氨酸在280纳米波长附近存在吸收峰。 4.氨基酸的等电点：在某一PH值条件下，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相同，溶液中氨基酸的净电荷为零，此时溶液的PH值称为该氨基酸的等电点；蛋白质等电点： 在某一PH值下，蛋白质的净电荷为零，则该PH值称为蛋白质的等电点。 5.氨基酸残基：氨基酸缩合成肽之后氨基酸本身不完整，称为氨基酸残基。 6.半胱氨酸连接用二硫键（—S—S—） 7.肽键：一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸α-氨基脱水缩合形成的化学键。 8.N末端和C末端：主链的一端含有游离的α氨基称为氨基端或N端；另一端含有游离的 α羧基，称为羧基端或C端。 9.蛋白质的分子结构：（1）一级结构：蛋白质分子内氨基酸的排列顺序，化学键为肽键和二硫键；（2）二级结构：多肽链主链的局部构象，不涉及侧链的空间排布，化学键为氢键， 其主要形式为α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲；（3）三级结构：整条肽链中，全部氨基 酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置，化学键为疏水键、离子键、氢键及范德华力；（4）四级结构：蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和 相互作用。 10.α螺旋：(1)肽平面围绕Cα旋转盘绕形成右手螺旋结构，称为α螺旋；(2).螺旋上升一圈，大约需要3.6个氨基酸，螺距为0.54纳米，螺旋的直径为0.5纳米；(3).氨基酸的R基分布在 螺旋的外侧；(4).在α螺旋中，每一个肽键的羰基氧与从该羰基所属氨基酸开始向后数第五个氨基酸的氨基氢形成氢键，从而使α螺旋非常稳定。 11.模体：在许多蛋白质分子中可发现两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体。 12.结构域：大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域。 13.变构效应：蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。 14.蛋白质胶体结构的稳定因素：颗粒表面电荷与水化膜。 15.什么是蛋白质的变性、复性、沉淀？变性与沉淀关系如何?导致蛋白质的变性因素？举 例说明实际工作中应用和避免蛋白质变性的例子？ 蛋白质的变性：在理化因素的作用下，蛋白质的空间构象受到破坏，其理化性质发生改变，生物活性丧失，其实质是蛋白质的次级断裂，一级结构并不破坏。 蛋白质的复性：当变性程度较轻时，如果除去变性因素，蛋白质仍能恢复或部分恢复其原 来的构象及功能，这一现象称为蛋白质的复性。
1.组织化学的基本原理及其与生物化学的基本区别 组织化学是在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态时的细微结构的条件下，采用显微镜技术观察某些化学成分和酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律，以便阐明它们在组织或细胞中的存在和含量及其变化的机能意义。 基本原理:在组织切片或细胞涂片上加入一定的化学试剂，该试剂与组织或细胞内的拟检成分起化学反应，形成有颜色的的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，可在显微镜下观察得到，用以研究糖类、脂类、蛋白质、酶类和核酸等物质在组织或细胞内的分布和含量。 组织化学与生物化学的区别在于：虽然两者都着眼于组织和细胞内的化学组成及其含量和酶的存在及其活性，但生物化学技术中通常是将组织和细胞打碎，制成匀浆，然后进行化学测定，故其定位性能差，而组织化学技术中是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分，故其定位性能好；生物学技术中的化学反应是在试管内进行的，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或细胞涂片中进行的。 2.试述组织化学技术的基本要求 在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及其定位和定量以及代谢状态时，必须满足一下基本要求： 1.保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确，如果形态结构破坏而失真，则定位困难。 2.具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。 3.具备一定的灵敏性，以便含量很少的物质也能被显示出来。 4.生成的产物必须是有色沉淀，颗粒细微不被溶解，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相反应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。 5.反应产物具有稳定性，以便于重复观察。 6.要有重复性。 (一) 保持组织和细胞形态结构的良好状态 (二) 具备一定的特异性 (三) 具备一定的灵敏性 (四) 生成的反应产物必须是有色沉淀 (五) 反应产物具有稳定性 (六) 要有重复性。 3.试述酸性磷酸酶，乙酰胆碱酯酶和NO合酶的反应原理？以任意三种酶为例说明酶显示的基本原理？NO 合酶的分类及其组化原理? 酸性磷酸酶反应原理：铅法和重氮偶联法 1.铅法：在PH为5.0的条件下，酸性磷酸酶（ACP）水解其底物：β-甘油酸钠，产生PO43-,后者被捕获剂Pb(NO3)2的Pb2+直接捕获形成无色的Pb3 (PO4)2沉淀，后者又与(NH4)2S发生置换反应，最终形成棕黑色沉淀。 2.重氮偶联法：α-苯酚磷酸钠或萘酚AS-BI磷酸被酶水解放出萘酚，后者立即被重氮盐捕获偶联而生成有色偶氮色素沉淀（红色）。 乙酰胆碱酯酶反应原理： 亚铁氰化铜法：乙酰胆碱酯酶（AChE）能将乙酰胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜而呈现有色沉淀(棕色)。 NO合酶反应原理： NADPH-d法：一氧化氮合酶可催化前体物质L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，由于NOS和NADPH-d可能为同一种酶，并且都可以还原辅酶Ⅱ（NADPH）为辅助因子，介导NOS催化L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，并释放电子，后者又被NADPH传递给硝基四唑兰（N-BT）, N-BT可被还原为有色沉淀（蓝色）。
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
《生物化学》期末考试题 A 一、判断题（15个小题，每题1分，共15分） ( ) 1、蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面形成水化膜,并在偏离等电点时带有相同电荷 2、糖类化合物都具有还原性 ( ) 3、动物脂肪的熔点高在室温时为固体，是因为它含有的不饱和脂肪酸比植物油多。( ) 4、维持蛋白质二级结构的主要副键是二硫键。 ( ) 5、ATP含有3个高能磷酸键。 ( ) 6、非竞争性抑制作用时，抑制剂与酶结合则影响底物与酶的结合。( ) 7、儿童经常晒太阳可促进维生素D的吸收，预防佝偻病。 ( ) 8、氰化物对人体的毒害作用是由于它具有解偶联作用。 ( )
9、血糖基本来源靠食物提供。 ( ) 10、脂肪酸氧化称β-氧化。 ( ) 11、肝细胞中合成尿素的部位是线粒体。 ( ) 12、构成RNＡ的碱基有Ａ、Ｕ、Ｇ、T。 ( ) 13、胆红素经肝脏与葡萄糖醛酸结合后水溶性增强。 ( ) 14、胆汁酸过多可反馈抑制7α-羟化酶。 ( ) 15、脂溶性较强的一类激素是通过与胞液或胞核中受体的结合将 二、单选题（每小题1分，共20分）
1、下列哪个化合物是糖单位间以α-1，4糖苷键相连：() A、麦芽糖 B、蔗糖 C、乳糖 D、纤维素 E、 香菇多糖 2、下列何物是体内贮能的主要形式 ( ) A、硬酯酸 B、胆固醇 C、胆酸 D、醛固酮 E、 脂酰甘油 3、蛋白质的基本结构单位是下列哪个： ( ) A、多肽 B、二肽 C、L-α氨基酸 D、L-β-氨基酸 E、以上都不是 4、酶与一般催化剂相比所具有的特点是 ( ) A、能加速化学反应速度 B、能缩短反应达到平衡所需的时间 C、具有高度的专一性 D、反应前后质和量无改 E、对正、逆反应都有催化作用 5、通过翻译过程生成的产物是： ( ) Ａ、ｔRNA Ｂ、ｍRNA Ｃ、ｒRNA D、多肽链Ｅ、DNA
第二章 1、蛋白质构成：碳、氢、氧、氮，氮含量16% 2、蛋白质基本组成单位：氨基酸 3、氨基酸分类：中性非极性~（甘氨酸Gly，G）、中性极性~、酸性~（天门冬氨酸Asp，D、谷氨 酸Glu，E）、碱性~（赖氨酸Lys，K、精氨酸Arg，R、组氨酸His，H） 4、色氨酸、酪氨酸（280nm波长）、苯丙氨酸（260nm波长）三种芳香族氨基酸吸收紫外光 5、大多数蛋白质中均含有色氨酸和酪氨酸，故测定280nm波长的光吸收强度，课作为溶液中蛋白 质含量的快速测定方法 6、茚三酮反应:蓝紫色化合物，反应直接生成黄色产物 7、肽键：通过一个氨基酸分子的—NH2与另一分子氨基酸的—COOH脱去一分子水形成—CO— NH— 8、二级结构基本类型：α—螺旋、β—折叠、β—转角、无规则卷曲 9、三级结构：每一条多肽链内所有原子的空间排布 10、一个具有功能的蛋白质必须具有三级结构 11、稳定三级结构的重要因素：氢键、盐键、疏水键、范德华力等非共价键以及二硫键 12、四级结构：亚基以非共价键聚合成一定空间结构的聚合体 13、亚基：有些蛋白质是由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成，每条多肽链称~ 14、单独的亚基一般没有生物学功能，只有构成完整的四级结构才具有生物学功能 15、等电点：调节溶液pH值，使某一蛋白质分子所带的正负电荷相等，此时溶液的pH值即为~ 16、变性作用：某些理化因素可以破坏蛋白质分子中的副键，使其构像发生变化，引起蛋白质的理 化性质和生物学功能的改变（可逆性变性、不可逆性变性） 17、变性蛋白质是生物学活性丧失，在水中溶解度降低，粘度增加，更易被蛋白酶消化水解 18、变性物理因素：加热、高压、紫外线、X线和超声波 化学因素：强酸、强碱、重金属离子、胍和尿素 19、沉淀：用物理或化学方法破坏蛋白质溶液的两个稳定因素，即可将蛋白质从溶液中析出 20、沉淀：盐析：破坏蛋白质分子的水化膜，中和其所带电荷，仍保持其原有生物活性，不会是蛋 白质变性 有机溶剂沉淀：不会变性 重金属盐类沉淀：破坏蛋白质分子的盐键，与巯基结合，发生变性 生物碱试剂沉淀： 21、双缩脲反应：在碱性溶液中，含两个以上肽键的化合物都能与稀硫酸铜溶液反应呈紫色（氨基 酸、二肽不可以） 第三章 22、核苷：一分子碱基与一分子戊糖脱水以N—C糖苷键连成的化合物 23、核苷酸=核苷+磷酸 24、RNA分子含有四种单核苷酸：AMP、GMP、CMP、UMP 25、核苷酸作用：合成核酸、参与物质代谢、能量代谢和多种生命活动的调控 26、核苷酸存在于辅酶A、黄素腺嘌呤二核苷酸（F AD）、辅酶I(NAD+)和辅酶II(NADP+) 27、A TP是能量代谢的关键 28、UTP、CTP、GTP分别参与糖元、磷脂、蛋白质的合成 29、环一磷酸腺苷（Camp）和环一磷酸鸟苷（cGMP）在信号转导过程中发挥重要作用 30、DNA具有方向性，碱基序列按照规定从5’向3’书写（3’，5’-磷酸二酯键） 31、三维双螺旋结构内容：⑴DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘旋而成 ⑵亲水的脱氧核糖基与磷酸基位于外侧，疏水的碱基位于内侧 ⑶两条多核苷酸链以碱基之间形成的氢键相互连结 ⑷互补碱基之间横向的氢键和疏水碱基平面之间形成的纵向碱基堆积 力，维系这双螺旋结构的稳定 32、B-DNA、A-DNA右手螺旋结构，Z-NDA左手螺旋结构
生物化学试题及答案 维生素 一、名词解释 1、维生素 二、填空题 1、维生素的重要性在于它可作为酶的组成成分，参与体内代谢过程。 2、维生素按溶解性可分为和。 3、水溶性维生素主要包括和VC。 4、脂脂性维生素包括为、、和。 三、简答题 1、简述B族维生素与辅助因子的关系。 【参考答案】 一、名词解释 1、维生素：维持生物正常生命过程所必需，但机体不能合成，或合成量很少，必须食物供给一类小分子 有机物。 二、填空题 1、辅因子； 2、水溶性维生素、脂性维生素； 3、B族维生素； 4、VA、VD、VE、VK； 三、简答题 1、
生物氧化 一、名词解释 1.生物氧化 2.呼吸链 3.氧化磷酸化 4. P/O比值 二、填空题 1．生物氧化是____ 在细胞中____，同时产生____ 的过程。 3．高能磷酸化合物通常是指水解时____的化合物，其中重要的是____，被称为能量代谢的____。 4．真核细胞生物氧化的主要场所是____ ，呼吸链和氧化磷酸化偶联因子都定位于____。 5．以NADH为辅酶的脱氢酶类主要是参与____ 作用，即参与从____到____的电子传递作用；以NADPH 为辅酶的脱氢酶类主要是将分解代谢中间产物上的____转移到____反应中需电子的中间物上。 6．由NADH→O2的电子传递中，释放的能量足以偶联ATP合成的3个部位是____、____ 和____ 。 9．琥珀酸呼吸链的组成成分有____、____、____、____、____。
10．在NADH 氧化呼吸链中，氧化磷酸化偶联部位分别是____、____、____，此三处释放的能量均超过____KJ。 12．ATP生成的主要方式有____和____。 14．胞液中α-磷酸甘油脱氢酶的辅酶是____，线粒体中α-磷酸甘油脱氢酶的辅基是____。 16．呼吸链中未参与形成复合体的两种游离成分是____和____。 26．NADH经电子传递和氧化磷酸化可产生____个ATP，琥珀酸可产生____个ATP。 三、问答题 1．试比较生物氧化与体外物质氧化的异同。 2．描述NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链的组成、排列顺序及氧化磷酸化的偶联部位。 7．简述化学渗透学说。 【参考答案】 一、名词解释 1．物质在生物体内进行的氧化反应称生物氧化。 2．代谢物脱下的氢通过多种酶与辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合为水，此过程与细胞呼吸有关故称呼吸链。 3．代谢物脱下的氢经呼吸链传递给氧生成水，同时伴有ADP磷酸化为ATP，此过程称氧化磷酸化。 4．物质氧化时每消耗1摩尔氧原子所消耗的无机磷的摩尔数，即生成ATP的摩尔数，此称P/O比值。 二、填空题 1.有机分子氧化分解可利用的能量 3.释放的自由能大于20.92kJ/mol ATP 通货 4.线粒体线粒体内膜 5.生物氧化底物氧H+＋e- 生物合成 6.NADH-CoQ Cytb-Cytc Cyta-a3-O2 9．复合体Ⅱ泛醌复合体Ⅲ细胞色素c 复合体Ⅳ 10．NADH→泛醌泛醌→细胞色素c 细胞色素aa3→O2 30.5 12．氧化磷酸化底物水平磷酸化 14．NAD+ FAD