1. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA原理是什么原理是什么原理是什么原理是什么？？？？乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。
最常用的阳离子：1）醋酸铵：贮存液10.0mol/L 终浓度 2.0~2.5mol/L 常用于减少多余的杂质（如DNTP及多糖）与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在的情况下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99％的dNTP。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可以减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能够抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。2）氯化锂：贮存液8.0mol/L 终浓度0.8mol/L 常用于需高浓度乙醇进行的沉淀（如沉淀RNA）。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA（如tRNA及5S RNA）在高离子强度下（没有乙醇时）是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl（0.8mol/L)中纯化大分子RNA。3）氯化钠：贮存液 5.0mol/L 终浓度0.2 mol/L （0.2 mol/L）用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70％乙醇中仍为可溶。4）醋酸钠：贮存液 3.0mol/L（ph5.2）终浓度0.3 mol/L （0.3mol/L，ph5.2）在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。
2. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀DNA的区别是什么的区别是什么的区别是什么的区别是什么？？？？
异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，如二楼所讲，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
异丙醇沉淀核酸：优点：为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。
乙醇沉淀核酸：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. 缺点是总体积较大。需在-20度放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤
“蛋白质的变性”是指蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。而引起蛋白质沉淀的原因一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
多糖分级沉淀
主要原理是通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖，几乎适用于所有水溶性多糖，虽然不同多糖可在不同浓度乙醇的条件下分步沉淀，但特异性不高，导致对所需多糖的分离选择性较差，要提高多糖的纯度需经反复
的极性而改变混合组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出。如在含有糖类或蛋白质的水溶液中，分次加入乙醇,使含醇量逐步增高，逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽在含皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或丙酮可使极性有差异的皂苷逐段沉淀出来等。沉淀物的结构不仅与乙醇浓度等有关，还与加乙醇的顺序有关。如先加乙醇后加料分子较大，先加料后加乙醇则分子较
极性也就增大根据相似相溶就是极性的有机物易容于极性的溶剂，极性小的易溶于极性小或非极性溶剂多糖极性较大在水中的溶解性很好不过在醇的溶解性很低所以将醇加到含有多糖的水溶液中可以改变的水溶液的极性极性大的多糖最先溶出来极性下的最后溶出来做到了分级纯化其实这也是浓缩
糖进行提取
实验七动物组织中核酸的提取和鉴定 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95％乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10％NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。 先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。 核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱（嘌岭、嘧啶）和戊糖（核糖、脱氧核糖）。 此三类化合物可用下列方法鉴定之。 1、磷酸：能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。 H3PO4＋12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O H3PO4·12MoO3H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 2、嘌呤碱：能与苦 味酸作用形成针状结晶 3、戊糖： (1)核糖：经与强酸 (盐酸与硫酸)共热生成 糠醛，后者可与3;5二羟 甲基苯缩合成绿色化合 物。 (2)脱氧核糖：在强 酸中加热，可生成ω—羟 基γ—酮基戊醛，后者再 与二苯胺作用生成一蓝 色化合物。 上述二反应如下 【操作】
(一)核酸提取 l、用酚提取法： （1）取小白鼠一只，断头处死，剖腹取肝，置于研钵中，加入玻璃少许，研磨至糊状后，加入蒸馏水3ml，继续研磨约三分钟。 （2）于该研钵中再加酚液5ml，研磨约十分钟后，倒入—-圆底离心管中，离心5分钟（约2000转/分钟）。 （3）用毛细管将上液吸出，置于一圆底离心管中，加乙醚2ml，用拇指将管口按住，用力振摇1—2分钟(提出酚)，离心5分钟后，用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。 （4）于该管中加入95％乙醇2ml，用玻棒搅拌约2分钟，离心3分钟，取出．去上清液，沉淀部分即为核酸。 2、用三氯醋酸提取法 （1）杀兔；取肝，称重，按每克肝脏4ml比例加入1％三氯醋酸，制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中，3000转／分离心5分钟。 （2）将离心后的上清液倾去，于沉淀中加95％乙醇5ml充分混匀，在水浴中加热至沸2分钟，注意酒精沸腾后将火关小，避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。 （3）倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10％NaCI溶液4ml，置沸水浴中8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出；冷却后再离心， （4）将上清液倾入另一离心管中，再离心一次，除去可能存在的微量残渣，将上清液倒入一试管。 取等量95％的乙醇，逐滴加入到上清液中，即可见白色沉淀逐渐出现，静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中，离心5分钟，将上液倾去，所得白色沉淀即为核酸钠。 (二)核酸的水解： 在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后，加入10％H2SO42mL摇匀，于沸水浴中加热10分钟，即得核酸水解液，用流水冷却后进行下列定性试验。 (三)鉴定： l、嘌呤碱的鉴定： 取中试管一支，加入饱和苦味酸约2ml，再加入核酸水解液4—6滴，摇匀。静置于室温中，观察有无黄色针状结晶出现，。 2、脱氧核糖的鉴定：
核酸提取新技术 核酸提取被用于许多分子生物化学试验和诊断，是克隆、转化、酶切、体外转录、扩增、测序等试验的第一个步骤。然而由于细胞内存在大量蛋白质、碳水化合物、原始样品中的代谢物以及其它污染物，提取高质量的核酸并非易事。现阶段的层析柱核酸提取方法有： 1、一种新的层析柱技术-双层柱技术 时间：2012年 人物： 美国科学家丁少峰教授和刘强教授 事件： 发明了一种新的层析柱技术-双层柱技术，以及基于该新双层柱的核酸提取方法，用来克服常用的基于硅胶提取和基于阴离子交换提取核酸两者的缺点，使核酸提取方法更加简单、快速、高效、可靠，特别是在血浆和尿液的液体活检中具有非常重要的应用价值13-14。 结构： 双层柱由2种膜组成：第一层为阴离子交换膜二乙胺（DEAE），第二层为二氧化硅膜 (Fig.1)。 原理： （1）样品中的核酸结合到第一层阴离子交换膜上，起核酸浓缩器的作用， （2）已结合的核酸从第一层膜洗脱, 然后结合到第二层二氧化硅膜, 这是因为采用了双功能洗脱/结合液, 也称为耦联液， （3）最终使用低盐缓冲液将游离核酸从第二层膜洗脱，获得目的产物 (Fig.2)。 优点: （1）特别适用于分离和纯化含有极度稀释的大容量的核酸样品，例如10mL血浆或50mL尿液； （2）游离的小片段DNA（80～250bp）回收率高,可比常规硅胶提取法高出4倍, 适用于血浆及尿液游离核酸的提取； （3）不需要蛋白酶处理； （4）提供更高纯度和更少抑制剂的核酸样品； （5）洗脱的核酸可直接用于下游应用, 包括焦磷酸化激活的聚合反应（Pyrophosphorolysis Activated Polymerization，PAP）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、及二代测序等； （6）此外，本方法快速、简便，无需接触苯酚及氯仿等毒性强烈的有机溶剂，无需复杂繁琐的实验操作，操作全程可在短时间内完成。 以下为常用的两种方法。
一、核酸 核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。 三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 四、细胞裂解： （一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐(如Tris、EDTA、NaCl 等)。 盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境(如Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是基因组DNA 抽提的主流。 （二）细胞的裂解方法
c16全自动核酸提取仪操作说明 仪器构造简介： 1 触控屏HID-Pro 320 2 仪器前门 3 样品盘适配器 4 LED指示灯 5 触摸感应器 1 带滤芯的枪头 2 收集管 3 枪头、洗脱管放置架 4 压板 5 样品槽（可直接放置试 剂板或加装适配器后放置 试剂条） 6 传送轨道 7 试剂条适配器
样品架穿孔工具 1 InnuPure接口 2 网络接口 3 USB接口 简易操作说明： 1.插上仪器电源线，打开仪器背部的电源开关，仪器前面LED指示灯显示红色，此时仪器 为待机状态。用手指轻触触摸感应器圆形键一秒钟（注意，不要使劲按），手指拿开后LED指示灯由红色变为绿色，此时仪器为工作状态。 开机后界面如下图所示：
Menu：菜单 Select protocol：选择程序 Tools：工具 Settings：一般设置 2.样品准备和纯化 1)样品盘放入样品架，打开夹板。 2)将试剂板放入样品槽。试剂板上的红线要 与样品槽上的红点对齐。 3)将条管适配器放入样品槽。同样适配器上 的红点要与样品槽上的红点对齐。
4)将试剂条放入样品槽。注意：有“AJ”字样的一头朝向样品盘上刻字的一边。 5)试剂条管放完后，放下压板。 6)放入枪头和收集管。注意：没放试剂条的位 置不要放。 7)将试剂条管第一和第三孔刺穿，可以使用穿 孔工具也可以使用干净的枪头。（“AJ”字样边为第一 孔） 8)将裂解后的样品加入第一孔。（具体操作详见 试剂盒说明） 9)准备好的样品盘放入仪器内，轻推，样品盘 会自动进入。
10) 根据起始样本选择合适的程序，点击开始即可。 11) 纯化完成后样品盘会自动退出，盖子盖好纯化产物放冰箱保存待用。 3. 软件功能介绍 ① 菜单： 设置新用户、设置开机密码等 ② 日期时间： 设置日期 时间 ③ 选择程序： 开始、导入、删除程序 ④ 工具： 自动校正、仪器初始化、磁力测试等仪器自检功能 ⑤ 一般设置： 用户管理、语言、更新等 ⑥ 版本信息
1. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA原理是什么原理是什么原理是什么原理是什么？？？？乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平衡离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。 最常用的阳离子：1）醋酸铵：贮存液10.0mol/L 终浓度 2.0~2.5mol/L 常用于减少多余的杂质（如DNTP及多糖）与核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸铵存在的情况下连续两次DNA沉淀可从DNA制品中除去>99％的dNTP。在通过琼脂糖酶消化琼脂糖之后沉淀核酸时，使用醋酸铵也是最佳选择，这种阳离子可以减少寡糖消化产物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸进行磷酸化时，就不要用醋酸铵沉淀核酸，因为铵离子能够抑制T4噬菌体多核苷酸激酶。2）氯化锂：贮存液8.0mol/L 终浓度0.8mol/L 常用于需高浓度乙醇进行的沉淀（如沉淀RNA）。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不随核酸共沉淀。小分子RNA（如tRNA及5S RNA）在高离子强度下（没有乙醇时）是可溶的，而大分子RNA则不溶。可以利用这个差异在高浓度LiCl（0.8mol/L)中纯化大分子RNA。3）氯化钠：贮存液 5.0mol/L 终浓度0.2 mol/L （0.2 mol/L）用于DNA样品中存在SDS时。这种去污剂在70％乙醇中仍为可溶。4）醋酸钠：贮存液 3.0mol/L（ph5.2）终浓度0.3 mol/L （0.3mol/L，ph5.2）在DNA和RNA的常规沉淀中最为常用。 2. 乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀DNA和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀和异丙醇沉淀DNA的区别是什么的区别是什么的区别是什么的区别是什么？？？？ 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，如二楼所讲，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。 异丙醇沉淀核酸：优点：为所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。 乙醇沉淀核酸：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. 缺点是总体积较大。需在-20度放置很长时间，30分钟-1小时。同样需要70%乙醇洗涤 “蛋白质的变性”是指蛋白质分子中的次级键被破坏。主要是氢键和离子键。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。而引起蛋白质沉淀的原因一方面是由于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力，另一方面是因为这些有机溶剂是强亲水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。
核酸提取仪如何选择及常见误区 伴随着大健康基因检测时代的来临以及分子生物学技术的大发展，核酸是分子实验最基本的模板，如何选择一款合适的核酸提取仪就成为了分子实验室最关心的事情，很多人容易陷入选择误区，下面举例说明最常见的二种选择误区： 误区一、核酸提取仪和工作站的区别及选择误区 很多工作站的厂家在推销工作站的时候经常和客户说，工作站提核酸是全自动的，而核酸提取仪是半自动的，客户也主观认为工作站可以移液，提取，什么都能干，好像只要把样本放进去，什么都不用管就可以得到想要的核酸了，等到工作站到位的时候发现，实际情况并不是那样，不仅没想象中的那么好，甚至连基本的提取核酸都困难，那么原因是什么呢？ 第一个问题，开盖问题，采血管、唾液保存管、二维码冻存管等的盖子结构都不一样，大小也不一样，厂家也不一样，工作站如何自动化开盖？这个问题就解决不了。 第二个问题，条码录入问题，条形码和二维码，还有一些手动贴的标签和手写的标签，所以扫码还是手动为主，很难自动化。 第三个问题，加液自动化，工作站可以实现自动加试剂，好像是个优势，但是加一个96深孔板需要花15~30分钟左右的时间，而提取一般需要六种试剂，也就是六个板子，大约1.5小时时间，提取试剂很多含有高浓度的乙醇，这么长时间，乙醇浓度会发生改变，影响提取效率和灵敏度，再说了，很多提取仪的厂家（比如百泰克，百源基因等）都有配套预装试剂盒，不需要加液，自动加试剂这个功能就是个鸡肋。提取仪加自动移液工作站的配置就是个套路，通常见某飞公司为了弥补没有预装试剂盒的缺陷，而给客户做的方案。 第N个问题，工作站提取核酸还要解决比如加热，震荡，混匀，磁吸等等问题，每个都是一个模块，你先确定你买的工作站有没有这个模块，还要考虑震荡是否能达到充分混匀的效果，磁珠回收率的问题，有没有配套试剂盒的问题，仪器编程是否简单以及是否有应用工程师能帮你优化提取条件等等问题，毕竟提取高质量的核酸不仅仅需要硬件还需要试剂配套和程序优化。
核酸提取（样本处理） 血液： 使用QIAamp? DNA Mini Kit（组织）进行核酸提取，提取步骤如下。 开始前需要注意： 1、所有的离心步骤都在室温下进行（15-25℃） 2、200ul的全血会产生3-12ugDNA，如果需要更多的DNA产量需要准备血沉棕黄层。 (血沉棕黄层是全血中富含白细胞的部分，从全血中准备血沉棕黄层很容易，并且会比等体积的全血中DNA的产量高5到10倍；制备血沉棕黄层通过在室温中（15-25℃）将全血在2500×g离心10min，离心后会出现3个分层：最上层清晰的是血浆，中间的分层是血沉棕黄层，最底下的分层包含浓缩的红细胞) 实验开始前准备工作： 1、确保室温在15-25℃。 2、将恒温金属浴调到56℃，以备步骤4使用。 3、将Buffer AE或蒸馏水置于室温以备步骤11的洗脱。 4、确保Buffer AW1、Buffer AW2、蛋白酶K处理完毕。 （确保Buffers AW1和Buffers AW2已经按照瓶体的指示加上适量的96-100%的乙醇；当使用QIAamp? DNA Blood Mini Kit(50)，参照标签说明，将 1.2ml蛋白酶溶剂吸取到冻干的蛋白酶中溶解。当使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(250)，参照标签说明，将5.5ml蛋白酶
溶剂吸取到冻干的蛋白酶中溶解；溶解的冻干蛋白酶在2-8℃能存放12个月） 5、如果在加入Buffer AL后产生沉淀，那么56℃水浴溶解。 实验步骤： 1、吸取20ul的凯杰蛋白酶（或蛋白酶K）到1.5ml离心管中。 2、在离心管中加入200ul样本，可以是全血、血清、血浆、血沉棕黄层。 (如果样本体积少于200ul，加PBS到200ul；如果需要无RNA的基因组DNA，那么在加入Buffer AL之前要加入4ul的RNase A) 3、样本中加入200ul的Buffer AL，脉冲涡流混合15s。 （为了确保高效的溶解，必须将样本与Buffer AL充分混匀才能获得均一的溶液；如果样本体积多于200ul，成比例地增加蛋白酶K （或凯杰蛋白酶）、Buffer AL的量，例如，400ul的样本体积需加40ul蛋白酶K（或凯杰蛋白酶）、40ul的Buffer AL，如果样本体积大于400ul，那么推荐使用QIAamp DNA Blood Midi or Maxi Kits，这个试剂盒能处理到2ml或到10ml样本。注意：不要将凯杰蛋白酶或蛋白酶K直接加到Buffer AL中） 4、56℃孵育10min。 （在56℃溶解10min后DNA的产量会达到最大化，更长的孵育时间不会影响DNA的产量和质量） 5、将1.5ml离心管短暂离心，确保将管盖和管壁的溶液离心到管底。 6、加入200ul的96-100%乙醇，脉冲涡流混匀15s，短暂离心。
核酸提取方案 一、DNA提取 1．向离心管中加入200μl样品, 200μl消化液，涡旋震荡15秒 2．加入蛋白酶K 10μl混匀（RnaseA根据需要决定是否添加） 3．56℃孵育15分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底 4.加入250 μl无水乙醇，涡旋震荡15秒，室温放置5分钟，短暂离心，将管壁上的溶液收集到管底 5.将步骤4中所得溶液加入到已装入收集管（RNaseFree Tube 2 ml）的吸附柱（RNaseFree Column RS）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入，8,000 rpm离心1分钟6．向吸附柱中加入500 μl洗液（使用前检查是否已加入无水乙醇），8,000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 7．向吸附柱中加入500 μl无水乙醇，8,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 8．12,000 rpm（13,400×g）离心3分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干 9．将吸附柱置于一个新的收集管（RNaseFree Tube 1.5 ml）中，向吸附柱膜的中间部位悬空加入20-150 μl Buffer RE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10,000 rpm离心1分钟，收集核酸溶液 二、RNA提取 1．向离心管中加入200μl样品，加入500μl裂解液，充分混匀，静置3～5min（有杂质离心） 2．将吸附柱套入收集管，样品处理液转入吸附柱中(尽量不要吸到颗粒杂质，以免堵塞柱子)，4℃条件下12000rpm，离心1min 3．弃去收集管中液体，加入500μL洗液，4℃条件下12000rpm，离心1min 4．重复步骤3； 5．弃去收集管中液体，瞬离除去残液； 6．将吸附柱转入新的无RNA酶的1.5ml EP管中，向柱中央加入20-30μL洗脱液，室温静置2min溶解RNA, 4℃条件下12000rpm，离心1min,管中液体即为模板RNA
核酸提取常见试剂的 作用原理
异硫氰酸胍 强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。 盐酸胍、尿素 盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。 4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。 高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性 十二烷基肌氨酸钠 使蛋白质解体变性 巯基试剂 1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。 巯基乙醇 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较 (一)Chelex100法 原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。 方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml 离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。 评述： Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。 Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR 反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑150ul-200ul 二步法精斑100ul 毛根10ul 烟头30-50ul 对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH应在10—11之间，否则应丢弃，不应人为调整Chelex100悬液pH值。 (二)有机法 原理：有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带有亲水性基因，很容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中，形
五种核酸自动提取仪的比较 厂家产品名称原理通量及工作效率配套耗材样品混匀模式得率及分析样本裂解单个样品样本是否需要预 方式提取成本处理 (人民币 ) BioTeke IAUTOMAG核酸磁珠法32 通道通用的毫升震荡混匀，底部高于离心柱方组织块直10-15 元不需要提取仪深孔板，可独立控温，紫外法接加入，不 以处理更高灭菌需要预先 容量样品研磨过夜 消化 ABI MAGMAX24 磁珠法24 通道毫升微孔无加热模块，低需要样品20-30 元预消化 5 小时或 板，不能处预先研磨者过夜 理体积大样过夜消化 品，专用耗 材价格昂贵 Eppendorf 5075 VAC 核酸分负压法不96 通道，只配套无加热模块，不负压法易导致需要样品20-30 元预消化 5 小时或
离纯化工作站适合提取Eppendorf 能自动提取组96 孔某些孔预先研磨者过夜 组织，会96 孔板及移织，粘稠样品，液体残留，洗过夜消化 堵液用枪头，所以叫分离纯脱不完全，洗 耗材成本高化工作站，而不脱效率低于离 是提取仪心法和磁珠法 Thermo Kingfisher 只有 8个24 通道（微孔板，容只配套专用加热模块单配，试剂需要手工需要样品20-30 元预消化 5 小时或固定的程量 200ul ）或者 15 通耗材，使用无法全自动提加，裂解需要预先研磨者过夜 序组，只道(微孔管，容量微孔板（酶取全血、组织等借助外部裂过夜消化 能通过电1000ul) ，只能处理少标板）微孔需要蛋白酶 K裂解，提取效果 脑编辑输体积样品，管，耗材成解的样品，所以低于离心柱法 入本太高叫磁珠分选纯 化仪，而不是核 酸自动提取仪， 选配加热模块 价格极高
核酸的提取 核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为： 裂解细胞 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 沉淀核酸 纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质 (一)DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 说明： 回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或8 RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA 有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA 时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。 玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。 DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。 2．RNA提取中RNase污染的控制 最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。 实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。 RN A提取方法 下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。 异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。 RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA 分子。 因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。
核算提取仪 北京贝尔生物工程有限公司 PCR室 一．核酸提取技术
精选文库随着近年来分子生物学技术的高速发展，核酸扩增，核酸杂交将成为进行病原菌微生物检测，物种鉴定，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统计划等常用研究手段之一。这样的分子检测和分子诊断技术在人体健康体检、视频法医等领域中具有至关重要的作用。而在所有的现代分子生物学检测技术首先面临的问题就是如何从样品中快速有效的分离提取所需的基因组核酸，并且大规模高质量的提取核酸分子也成为了一个挑战。 自1869年人类首次发现核酸分为脱氧核当核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），核酸的提取方法包括各种实验材料和试剂都一直在进行着改进，柠檬酸钠、RNase、SDS、硫氰酸胍等先后应用于核酸的提取。现今核酸的提取方法中主要有一些传统的方法比如CTAB法、Trizol法、氯化锂法、以及一些新兴的方法比如旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法。总的来讲，不管采用什么样的方式方法进行核酸的提取以及纯化，主要可以分为以下三步： 第一步为利用物理或化学的方式促进细胞破裂，使细胞中的核酸释放出来。 第二步是初步的将核酸与细胞内部的蛋白质、多糖、脂类分离。新兴的方法比如旋转离心柱提取法是利用特定的载体，将释放的核酸吸附在特定的载体上，这种载体有且仅对于核酸具有较强的亲和力和吸附力。 第三步则是将核酸进行最后的洗脱与富集。 虽然具有相通的原理，对比传统的核酸提取法与新兴的核酸提取法，传统的核酸提取技术中包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本，而且传统提取步骤较为繁杂，费时长，效率低下，很难实现自动化以及规模化，大部分方法涉及到有机试剂的使用，对于操作人员具有潜在的威胁，其应用的范围受到了明显的局限。因此，随着时间的推移，传统的从液相系统中分离提取核酸的方式逐步的被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。 二、磁珠核酸提取法 20世纪90年代，磁珠提取核酸的方法是为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化的操作需要所打造的方法。该方法是纳米技术与生物 — 2
核酸的提取与纯化 一 DNA的提取与纯化 （一）实验目的与主要原理 DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎， 暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使 DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去 除蛋白质，从而提取高纯度DNA。 （二）实验材料 蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/l Tris(pH 8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅 胶柱，TE（10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。 （三）实验方法 DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见，主要步骤如下。 1 样本前处理 哺乳动物细胞：提前准备55℃冰浴。
（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。 （2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到500ug/ml，37℃孵育4~6小时。 动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。 （1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。 （2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h,可以 过夜裂解，每小时颠倒2~3次）。 （3）如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A于样品中，室温孵育2min。 （4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。 2 DNA提取过程 （1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去） （2）将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗2~3次。 （3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE（60℃），或去离子水（pH）7.0），室温静 置1min，12000r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的ＤＮ Ａ置于－２０℃保存。