MCPIP 1蛋白质结构、功能的研究进展
摘要
ZC3H12A是免疫系统中的一个重要基因，其编码的蛋白质ZC3H12A/MCPIP 1在免疫相关疾病，尤其是自身免疫病和炎症反应中发挥重要的抑制效应。ZC3H12A的表达能够被多种炎症相关细胞因子所诱导。近来的研究报道，MCPIP 1具有转录因子、RNA酶、去泛素化酶等作用，其在调控基因转录、mRNA降解、多聚泛素链的去除、细胞凋亡、细胞自噬、炎症抑制、细胞分化、血管生成等方面都有重要作用。基因敲除小鼠患有严重的高免疫球蛋白血症、淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚及自身抗体的大量产生等免疫功能紊乱疾病。
本文较为系统地阐述了ZC3H12A基因的克隆、MCPIP 1蛋白的结构及功能，从时间的维度观其主要研究历程，以及对免疫系统的重要影响。大体上浅析了MCPIP 1从其发现至今的探索情况。
【关键词】ZC3H12A Zc3h12a MCPIP 1 RNA酶凋亡去泛素化酶
1 简介
ZC3H12A/MCPIP是一种锌指蛋白。它的全名是具有CCCH锌指结构域的蛋白质12A（Zinc finger CCCH domain-containing protein 12A），简称ZC3H12A[1]，又称MCP-1诱导蛋白（MCP1-induced protein，MCPIP 1）[2]。MPCIP的编码基因是ZC3H12A，它属于ZC3H12基因家族，该家族中共有4个成员，分别编号为ZC3H12A、ZC3H12B、ZC3H12C、ZC3H12D[1]。此家族保守性很强，在很多物种（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠和大鼠等）中都有发现其同源序列[1]。MCPIP 1最初被发现于经MCP-1处理的人外周血单核细胞中[2]，而后又在经IL-1β刺激的人单核细胞来源的巨噬细胞中被发现[3]。在TNF、MCP-1、IL-1β或LPS等细胞因子的作用下，该基因的转录水平被显著激活[1, 2, 3, 4, 5, 6]。同时，具有CCCH锌指结构的蛋白质在巨噬细胞相关的器官（如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等）中表达水平很高[6]。对于Zc3h12a基因敲除小鼠的表型分析表明[4, 7]，该基因的缺陷与自身免疫疾病的发生相关，在炎症相关的生理和病理过程中具有重要意义。
克隆发现
该基因的发现
单核细胞趋化蛋白质1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，它能够招募并激活单核/巨噬细胞，是使单核/巨噬细胞迁移的主要趋化因子。MCP-1与靶细胞膜上的CCR2结合，启动了一系列的信号通路，导致单核/巨噬细胞向MCP1高浓度处趋化性迁移[8，9]。用MCP-1刺激人外周血单核细胞后，提取细胞内的总mRNA。将测序结果与基因注释数据库中的数据进行序列比对后发现了一些未被注释的基因。其中表达差异最显著的一个基因是目前未知功能的基因，在EST数据库中查找到了与之相对应的序列，同时在GeneBank 数据库中查找到了对应的人cDNA克隆。（GeneBank序列号AW206332）研究者将它命名为人MCP1诱导蛋白（MCP-induced protein，MCPIP 1）[2]。
对蛋白质序列分析发现，MCPIP 1有599个氨基酸，分子质量约为65.8kD，有两个脯氨酸富集区，一个核定位序列，和一个CCCH锌指结构域[2]。而后发现其序列中还存在一个PIN结构域[4]和一个泛素结合结构域[7]。由于该蛋白质具有CCCH锌指结构域，因而被命名为具有CCCH锌指结构域的蛋白质12a（ZC3H12A）[1]。序列比对发现，人MCPIP 1与小鼠中的同源蛋白质的氨基酸组成有82%的相似度，cDNA的核苷酸序列组成有80%的相似度[2]。
该基因家族的发现
将MCPIP1蛋白质序列输入GeneBank数据库，在人中查找到另外3个与之相似度很高的序列。研究者将它们归属于同一家族，分别命名为MCPIP1、MCPIP2、MCPIP3、MCPIP4，其相对应的基因分别被命名为ZC3H12A(位于染色体1p34.3)、ZC3H12B(位于染色体Xq12)、ZC3H12C(位于染色体1q22.3)，以及ZC3H12D(位于染色体6q25.1)。这一家族的成员间的共同特点为，它们都含有一个CCCH型锌指结构。同时，在小鼠中也发现了这四个基因的同源基因[1]。
基因与蛋白质概况
基因定位
通过对基因组序列比对分析，ZC3H12A位于人染色体1p35.3-p33上，Zc3h12a位于小鼠4号染色体上。
基因结构
ZC3H12A的大小约为9860 bp，有6个外显子。第一个外显子是非编码序列，转录从第二个外显子开始。启动子位于该基因上游-76~60bp，具有一个Elk-1结合位点和一个SRF结合位点[10]。增强子位于第二个内含子中，具有4个NF-kB结合位点[5]。该基因上有61个已被描述的SNP。在这些SNP中，11个是非同义的SNP，其中1个位于启动子中，2个位于第二个内含子上的增强子中。在这11个非同义SNP中，有2个是标签SNP。
蛋白质结构
ZC3H12A编码的蛋白质MCPIP 1有599个氨基酸，其分子质量为65.8 kd。对MCPIP 1的序列分析表明，该蛋白质中含有CCCH锌指结构域（能够介导蛋白质与核酸的作用）、核定位序列、脯氨酸富集区（介导蛋白质与蛋白质的相互作用）、PIN结构域（具有RNA酶活性）、以及泛素结合结构域等。这些特征性序列模体为MCPIP 1功能的研究指明了方向。通过同源性分析，研究者在小鼠基因组中发现了与MCPIP 1同源的基因序列。在核苷酸水平上它们的相似度有80%,在蛋白质水平上它们的相似度有82%。
通过序列比对分析发现，MCPIP家族在进化上有很高的保守性，在很多动物中（包括果蝇、秀丽线虫、小鼠、大鼠）都存在与该家族成员高度同源的cDNA序列[1]。
CCCH锌指结构域
CCCH结构是锌指的一种类型，主要的作用是结合RNA[6, 11, 12]，调控mRNA的加工。哺乳动物有1%的基因编码锌指蛋白[13]。目前所知，共有至少14种锌指，CCHH型和CCCC
型锌指较为常见，CCCH型锌指较少见，只占锌指蛋白的约0.8% [11, 12, 14]。
CCCH锌指结构由17到25个氨基酸组成。CCCH蛋白的特点是包含1到6个CCCH型（C-X4 -C-X4–6-C-X3-H）锌指结构域，同时也富含甘氨酸和苯丙氨酸。CCCH锌指结构域十分–15
保守，在植物、无脊椎动物、脊椎动物中都有发现。[15]锌指蛋白通常是DNA结合蛋白。锌指也能调节该蛋白与RNA、蛋白质、脂质的作用。CCCH锌指蛋白中的大多数能与RNA 结合，调控mRNA的加工，包括mRNA成熟、出核、修饰、降解[11, 12]。该类型的蛋白质在巨噬细胞相关的器官内表达量很高，如胸腺、脾脏、肺、小肠和脂肪组织等[6]。
目前研究较充分的CCCH型锌指蛋白是TTP（tristetraprolin）家族，包含4个成员，分别是TTP (Zfp36)、Zfp36l1、Zfp36l2以及Zfp36l3。该家族成员都包含两个串联的CCCH型锌指结构域，能够与mRNA的3’端非转录区（3’-untranslated region，3’-UTR）的AU富集区（AU-rich element，ARE）结合，从而导致该mRNA的poly（A）尾的降解，进而使整个mRNA降解[16, 17, 18]。MCPIP 1的CCCH锌指结构是C(X)5C(X)5C(X)3H 型锌指结构，与TTP中的两个锌指结构有些许不同，TTP中的锌指结构是C(X)8C(X)5C(X)3H型[1]。
在多个数据库中搜索，发现了58个小鼠CCCH锌指基因和55个人CCCH锌指基因。在这58个小鼠基因中，有26个是已研究过的基因，其中20个与RNA代谢相关，如前体mRNA 的剪切、mRNA转移出核、细胞定位、稳定性（降解）等[6]。
用系统进化软件分析发现，无论从蛋白质氨基酸序列全长还是仅从CCCH结构域序列来看，Zc3h12家族都与Zfp36家族划于一类[6]。这很大程度上说明此二者在结构、功能上可能具有很多共同点。
脯氨酸富集区
Zc3h12a有2个脯氨酸富集区，分别位于第100~126位氨基酸（脯氨酸占37%）和第458~536位氨基酸（脯氨酸占28%）[2]。脯氨酸富集区通常调节蛋白质与蛋白质的相互作用，说明ZC3H12A可能通过此结构域，与其他蛋白质有相互作用。
PIN结构域
PIN结构域（PIN-like domain）位于ZC3H12A蛋白氨基酸序列的第130–280位。多数具有该结构域的蛋白质都有RNA酶活性。在该结构域中有4个经典的保守的酸性氨基酸，分别是D141、E185、D226、D244，它们形成一个带负电的袋子状的空间结构，能够与Mg2+结合，从而发挥降解mRNA的作用[4]。该RNA酶结构域在Zc3h12家族4个成员间是保守的，并且在多种物种中都找到了其同源序列[4]。
DUB结构域
MCPIP1的去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）结构域位于N端，与去泛素化功能相关[7]。人类基因中有100个DUB[19]，这些DUB被分为5个家族：泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases，USPs）、卵巢肿瘤蛋白酶（otubain proteases，OTU）、MJD蛋白酶（Machado-Joseph disease proteases）和具有JAB1/PAB1/MPN结构域的金属蛋白酶（JAB1/PAB1/MPN domain–containing metalloenzymes）。每个家族都含有一种特殊的但保守的DUB结构域[20]。序列比对发现MCPIP1序列中不存在上述已知的任何一种DUB结构域。然而序列比对发现，该蛋白质N端具有一个泛素相关结构域（ubiquitin association domain，UBA）。该结构域在多种物种的MCPIP1蛋白质序列中保守[7]。实验发现，该结构域具有结合泛素的作用[7]。同时，通过序列分析发现，该蛋白质的N端具有一段在多种物种中都十分保守的区域（N-terminal conserved region，NCR）。该区域中含有1个半胱氨酸盒（Cys box）和1个天冬氨酸盒（Asp box）[7]，这两段保守序列在很多DUB中都存在。通过体外捷短实验发现，NCR具有去泛素化酶的活性，该段区域与一种DUB结构域——UCH具有27%的序列相似度。MCPIP1的去泛素化酶活性与很多其它的去泛素化酶都有相似的特点。如含有两个保守的序列模体——半胱氨酸盒（Cys box）和天冬氨酸盒（Asp box）；作为半胱氨酸蛋白酶，MCPIP1的去泛素化酶活性会被一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM完全抑制；其去泛素化酶活性并不依赖于Mg2+和ATP，但是Zn2+和Mn2+却会对该酶活性产生抑制作用。
序列分析发现，MCPIP1中的去泛素化酶结构域与RNA酶结构域都位于NCR区域。Asp box中的D141、Cys box中的C157和锌指结构域中的C306是DUB活性的关键位点。D141也是RNA酶活性的关键位点。D141、C157、C306和D278/D279的突变会影响MCPIP1对NF-κB信号通路的抑制活性。C157的突变也会导致MCPIP1对JNK信号通路活性及LPS 诱导的炎症细胞因子产物的抑制效应的丧失。这些结果都说明，MCPIP1对炎症信号通路的抑制效应与DUB活性息息相关[7]。
蛋白质的亚细胞定位
对MCP-1转基因小鼠的表型分析发现，MCPIP 1主要定位于心肌细胞的细胞核中[2]，而随后对小鼠巨噬细胞中MCPIP 1表达情况的研究表明MCPIP1定位于细胞质[1, 4]，而后对HepG2细胞的研究表明MCPIP1定位于细胞骨架及以颗粒的形式位于细胞质中[3]。
基因的组织特异性表达情况
Northern Blot分析表明，ZC3H12A基因的mRNA在白细胞中含量最高，其次是在心脏组织和胎盘，在脾脏、肾脏、肝脏和肺中稍低。在脑、胸腺、肌肉组织、小肠和结肠中基本上没有其转录本的存在。据MCPIP1的mRNA在白细胞中的高含量推测其在免疫系统中具有重要作用[3]。
基因敲除小鼠表型
Zc3h12a敲除小鼠表现为生长迟缓，且大多数在12周内自发死亡。敲除小鼠患有严重的脾肿大和淋巴结肿大。肺部浆细胞浸润、胆管和胰腺的副上皮化（paraepithelium）。浆细胞在淋巴结和脾脏中大量聚积。在淋巴结内，肉芽肿的形成导致巨噬细胞融合形成巨细胞。Zc3h12a敲除小鼠患有严重的贫血，以及白细胞和血小板的升高。并患有高免疫球蛋白血症，肺间质组织中有浆细胞浸润，并产生大量的IgG和IgA。在小鼠中发现抗核抗体和抗双链DNA抗体。70%的CD19+B细胞是IgM-IgD-，而不是免疫球蛋白+，说明大多数的B 细胞在脾脏内发生类型转换。CD138+CD19dull的浆细胞在脾脏中很多。另外在脾脏CD3+T 细胞中CD69的表达上调，在外周，CD44high CD62L-T细胞积聚。然而，CD4+Foxp3-调节性T细胞的比例没有变化。用抗CD3的抗体刺激脾脏T细胞后，IFNγ的产量增加，但IL-17没变。在脾脏中，Ter119+的有核红细胞的量很高，可能是由于贫血的缘故。然而，脾脏中B和T细胞的比例、CD4+和CD8+细胞的比例没有变化。通过将基因敲除小鼠的骨髓转入经辐照的正常小鼠中，发现受体小鼠表现出延迟但显著的淋巴结肿大、浆细胞和记忆细胞的积聚。这说明是造血细胞导致小鼠免疫功能紊乱的发生。以上这些表型说明，Zc3h12a 在防止以能分泌免疫球蛋白的浆细胞数量的增加及肉芽肿形成为标志的重症自身免疫性疾病的发展中发挥重要作用。
用TLR的配体，MALP-2（TLR2）、poly(I:C)（TLR3）、LPS（TLR4）、R-848（TLR7）和CpG-DNA（TLR9），刺激基因敲除小鼠的巨噬细胞后，IL-6和IL-12p40的表达水平升高，但是TNF水平没有变化。经LPS刺激后，巨噬细胞表达的IL-6的mRNA显著增加，但TNF、Cxcl1、NF-κB的mRNA水平没有变化。IL-6、IFN-γ、Calcr和Sprr2d的mRNA在敲除小鼠巨噬细胞中的表达显著升高。用LPS刺激后，Zc3h12a敲除小鼠和正常小鼠的巨噬细胞相比，NF-κB或（activator protein 1，AP-1）没有显著变化，说明MCPIP1没有参与调节TLR初始信号通路。
基因敲除小鼠血浆中的TNF和MCP-1含量显著增加。无论是在正常培养条件下还是在LPS 诱导条件下，骨髓来源的巨噬细胞分泌的促炎细胞因子的水平都有很大程度的提高，如TNF、IL-1β、IL-6和MCP-1。LPS刺激后的骨髓来源的巨噬细胞产生的炎症细胞因子的
mRNA也有很大程度的提高，包括TNF、IL-1β和IL-6。在小肠、肺和胸腺中的炎症细胞因子的表达都有很大程度的提高，包括TNF、IL-1β、IL-6和iNOS （inducible nitric oxide synthase，可诱导的一氧化氮合成酶）。
敲除小鼠自发地患有致死性的炎症综合症。其巨噬细胞和脾脏细胞中炎症相关基因的表达有显著提高，JNK和IκB激酶的活性升高，TNF受体相关因子的多聚泛素化升高。基因敲除小鼠的炎症相关细胞因子的表达增强。骨髓来源的巨噬细胞对LPS的刺激更为敏感。这些结果都说明12a基因是炎症反应和免疫自稳态的重要调控因子[4, 7]。
基因功能
作为转录因子，能够激活凋亡相关基因的转录
MCPIP 1是具有CCCH锌指结构的转录因子，能够激活凋亡相关基因的表达，从而导致细胞凋亡。
通过TUNEL分析发现，过表达ZC3H12A的HEK-293细胞中，caspase-3被激活，随后细胞发生凋亡。而用Z-V AD-fmk 作用于该细胞后，发现细胞凋亡情况得到缓解。同时，在体外通过荧光素酶报告基因实验发现，MCPIP 1锌指结构域的突变和脯氨酸富集区的突变，会影响荧光素酶报告基因的转录。同时，这些结构域的突变也会导致细胞凋亡的减少。这说明MCPIP 1中，转录因子功能相关的结构域，与诱导凋亡相关的结构域相同。也就是说，MCPIP 1诱导转录的基因即为凋亡相关的基因[2]。这说明作为转录因子，MCPIP 1能够激活细胞凋亡相关基因的转录，从而诱发细胞凋亡。通过对MCPI-1转基因小鼠的表型分析，发现MCPIP 1在心肌细胞中高度表达，且主要集中于细胞核中。在人中，对做过心脏移植手术患者的心脏组织的研究发现，与未患有缺血性心脏病的患者相比，患有缺血性心脏病的患者，其心肌细胞中MCPIP 1的mRNA含量很高。同时在小鼠模型中和人中都发现，患有缺血性心脏病的个体，MCPIP 1在心肌组织中都高度表达。由于MCPIP 1会激活一系列凋亡相关基因的转录，导致细胞凋亡，从而推测其在缺血性心脏病的发展中具有重要意义[2]。
氧化胁迫（oxidative stress）会诱发内质网胁迫（ER stress），[21]进而导致细胞自噬[22]，而后细胞发生死亡[23]。对于心肌成肌细胞（cardiomyoblast）的研究表明，MCP-1的刺激会诱导MCPIP 1的表达，而产生氧化胁迫，从而导致内质网胁迫，进而引发细胞自噬，最终致使心肌成肌细胞死亡。而ZC3H12A基因knockdown后该效应减弱。MCPIP1能够激活可诱导的一氧化氮合成酶（inducible NO synthase，iNOS）的表达，使NADPH氧化酶亚单
位phox47从细胞质迁移到细胞膜，诱导反应活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，诱导ER胁迫标志物热激蛋白40（heat-shock protein 40，HSP40）、PDI（protein disul?de-isomerase）、GRP78（guanine-nucleotide-releasing protein 78）以及IRE1α（inositol-requiring enzyme 1α）的表达。MCPIP1也能引发细胞自噬，通过诱导自噬标志物beclin-1、剪切LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）以及诱发自噬溶酶体的形成。同时，研究发现，在MCPIP1诱发细胞死亡的过程中，caspase 2/12、JNK （c-JunN-terminal kinase）、p38、p53和PUMA（p53 up-regulated modulator of apoptosis）都被激活。这些结果说明，MCPIP1诱导了ROS /RNS （reactive nitrogen species，反应活性氮）的产生，从而导致ER胁迫，进而通过caspase 2/12和IRE1α-JNK/p38-p53-PUMA 信号转导通路引发细胞自噬和凋亡[24]。
作为转录因子，能够抑制炎症相关基因启动子的活性
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，LPS可作用于TLR4并激活MyD88，后者可聚集并结合IRAK1和IRAK2，作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），进而激活MAPK和NF-κB信号转导通路。活化的MAPK和NF-κB信号转导通路是LPS所导致的细胞反应与炎症细胞因子（如TNF-α，IL-6和IL-8等）产生的重要分子机制[17]。
在经LPS刺激的小鼠巨噬细胞系Raw264.7和人急性单核细胞白血病细胞系（the human acute monocytic leukemia cell line）THP-1来源的巨噬细胞中，MCPIP1的mRNA和蛋白质水平都有显著升高。过表达MCPIP1后，LPS刺激后的巨噬细胞分泌的炎症细胞因子及氮氧化物的水平却显著下降。而用siRNA干扰掉Zc3h12a基因后，这些炎症细胞因子和氮氧化物的水平相比于正常情况有显著增加。这说明MCPIP1会抑制LPS诱导的炎症细胞因子（如TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1）以及iNOS的表达[1]。
LPS能够通过某些细胞信号转导途径激活肿瘤坏死因子（TNFα）及iNOS启动子的活性。而实验发现MCPIP 1能强烈地抑制LPS诱导的TNFα及iNOS启动子的活性。TNFα和iNOS 启动子可以被NF-κB信号途径所激活。而过表达MCPIP1显著抑制了p65诱导的TNFα启动子、iNOS启动子的活性。LPS能够激活NF-κB信号途径。而过表达MCPIP1强烈地抑制了LPS诱导的NF-κB小启动子的活性。这些说明MCPIP1可能是NF-κB信号转导通路的一个负向调节因子[1]。
作为转录因子，能够诱导细胞分化
研究报道，在NT2神经母细胞（neuroprogenitor cells）中，MCPIP 1的激活了神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）的表达，并导致细胞形态学的变化，进而致使细胞分化为神经胶质细胞[25]。
在脂肪细胞形成的过程中，C/EBP转录因子家族（C/EBPβ，C/EBPδ，C/EBPα）以及PPARγ诱导一系列基因的转录，从而使细胞分化为脂肪细胞。PPARγ是脂肪细胞形成的重要转录因子[26]，因为所有其他转录因子必须在PPARγ的存在下，才会诱导脂肪细胞的形成[27]。然而，对PPARγ-/-的小鼠胚胎成纤维细胞的研究发现，强制表达MCPIP 1后，细胞会在没有PPARγ的情况下，产生大量C/EBP转录因子家族成员，并分化为脂肪细胞。同时，对3T3-L1细胞的研究发现，强制表达MCPIP 1后，C/EBP转录因子家族、PPARγ的表达增强[28]。
这两项研究说明，MCPIP 1通过诱导基因的转录，进而调控某些细胞的分化。
作为转录因子，能够诱导血管生成
研究发现，MCPIP 1的过表达会增强人胚胎血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的凋亡、增殖、迁移和血管生成相关基因的表达，进而导致血管生成。N-钙黏附分子（cadherin）在内皮细胞间黏着斑（桥粒，adherence junction）的形成中起重要作用[29]，它能够通过调控黏着斑的形成和内皮细胞的行为，进而导致血管形成[30]。对HUVEC细胞的研究发现，过表达MCPIP 1能诱导钙黏附分子基因cdh12和cdh19的表达以及血管生成。同时染色质免疫共沉淀实验证明，在体内钙黏素（cadherin，cdh）12和cdh19能够与MCPIP 1结合。相反，cdh12或cdh19 knockdown后抑制了MCPIP 1的诱导血管生成作用，同时，MCPIP 1 knockdown后也抑制了MCP-1诱导的cdh12和cdh19的表达。这说明，MCP-1能够诱导MCPIP 1的生成，而作为转录因子的MCPIP 1能够通过激活血管生成相关基因（如cdh12和cdh19）的转录，进而诱导血管生成[31]。
作为RNA酶，能够降解mRNA
实验发现，MCPIP1具有降解炎症相关细胞因子如IL-2、IL-6、IL12p40、Calcr、IL-1β的mRNA的作用，即它是一个RNA酶[3, 4]。在该基因敲除小鼠中，自身免疫病的发生大大提高[4]，说明这种降解功能在阻止自身免疫功能紊乱中发挥重要作用。
基因敲除小鼠的巨噬细胞中，IL-6的mRNA半衰期大大延长。相反，过表达Zc3h12a极大地增强了IL-6的mRNA的降解。同时，研究发现，用siRNA干扰掉MCPIP 1基因表达后，LPS刺激后的人成纤维细胞中，IL-1β的转录水平显著提高。然而，过表达MCPIP 1后，
产生了相反的效应。体外实验证实，MCPIP1能与IL6和IL-1β的3’UTR结合[3, 4]。
对IL-6 mRNA的研究发现，其3’UTR序列中含有5个AU富集区（adenine-uridine-rich elements，ARE）[32]，以及一个在物种间非常保守的由30个左右的核苷酸组成的元件[33]。ARE是一种经典的，与mRNA不稳定性有关的结构，存在于很多细胞因子（如TNF、GM-CSF、CXCL1等）的mRNA 3’UTR中[34]。TTP能够识别这些细胞因子的ARE结构，进而招募去腺苷化酶（deadenylase），后者会移除mRNA的poly(A)尾，进而使mRNA被核酸外切酶降解。然而，在IL-6和IL-1β的mRNA中，与mRNA不稳定性相关的结构并非是ARE，而是其保守元件[3, 4]。该保守元件能形成一个RNA二级结构的茎环（stem-loop）结构，研究发现该茎环结构的存在对于mRNA的稳定具有重要意义[3, 35]。
MCPIP 1中CCCH锌指结构的突变或缺失，对IL6 mRNA的降解活性没有显著影响。这说明CCCH结构对于MCPIP1降解IL6 mRNA只起部分作用。序列比对发现，MCPIP1的N 端有一段保守序列（139-297AA），与PIN（PilTN-terminus）结构域有一定的同源性。该结构域中有4个重要的酸性氨基酸位点（D141、E185、D226、D244），它们在空间上形成一个保守的带负电的袋子结构，能够与Mg2+结合，发挥RNA酶功能。对D141的突变使MCPIP1丧失降解IL6 mRNA的RNA酶的能力，说明该PIN结构域对于MCPIP 1 RNA酶功能的发挥具有重要意义[3, 4]。且过表达PIN结构域突变或完全缺失的MCPIP 1，对IL-1β的mRNA也不再具有降解作用[3]。同时，序列分析发现，PIN结构域在ZC3H12家族的四个成员间是保守的[4]。
与TTP对比发现，MCPIP1虽然也能使mRNA降解，但它们的降解机制却有很大的不同。如TTP能降解TNF、GM-CSF、CXCL1等细胞因子的mRNA，而对IL6的mRNA没有影响。相反，MCPIP1不影响TNF等细胞因子的mRNA[1]，但能使IL6、IL12p40、IL-1β的mRNA降解。这说明它们对不同的细胞因子的mRNA起作用。另外，TTP是通过mRNA 的3’UTR的ARE结构起作用，而MCPIP1则是通过mRNA的3’UTR的保守元件起作用。另外，TTP招募去腺苷化酶（deadenylase），从而移除mRNA的poly(A)尾，进而使mRNA 被核酸外切酶降解；而MCPIP1本身即有核酸内切酶的活性。且体外实验表明，MCPIP1的核酸内切酶活性所针对的RNA不具有序列特异性。其体内的靶mRNA序列特异性可能是由MCPIP1的结合蛋白质决定的，或是该蛋白在体内特定的环境条件下，对mRNA的序列具有一定的偏好。这都说明MCPIP1对mRNA的降解机制与TTP存在很大区别[4]。
另外，体外实验表明，MCPIP 1能够与MCPIP 1自身的mRNA结合，并能调控其降解[3]。这一反馈环路的存在使得MCPIP 1的调节能力更加精细。MCPIP 1针对这些细胞因子的
RNA酶功能，使MCPIP 1成为炎症过程的一个重要的调控因子。
作为去泛素化酶
泛素-蛋白酶体途径是细胞内ATP依赖的蛋白质选择性降解的主要途径。通过对底物蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解，可以影响或调节多种细胞活动，包括：基因转录、细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长、炎症过程等[19]。泛素是真核生物中高度保守的蛋白，由76个氨基酸组成。泛素有7个赖氨酸，通过不同的连接，可形成具有不同拓扑结构和功能的多聚泛素链。
去泛素化酶能水解底物蛋白上的多聚泛素链之间的链接，起到去泛素化的作用，对蛋白降解进行反向调节，从而影响蛋白质的功能，如影响或调节细胞的生长发育、信号转导和神经病变或肿瘤等许多细胞生理和病理过程[19]。
NF-κB（核因子-κB）属于转录因子家族，具有调节免疫，炎症和细胞存活的作用。NF-κB 抑制蛋白（inhibitors of NF-κB，I-κB）可与NF-κB的二聚体紧密结合形成无活性的大蛋白复合体而停留在胞浆中。当NF-κB信号传导途径激活时，I-κB激酶（I-κB kinase complex，IKK）被激活，从而导致I-κB的磷酸化，继而使其受到泛素化修饰，最后在蛋白酶体内降解。I-κB降解后，NF-κB的核定位信号暴露，NF-κB可进入细胞核内，与DNA上的特定部位结合，促进特异基因的转录。Lys48（K48）结合的多聚泛素链优先降解I-κB；而Lys63（K63）结合的多聚泛素链则调节TAK1和IKK的活性，最终活化NF-κB。
肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）被认为是将活化的受体连接到下游激酶的衔接蛋白，放大激酶信号。TRAFs参加了大量受体家族的信号转导，主要包括（IL-1 receptors，IL-1R），Toll样受体（Toll-like receptors，TLR），T细胞受体（T-cell receptors，TCR）和B细胞受体（B-cell receptors，BCR）。TRAF2是NF-κB信号转导途径中的一员，TRAF2如果发生Lys48（K48）相互连接的多聚泛素化，则导致其自身的降解；如果发生Lys63（K63）相互连接的多聚泛素化，则能开启NF-κB的下游信号通路[37]。
c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）家族是丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）超家族成员之一。该家族的其它成员包括，细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、p38以及ERK5。JNK信号通路可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活。JNK活化在细胞增殖、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着重要的作用[38]。
实验观测到，MCPIP1过表达的细胞，其TRAF2、TRAF3、TRAF6、RIP以及IκBα的泛素化水平显著降低。相反，MCPIP1缺陷的细胞中，基础和LPS诱导的TRAF2、TRAF3和TRAF6的泛素化水平显著升高。由于TRAF2和TRAF6是RIP（受体相关蛋白，receptor
interacting protein）和IκBα的上游影响因子，因而推测MCPIP1对RIP和IκBα去泛素化的影响是间接的，对TRAF家族成员的去泛素化影响则是直接的。该蛋白质通过移除TRAF2、TRAF3以及TRAF6等蛋白质的多聚泛素链，从而负向调节炎症信号通路JNK和NF-κB 的活性[7]。
MCPIP1在LPS及IL-1β诱导的JNK激活过程中是一个效力强大的抑制因子。然而，它对LPS诱导的IKK激活过程的抑制效应却不是很显著。而且它对IL-1β诱导的IKK激活过程基本无影响。然而过表达MCPIP1能显著抑制LPS和细胞因子诱导的NF-κB依赖的报告基因的活性，这就说明MCPIP1也能够作用于NF-κB信号通路的下游效应分子。在基因敲除小鼠的肺部发现，JNK和IKK都被结构性激活；而在骨髓来源的巨噬细胞中没有发现此现象，只有在LPS刺激下，JNK和IKK才被激活[7]。
MCPIP1能够通过选择性地剪切TRAFs、RIP和NEMO的K63相互连接的多聚泛素链，从而负向调节JNK和NF-κB的信号通路。同时，在体外该蛋白质也能剪切K48相互连接的多聚泛素链。实验表明，该蛋白质能够显著地影响细胞中所有蛋白质的泛素化[7]。MCPIP1作为RNA酶，能够通过降解炎症相关细胞因子（如IL-6、IL-1β等）的mRNA，抑制炎症的发展；同时，作为去泛素化酶，该蛋白质能够通过去掉TRAF的泛素，负向调控JNK和NF-κB的信号通路，从而发挥抑炎效应。因而MCPIP 1可以通过多种机制来调控炎症反应，维持免疫自稳态。因而它在炎症疾病的治疗中的作用将不容忽视[7]。
调节
研究发现，MCP-1、LPS、IL-1β、TNFα以及PMA（phorbol 12-myristate-13-acetate）都能诱导MCPIP 1的表达[1, 2, 3, 4, 5]。
IL-1β对ZC3H12A的调节
IL-1β是促炎细胞因子，在多种应激过程的早期就会产生。它可以多种方式作用于多种细胞。IL-1β与IL-1受体Ⅰ（IL-1RⅠ）的结合激活了TAK1激酶，最终导致了NF-κB的激活以及MAPK（即ERK、p38、JNK）的激活。研究发现，在经IL-1β刺激的单核细胞、成纤维细胞和肝癌HepG2细胞中，MCPIP 1转录本的含量迅速升高。IL-1β能够通过激活NF-κB通路和MAPK通路，进而激活ZC3H12A的转录[5, 10]。.
实验发现，与相比，抑制掉NF-κB通路的HepG2细胞在IL-1β的刺激下，其ZC3H12A转录本的水平要远远低于野生型HepG2细胞。这说明IL-1β能够通过激活NF-κB通路，进而激活ZC3H12A的转录[5]。
在HepG2细胞系和人单核来源的巨噬细胞中都发现，IL-1β能够通过激活ERK（MAPK）通路，使转录因子Elk-1磷酸化并与ZC3H12A的启动子结合，从而激活ZC3H12A的转录。Elk-1是一个重要的转录因子，它能调控许多早期基因（immediate-early genes），尤其是转录因子基因的表达。这些早期基因进而调控一系列在细胞对环境变化的响应中发挥重要作用的蛋白编码基因的表达。通过构建带有荧光素酶报告基因及ZC3H12A调控序列不同长度片段的质粒，研究者发现，转录因子Elk-1对ZC3H12A转录的调控是通过ZC3H12A序列的-76到+60位实现，即该处存在受Elk-1调控的启动子（136 bp）。序列分析发现，该区域存在一个ets结合位点（CAGGAA）和一个CArG盒-SRF结合位点（CArG box-SRF binding site，CCATATAAAGG）。在HepG2细胞系中发现，活化的内源性的Elk-1与其协助作用因子SRF（serum response factor）能够直接与该区域结合，进而启动ZC3H12A的转录。对该区域的突变导致启动子活性降低，但并未完全消失，提示该区域中的2个NF-κB结合位点在对ZC3H12A转录的激活中，可能也起一定的作用[10]。IL-1β能够通过NF-κB通路和MAPK通路激活MCPIP 1的转录，同时，作为RNA酶，MCPIP 1能够降解IL-1β的mRNA[3]。这两方面现象说明存在一个精密的自我调控环路，即IL-1β能够调控MCPIP 1的表达，反过来MCPIP 1也能调控IL-1β mRNA的降解[10]。这说明MCPIP 1作为一个负向调节因子，能够限制促炎细胞因子IL-1β的产生，从而将炎症反应限制在一定程度内进行，避免其对机体自身的损伤。另外，IL-1β能够通过NF-κB通路激活MCPIP 1的转录[5]，同时，作为转录因子，MCPIP 1能够反过来抑制NF-κB通路的活性[1, 5]。这些事实说明体内存在一个包含MCPIP 1的精密环路，能够抑制炎症反应的程度，维护机体内环境的稳定。
对于MCPIP 1的序列分析发现，其第二个内含子中存在4个NF-κB结合位点。通过染色质免疫共沉淀实验、突变实验以及凝胶阻滞实验（EMSA）发现，IL-1β的刺激可以通过NF-κB通路激活此区域，从而增强ZC3H12A的转录。即此区域是MCPIP 1的增强子序列[5]。实验发现，多种细胞因子（LPS、IL-1β、TNFα）能够激活ZC3H12A的转录，而它们同时也是NF-κB通路的激活物，所以这些细胞因子很可能也是通过NF-κB通路激活此增强子，进而增强ZC3H12A的转录的。
因而，IL-1β能够通过多条信号转导通路，作用于ZC3H12A的启动子和增强子，从而激活MCPIP 1的转录。
MCP-1对ZC3H12A的调节
用MCP-1刺激人单核细胞来源的巨噬细胞后，检测到ZC3H12A转录本的含量升高，同时MCPIP 1蛋白质的含量也大大提高[2]。用MCP-1刺激人脐带血管内皮细胞（human umbilical
vein endothelial cells）后也得到同样结果[31]。
LPS对ZC3H12A的调节
在经LPS刺激的小鼠巨噬细胞系Raw264.7和THP-1来源的巨噬细胞中，MCPIP1的mRNA 和蛋白质水平都有显著升高[1]。这说明LPS可以诱导Zc3h12a的表达。然而，过表达MCPIP1后，LPS刺激后的巨噬细胞分泌的细胞因子（如TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1）及氮氧化物的水平却显著下降。而用siRNA干扰掉Zc3h12a基因后效果则完全相反。同时，MCPIP 1能强烈地抑制LPS诱导的TNFα及iNOS启动子及NF-κB小启动子的活性。这说明MCPIP1能显著抑制LPS的诱导效应[1]。这些现象说明LPS可以诱导MCPIP1的表达，相反，MCPIP 1的表达会抑制LPS的诱导效应。即MCPIP 1可能是LPS刺激通路上的一个负向调控因子。
TNFα对ZC3H12A的调节
在炎症细胞因子（如TNFα、IL-1β、干扰素γ）刺激下，内皮细胞（endothelial cells，ECs）会经历炎症激活过程，致使表面黏附分子表达升高，如血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）以及选择素E（E-selectin）。这导致了炎症细胞穿越血管壁被招募到炎症部位。
在经TNFα刺激的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中，MCPIP1的mRNA和蛋白质水平都有显著升高。这说明TNFα可以诱导ZC3H12A的表达。然而，过表达MCPIP1后，TNFα刺激后的HUVEC表达的黏附分子（VCAM-1）减少，同时阻止了单核细胞与内皮细胞的黏附。而干扰掉MCPIP1的表达后，结果完全相反。这说明MCPIP1能显著抑制TNFα的诱导效应。这些现象说明MCPIP 1是TNFα刺激通路上的一个负向调控因子，可以抑制细胞因子诱导的内皮细胞炎症[38]。
总结
本文较为系统地阐述了ZC3H12A基因的克隆、MCPIP 1蛋白的结构及功能，从时间的维度观其主要研究历程，以及对免疫系统的重要影响。大体上浅析了MCPIP 1从其发现至今的探索情况。基因敲除小鼠具有如此众多的与免疫系统相关的表型变化，同时，目前的研究表明，MCPIP 1具有转录因子、RNA酶、去泛素化酶等作用，其在调控基因转录、mRNA 降解、多聚泛素链的去除、细胞凋亡、细胞自噬、炎症抑制、细胞分化、血管生成等方面都有重要作用。另外，对于MCPIP 1的序列比对发现，该序列在多种物种中都存在，且高度保守。由上述的种种事实可以预见，MCPIP 1在免疫系统中应该具有至关重要的作用。
然而，目前对MCPIP 1的研究还仅限于固有免疫系统，该蛋白质在固有免疫炎症反应之外的其它作用效果及机制的研究还很少见。同时，该蛋白质的上游调控因子及相关作用机制的研究并不透彻，与该蛋白质具有相互作用的其它蛋白质、mRNA等的研究还不够明了。而且MCPIP 1在临床方面的研究并不是很多，作为如此重要的一种蛋白质，可以想见，其定会有作为临床治疗靶点的一天。总之，由于MCPIP 1是新近（2006年）刚发现的一种蛋白质，对其的研究报道目前为止还并不是多见。因而对MCPIP 1在上述这些方面的深入研究有待进行。
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转录因子Elk-1和SRF参与IL-1依赖的ZC3H12A
的表达
Aneta Kasza, Paulina Wyrzykowska, Irena Horwacik, Piotr Tymoszuk, Danuta Mizgalska, Karren Palmer, Hanna Rokita, Andrew D Sharrocks and Jolanta Jura
摘要
背景：MCPIP是一个新近发现的具有CCCH锌指结构的蛋白质，它作为RNA酶在免疫应答的调节中发挥重要的作用。然而，对于MCPIP的编码基因——ZC3H12A表达调控研究的相关报道目前还较为少见。
结果：在本文中我们发现，在初级单核细胞来源的巨噬细胞和HepG2细胞中，促炎细胞因子IL-1β能够迅速诱导MCPIP的合成。这种上调效应是通过MAP蛋白激酶通路及随后发生的转录因子Elk-1的激活而发挥作用的。通过构建带有报告基因及ZC3H12A的启动子的质粒的方法，我们发现了ZC3H12A的一个启动子区域，位于第-76位到+60位碱基对。IL-1β能够通过该启动子激活ZC3H12A的转录。这一区域含有转录因子Elk-1和SRF的结合位点。染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation）分析证明了在体内这两个转录因子都能够与ZC3H12A启动子的上述位点相结合。
结论：我们得出的结论是，转录因子Elk-1在IL-1β诱导下ZC3H12A表达激活的过程中起到重要的调节作用。
背景
MCPIP作为RNA酶，能够通过直接控制一系列炎症相关基因mRNA的稳定性，从而阻止免疫紊乱的发生[1，2]。MCPIP缺陷小鼠在12周内死于重症炎症综合征。MCPIP能够降解IL-6、IL-12p40、降血钙素受体（calcitonin receptor）和IL-1β的mRNA[1，2]。MCPIP 中的PIN结构域对于其RNA酶活性有重要作用。同时MCPIP中的CCCH锌指结构域对其RNA酶活性也有一定作用[1，2]。MCPIP最初发现于经单核细胞趋化蛋白（monocyte
chemoattractant protein，MCP-1）刺激的人外周血单核细胞中。该蛋白质因此被命名为MCP-1诱导蛋白（MCP-1 inducible protein，MCPIP）[3]。在心血管疾病的发生发展中也发现了MCPIP的抑炎效应。在缺血性心脏病中观测到MCPIP水平的升高。前不久有研究报道，Toll样受体（Toll-like receptors）在小鼠编码MCPIP的基因Zc3h12a的激活中具有重要作用。用细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）分别刺激野生型、Myd88-/-和Trif-/-小鼠的巨噬细胞，对胞内的RNA进行微阵列分析，发现Zc3h12a基因的转录被激活[1]。我们观测到，在经IL-1β刺激的单核细胞、成纤维细胞和肝癌HepG2细胞中，MCPIP转录本的含量迅速升高[2]。IL-1β是促炎细胞因子，在多种应激过程的早期就会产生。它可以多种方式作用于多种细胞。IL-1β与IL-1受体Ⅰ（IL-1RⅠ）的结合激活了TAK1激酶，最终导致了NF-κB的激活以及MAPK（即ERK、p38、JNK）的激活[4]。
MAPK能够使很多转录因子磷酸化，其中一种是三聚体因子（ternary complex factors，TCF），它属于具有ETS结构域（ETS-domain）的转录因子家族的其中一个亚家族[5]。TCF亚家族包括Elk-1、SAP-1和SAP2/ERP/Net。在靶基因的启动子上，上述蛋白质与MADS盒蛋白（MADS-box protein）、血浆反应因子（serum response factor，SRF）共同形成三聚体。所有的TCF都具有一些共同结构，如ETS结构域（能够介导TCF与DNA的结合）、B盒（B box，能够介导TCF与SRF的作用）、转录激活结构域（具有多个丝、苏氨酸磷酸化位点）、停靠结构域（docking domain，能够介导TCF与MAPK的作用）[5]。Elk-1和SAP-1是转录激活子，相反，SAP-2则是转录抑制子。TCF亚家族中转录因子磷酸化所启动的一系列事件的研究还有待深入。转录因子的磷酸化会导致构象变化，进而影响其与共激活因子（co-activators）/共抑制因子（co-repressors）的相互作用。对于Elk-1在此过程中的细节问题已经搞清。Elk-1的磷酸化导致其SUMO化（sumoylation）的逆转及随后HDAC-2的分离，从而使Elk-1脱离抑制状态（de-repression）[6]。磷酸化的Elk-1通过共激活因子（co-activator）Sur-2/Med23招募中介因子（Mediator），并与p300/CBP相作用，从而增强靶基因启动子的组氨酸乙酰化作用[7，8]。不久前有研究报道，由Elk-1的磷酸化引发的c-fos启动子组氨酸乙酰化，导致了Elk-1与另一个转录因子NFI一同作用，募集基础物质及随后的对该启动子的激活[9]。
MCPIP表达的调控机制还不甚明了。本文中我们发现，IL-1β通过激活ERK通路，进而调控MCPIP编码基因ZC3H12A的表达。同时，我们发现Elk-1和SRF也参与了此过程。结果
IL-1β通过对NF-κB 和ERK信号转导通路的激活，调控ZC3H12A的表达。
前不久我们发现，促炎细胞因子IL-1β能够通过激活NF-κB信号转导通路，使MCPIP的转录增强，mRNA含量升高[10]。为了检验在对ZC3H12A表达的调控中，是否有其它信号通路的参与，我们在NF-κB通路阻断的HepG2细胞系（mIκB cells）中，检测了MCPIP 的mRNA的合成情况。在该细胞系中，IL-1β的刺激并未导致NF-κB的激活。然而，在野生型HepG2细胞和空细胞（MOCK cells）中情况则相反（附件1，图S1）。在mIκB细胞中，IL-1β的刺激依旧能够提高MCPIP的转录水平，然而与对照组（MOCK cells）相比，其效果大大减弱。在MOCK细胞和mIκB细胞中均发现，乙酸肉豆蔻佛波醇（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）能够增强IL-1β的效应（图1A和1B，泳道2和4）。我们推测参与ZC3H12A激活过程的信号通路极有可能是MAPK通路。IL-1β能够激活p38、JNK 以及ERK蛋白激酶，而这些蛋白激酶能够使某些转录因子磷酸化[11，12]。我们选择对其中之一的ERK进行检测。为了了解ERK在ZC3H12A表达激活过程中的作用，我们选用U0126——一种已知的MEK1/2抑制剂。在经IL-1β和PMA刺激的MOCK细胞和mIκB 细胞中，U0126都能抑制ZC3H12A转录的激活（图1A和1B）。上述现象说明，除了NF-κB 通路外，ERK通路对ZC3H12A表达的激活也有重要影响。在HepG2细胞系中，ERK能被IL-1β激活，而ERK抑制剂U0126能阻断ERK的磷酸化（附件2，图S2）。
既然MCPIP在炎症反应中起到重要的调控作用，我们决定研究在IL-1β刺激的人单核来源的巨噬细胞（human monocyte-derived macrophages）中，ERK是否能够调控ZC3H12A的表达。IL-1β刺激后的巨噬细胞中，MCPIP的mRNA水平升高，且这个效应能部分地被ERK抑制剂U0126阻断（图1C）。上述现象说明，不仅在HepG2细胞系，在很多细胞中都存在IL-1β通过激活ERK信号通路，进而调控ZC3H12A的表达的现象。
图1. 人MCPIP表达的调控。A,对照组MOCK细胞以及B, mIκB细胞中NF-κB活性被阻断，这两组细胞都用IL-1β（15 ng/ml）和PMA（100 nM）处理。对于下述实验组，在IL-1β刺激前30分钟时，加入U0126（10 μM）（泳道5到8（A，B））。2小时后分离出RNA，用MCPIP cDNA（上面板）或GADPH cDNA（中面板）作为探针进行RNA印迹实验。下面板示通过蛋白质印迹实验检验在MOCK细胞和mIκB细胞中，IL-1β或抑制剂U0126的刺激对ERK的影响。用IL-1β（15 ng/ml）处理细胞30分钟（泳道2和4）。对于下述实验组，在IL-1β刺激前30分钟时，加入U0126（10 μM）（泳道3和4）。泳道1示对照组细胞裂解产物。C,用IL-1β（15 ng/ml）刺激人巨噬细胞，刺激前30分钟加或不加入U0126（10 μM）。通过实时定量定量PCR来检测ZC3H12A表达的变化。以三次独立实验的均值±标准差作为最终的结果。
转录因子Elk-1能够调控ZC3H12A启动子的活性。
ERK通路的激活导致了Elk-1的磷酸化。为了检测这个转录因子在ZC3H12A表达调控中的作用，我们进行了瞬时转染（transient transfection）试验。我们构建了抑制性Elk-1（Elk-En）或具有稳定活性的Elk-1融合蛋白（Elk-VP16）质粒，以及一个2038 bp的人ZC3H12A启动子片段（-1050 - +988）-p ZC3H12A-luc质粒。发现Elk-VP16能激活p ZC3H12A-luc，而Elk-En则相反，且它们的调控作用是剂量依赖的。这些现象与预期完全相同（附件3，图S3）。为了确定与上述调控作用相关的调控序列，我们构建了一系列ZC3H12A不同长度的启动子片段，并将它们与荧光素酶报告基因（无启动子）构建成质粒。其中，对Elk-1有
第一章蛋白质的结构与功能 一、名词解释 1. 氨基酸的等电点2、肽键3、肽单位4、蛋白质一级结构5、蛋白质二级结构6、a螺旋7、& 折叠8、超二级结构（模体） 9、结构域10、蛋白质变性11 、蛋白质复性12、蛋白质三级结构13、蛋白质四级结构14、别构 效应 二、填空题 1．组成蛋白质的氨基酸分子结构中含有羟基的有 ___________________ 、 ______________ 、 _____________ 。 2. 氨基酸在等电点（pl）时，以 ___________ 离子形式存在，在pH>pl时以__________________ 离子形式存在，在pH 蛋白质结构与功能的关系 （The relationship between protein structure and function） 摘要蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强！现而今关于蛋白质功能研究还有待发展，一门新兴学科正在发展，血清蛋白组学，生物信息学等！本文仅就蛋白质结构与其功能关系进行粗略阐述。 关键词：蛋白质结构；折叠/功能关系；蛋白质构象紊乱症；分子伴侣 Keywords：protein structure；fold／function relationship；protein conformational disorder；molecular chaperons 虽然蛋白质结构与生物功能的关系比序列与功能的关系更加紧密，但结构与功能的这种关联亦若隐若现，并不能排除折叠差别悬殊的蛋白质执行相似的功能，折叠相似的蛋白质执行差别悬殊功能的现象的存在。无奈，该领域仍不得不将100多年前Fisher提出的“锁一钥匙”模型(“lock—key”model)和50多年前Koshand提出的诱导契合模型(induce fitmodel)作为蛋白质实现功能的理论基础。这2个略显粗糙的模型只是认为蛋白质执行功能的部位局限在结构中的一个或几个小区域内，此类区域通常是蛋白质表面上的凹洞或裂隙。这种凹洞或裂隙被称为“活性部位(active site)”或“别构部位（fallosteric site）”，凹陷部位与配体分子在空间形状和静电上互补。此外，在酶的活性部位中还存在着几个作为催化基团(catalyticgroup)的氨基酸残基。对蛋白质未来的研究应从实验基本数据的归纳和统计入手，从原始的水平上发现蛋白质的潜藏机制【1】。 蛋白质结构与功能关系的研究主要是以力求刻画蛋白质的3D结构的几何学为基础的。蛋白质结构既非规则的几何形，又非完全的无规线团(randomcoil)，而是有序(α一螺旋和β一折叠)与无序(线团或环域loop)的混合体。理解蛋白质3D结构的技巧是将结构简化，只保留某种几何特征或拓扑模式，并将其数字化。探求数字中所蕴含的规律，且根据这一规律将蛋白质进行分类，再将分类的结构与蛋白质的功能进行比较，以检验蛋白质抽象结构的合理性。如果一种对蛋白质结构的简化、比较和分类能与蛋自质的功能有较好地对应关系，那么这就是一种对蛋白质结构的有价值的理解。蛋白质结构中，多种弱力(氢键、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用、堆积力等)和可逆的二硫键使多肽链折叠成特定的构象。从某种意义上说，共价键维系了蛋白质的一级结构；主链上的氢键维系了蛋白质的二级结构；而氨基酸侧链的相互作用和二硫桥维系着蛋白质的三级结构。亚基(subunit)内部的侧链相互作用是构象稳定的基础，蛋白质链之间的侧链的相互作用是亚基组装(四级结构)的基础，而蛋白质中侧链与配体基团问的相互作用是蛋白质行使功能的基础。 牛胰核糖核酸酶(RNase)变性和复性的实验是蛋白质结构与功能关系的很好例证。蛋白质空间结构遭到破坏；，可导致蛋白质的理比性质和生物学性质的变化，这就是蛋白质变性。变性的蛋白质，只要其一级结构仍然完好，可在一定条件下恢复其空间结构，随之理化性质和生物学性质也可重现，这被称为复性。RNase是由124个氨基酸残基组成的一条肽链，分子中8个半胱氨酸的巯基构成4对二硫键，进而形成具有一定空间构象的活性蛋白质。天然RNase遇尿素和β巯基乙醇时发生变性，其分子中的氢键和4个二硫键解开，严密的空间结构遭破坏，丧失了生物学活性，但一级结构完整无损。若去除尿素和β巯基乙醇，RNase又可恢复其原有构象和生物学活性。RNase分子中的8个巯基若随机排列成二硫键可有105种方式。有活性的RNase只是其中的一种，复性时之所以选择了自 蛋白质的结构具有多种结构层次，包括一级结构和空间结构，空间结构又称为构象。空间结构包括二级结构、三级结构和四级结构。在二级与三级之间还存在超二级结构和结蛋白质的二级结构 构型：指一个不对称的化合物中不对称中心上的几个原子或基团的空间排布方式。如单糖的α-、β-构型，氨基酸的D-、L-构型。当从一种构型转换成另一种构型的时候，会牵涉及共价键的形成或破坏。 构象：指一个分子结构中的一切原子绕共价单键旋转时产生的不同空间排列方式。一种构象变成另一种构象不涉及共价键的形成或破坏。 蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指多肽链的主链本身在空间的排列、或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。氢键是稳定二级结构的主要作用力。 主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角、自由回转。 二面角的概念 蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离(A) 1.3 蛋白质的结构 （1）肽链空间构象的基本结构单位为肽平面或肽单位。 肽平面是指肽链中从一个Cα原子到另一个Cα原子之间的结构，共包含6个原子（Cα、C、O、N、H、 Cα），它们在空间共处于同一个平面。 （2）肽键上的原子呈反式构型 C=O与N-H p204 （3）肽键C-N键长0.132nm,比一般的C-N单键(0.147nm)短，比C=N双键(0.128nm)要长，具有部分双键的性质，不能旋转。 （二）蛋白质的构象 蛋白质多肽链空间折叠的限制因素：Pauling和Corey在利用X-射线衍射技术研究多肽链结构时发现： 1.肽键具有部分双键性质： 2.肽键不能自由旋转 3.组成肽键的四个原子和与之相连的两个α碳原子（Cα）都处于同一个平面内，此刚性结构的平 面叫肽平面（peptide plane）或酰胺平面（amide plane）。 4.二面角所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中，非键合原子之间的接近有无阻碍。 1.α-螺旋及结构特点p207 螺旋的结构通常用“S N”来表示，S表示螺旋每旋转一圈所含的残基数，N表示形成氢键的C=O与H-N原子之间在主链上包含的原子数。又称为3.613螺旋，Φ= -57。，Ψ= -47。结构要点： 1.多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含 3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm; 2.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢 形成氢键。 3.蛋白质中的α-螺旋几乎都是右手螺旋。 无规卷曲或自由回转（nonregular coil） p212 了解 指无一定规律的松散盘曲的肽链结构。 酶的功能部位常包含此构象，灵活易变。 纤维状蛋白 (了解) 纤维状蛋白质(fibrous protein)广泛地分布于脊椎和无脊椎动物体内，它是动物体的基本支架和外表保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。 这类蛋白质外形呈纤维状或细棒状，分子轴比(长轴／短轴)大于10(小于10的为球状蛋白质)。分子是有规则的线型结构，这与其多肽链的有规则二级结构有关，而有规则的线型二级结构是它们的氨基酸顺序的规则性反映。 纤维状蛋白质的类型(了解) 纤维状蛋白质可分为不溶性(硬蛋白)和可溶性两类，前者有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等； 后者有肌球蛋白和纤维蛋白原等，但不包括微管(microtubule)和肌动蛋白细丝(actin filament)，它们是球状蛋白质的长向聚集体(aggregate)。 角蛋白 Keratin(了解) 角蛋白广泛存在于动物的皮肤及皮肤的衍生物，如毛发、甲、角、鳞和羽等，属于结构蛋白。角蛋白中主要的是α-角蛋白。 α-角蛋白主要由α-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手α-螺旋肽链形成一个原纤维（向左缠绕），原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性 例如毛的纤维是由多个原纤维平行排列，并由氢键和二硫键作为交联键将它们聚集成不溶性的蛋白质。 α-角蛋白的伸缩性能很好，当α-角蛋白被过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时α-角蛋白转变成β-折叠结构，称为β-角蛋白。 毛发的结构(了解) 第一章蛋白质的结构与功能 内容提要 蛋白质是重要的生物大分子物质，体内分布广，含量丰富，种类繁多。每种蛋白质都有特定的空间构象及生物学功能。 组成蛋白质的基本单位为氨基酸，共20种，除甘氨酸外均为L–α–氨基酸。氨基酸为两性电解质，在溶液的pH等于其pI时氨基酸呈兼性离子。含有共轭双键的色氨酸、酪氨酸在280nm波长附近有最大吸收峰。氨基酸之间通过肽键相连而成肽。肽键是蛋白质分子中的主要共价键也称为主键。小于10个氨基酸组成的肽为寡肽，大于10个氨基酸为多肽，其为链状称为多肽链。多肽链是蛋白质的基本结构，两端分别称为氨基末端（N－末端），羧基末端（C－末端）。 蛋白质的结构分为一级、二级、三级和四级结构。多肽链从氨基末端至羧基末端的氨基酸排列顺序为蛋白质的一级结构，其连接键为肽键，还有二硫键。 二级、三级及四级结构为空间结构（高级结构）。肽键中的六个原子基本上位于同一平面，称为肽单元。蛋白质的主链局部空间构象（而不涉及氨基酸侧链）称为蛋白质的二级结构，主要形式有α－螺旋、β－折叠、β－转角及无规卷曲，以氢键维持其稳定性。两个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互邻近形成的特殊空间构象，称为模体。蛋白质的三级结构是指多肽链主链和侧链的全部原子的空间排布位置。其稳定性维持主要靠次级键。分子量大的蛋白质三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠的较为紧密，各执行其功能，称为结构域。亚基与亚基间通过非共价键结合所形成的空间结构为四级结构。 蛋白质也具有两性解离性质，体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0。所以在人体体液pH7.4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。蛋白质是生物大分子之一，其颗粒表面的电荷和水化膜是维持蛋白质胶体稳定的重要因素。若除去蛋白质胶体表面电荷和水化膜，蛋白质极易从溶液中下沉析出。一般认为，蛋白质变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变。蛋白质在280nm波长处有特征性吸收峰。 蛋白质的结构与其功能密切相关，一级结构是空间结构的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间结构及功能也相近。若蛋白质的一级结构发生改变则影响其正常功能，由此引起的疾病称为分子病。 多肽链正确折叠对其形成正确构象和功能的发挥具有重要意义。除一级结构是决定蛋白质折叠成正确空间构象的因素外，还需分子伴侣的参与。若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生，有人将此类疾病称为蛋白构象疾病。 分离、纯化蛋白质是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。常用的技术有电泳法、层析法、超速离心法等。 蛋白质结构与功能的关系 蛋白质的结构包括一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。 一级结构是蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。 蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架本身在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。常见的二级结构有α螺旋、三股螺旋、β折叠、β转角、β凸起和无规卷曲。α螺旋中肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展，它可能是极性的、疏水的或两亲的。β折叠是肽链的一种相当伸展的结构，有平行和反平行两种。如果β股交替出现极性残基和非极性残基，那么就可以形成两亲的β折叠。β转角指伸展的肽链形成180°的U形回折结构而改变了肽链的方向。β凸起是由于β折叠股中额外插入一个氨基酸残基而形成的，它也能改变多肽链的走向。无规卷曲是在蛋白质分子中的一些极不规则的二级结构的总称。无规卷曲无固定走向，有时以环的形式存在，但不是任意变动的。从结构的稳定性上看，右手α螺旋＞β折叠＞ U型回折＞无规卷曲，但在功能上，酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当，α右手螺旋和β折叠一般只起支持作用。 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。三级结构通常由模体和结构域组成。稳定三级结构的化学键包括氢键、疏水键、离子键、范德华力、金属配位键和二硫键。模体可用在一级结构上，特指具有特殊生化功能的序列模体，也可被用于功能模体或结构模体，相当于超二级结构。结构模体是结构域的组分，基本形式有αα、βαβ和βββ等。常见的模体包括：左手超螺旋、右手超螺旋、卷曲螺旋、螺旋束、α螺旋-环-α螺旋、Rossmann卷曲和希腊钥匙模体。结构域是在一个蛋白质分子内的相对独立的球状结构和/或功能模块，由若干个结构模体组成的相对独立的球形结构单位，它们通常是独自折叠形成的，与蛋白质的功能直接相关。一个结构域通常由一段连续的氨基酸序列组成。根据其占优势的二级结构元件的类型，结构域可分为五大类：α结构域、β结构域、α/β结构域、α+β 结构域、交联结构域。以上每一类结构域的二级结构元件可能有不同的组织方式，每一种组织就是一种结构模体。这些结构域都有疏水的核心，疏水核心是结构域稳定所必需的。 具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。组成寡聚蛋白质或多聚蛋白质的每一个亚基都有自己的三级结构。蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。驱动四级结构形成或稳定四级结构的作用力包括 第一章蛋白质的结构与 一、名词解释 1.氨基酸的等电点2、肽键3、肽单位4、蛋白质一级结构5、蛋白质二级结构6、a螺旋7、性折叠8、超二级结构 （模体）9、结构域10、蛋白质变性11、蛋白质复性12、蛋白质三级结构13、蛋白质四级结构14、别构效应 二、填空题 1．组成蛋白质的氨基酸分子结构中含有羟基的有___________________ 、______________ 、______________ 。 2.____________________________________ 氨基酸在等电点（pl）时，以_________________ 离子形式存在，在pH>pl时以____________________________________________ 离子形式存在，在pHvpl 时，以_______________ 离子形式存在。 3.组成蛋白质的氨基酸中，含有咪唑环的氨基酸是___________________ ，含硫的氨基酸有 _______________ 和 4.蛋白质具有两性电离性质，大多数蛋白质在酸性溶液中带____________________ 电荷，在碱性溶液中带_______________ 电荷。当蛋白质处在某一pH 溶液中时，它所带正负电荷数相等，此时的蛋白质成为 _________________ ，该溶液的pH 称为 蛋白质的______________ 。 5.蛋白质二级结构的形式主要有_________________ 、______________ 、 ____________ 和_______________ 。 6.蛋白质中的________________ 、____________ 和______________ 3种氨基酸具有______________ 特性，因而使蛋白 质在280nm 处有最大吸收值。 7.a螺旋结构是由同一肽链的________________ 和_______________ 间的_______________ 键维持的，螺距为 ，每圈螺旋含个氨基酸残基，每个氨基酸残基沿轴上升高度为。天然蛋白质分子中的a螺旋大都属于手螺旋。 8.球状蛋白质中有_______________ 侧链的氨基酸残基常位于分子表面而与水结合，而有 _________________ 侧链的氨基酸残基位于分子的内部。 9.维持蛋白质的一级结构的化学键有_________________ 和_______________ ；维持二级结构靠________________ ；维持三级 结构和四级结构靠_______________ 键，其中包括______________ 、______________ 、_____________ 和 ________________________________ 。 10. ________________________________________________________________________________________ 谷氨 酸的pK i（a COOH）= 2.19，pK2 （^NH a+）= 9.67，pg （R）= 4.25，谷氨酸的等电点为 _________________________ 。11. ________________________________________________________ 一个a螺旋片段含有180个氨基酸残基，该片段中有__________________________________________________________________ 圈螺旋，该a螺旋片段的轴长为 12.可以按蛋白质的相对分子质量、电荷及构象分离蛋白质的方法是____________________ 。 13. ___________________________________________ 血红蛋白（Hb）与氧结合的过程呈现效应，是通过Hb的实现的。 14.组成蛋白质的氨基酸中侧链pK 接近中性的氨基酸是 __________________ 。无游离（自由）氨基的氨基酸是 15. _______________________________________________ 在蛋白质分子中，一个氨基酸的a碳原子上的与另一个氨基酸a碳原子上的____________________________________________ 脱去一分子水 形成的键叫___________ ，它是蛋白质分子中的基本结构键。 16.丝氨酸侧链特征基团是______________ ；半胱氨酸的侧链基团是 ______________ ；组氨酸的侧链基团是 。 17.蛋白质颗粒表面的_____________ 和_____________ 是蛋白质亲水胶体稳定的两个因素。 18.氨基酸的结构通式为______________________ 。 19.在生理pH 条件下，蛋白质分子中， ______________ 和____________ 氨基酸残基的侧链几乎完全带负电，而 __________ 和___________ 氨基酸残基侧链完全荷正电，而______________ 的侧链则部分带正电荷（假设该蛋白质含有这些氨基酸组分） 20.两条相当伸展的肽链（或同一条肽链的两个伸展的片段）之间形成氢键的结构单元称为____________ 。 21.用电泳方法分离蛋白质的原理是在一定的pH 条件下，不同蛋白质的 _________________ 、____________ 和____________ 举例说明蛋白质结构和功能的关系 答： 1.蛋白质的一级结构与功能的关系 蛋白质的一级机构指：肽链中氨基酸残基（包括二硫键的位置）的排列顺序。一级结构是蛋白质空间机构的基础，包含分子所有的信息，且决定蛋白质高级结构与功能。 ①一级结构的变异与分子病 蛋白质一级结构是空间结构的基础，与蛋白质的功能密切相关，一级机构的改变，往往引起蛋白质功能的改变。 例如：镰刀形细胞贫血病 镰刀形细胞贫血病的血红蛋白（HbS）与正常人的血红蛋白（HbA）相比，发现，两种血红蛋白的差异仅仅来源于一个肽段的位置发生了变化，这个差异肽段是位于β链N端的一个八肽。在这个八肽中，β链N端第6位氨基酸发生了置换，HbA中的带电荷的谷氨酸残基在HbS中被置换成了非极性缬氨酸残基，即蛋白质的一级机构发生了变化。 ②序列的同源性 不同生物中执行相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白质的一级机构具有相似性，称为序列的同源性。最为典型的例子， 例如：细胞色素C（Cyt c） Cyt c是古老的蛋白质，是线粒体电子传递链中的组分，存在于从细菌到人的所有需氧生物中。通过比较Cyt c的序列可以反映不同种属生物的进化关系。亲缘越近的物种，Cyt c中氨基酸残基的差异越小。如人与黑猩猩的Cyt c完全一致，人与绵羊的Cyt c有10个残基不同，与植物之间相差更多。蛋白质的进化反映了生物的进化。 2.蛋白质空间结构与功能的关系 天然状态下，蛋白质的多肽链紧密折叠形成蛋白质特定的空间结构，称为蛋白质的天然构象或三维构象。三维构象与蛋白质的功能密切相关。 ①一级结构与高级结构的关系： 一级结构决定高级机构，当特定构象存在时，蛋白质表现出生物功能；当特定构象被破坏时，即使一级构象没有发生改变，蛋白质的生物学活性丧失。例如：牛胰核糖核苷酸酶A（RNase A）的变性与复性 当RNase A处于天然构象是，具有催化活性； 当RNase A处于去折叠状态时，二硫键被还原不具有催化活性；当RNase A恢复天然构象时，二硫键重新形成，活性恢复。 ②变构效应 变构效应：是寡聚蛋白质分子中亚基之间存在相互作用，这种相互作用通过亚基构象的改变来实现。蛋白质在执行功能是时，构象发生一定变化。 例如：肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合 两种蛋白质有很多相同之处，结构相似表现出相似功能。这两钟蛋白质都含有血红素 辅基，都能与氧进行可逆结合，因此存在着氧合与脱氧的两种结构形式。但是肌红蛋白几乎在任何氧分压情况下都保持对氧分子的高亲和性。血红蛋白则不同，在氧分压较高时，血红蛋白几乎被氧完全饱和；而在氧分压较低时，血红蛋白与氧的亲和力降低，释放出携带的氧并转移给肌红蛋白。 生物化学名词解释 第一章蛋白质 1.amino acid：An organic acid with an α-carbon atom linked to a carboxylic acid, an amino group, a hydrogen atom, and a side chain (the R group). Twenty different amino acids are the building blocks of proteins. 2.peptide bond： A covalent linkage formed between the α-carboxyl group of one amino acid and the α- amino group of another. Also known as an amide bond. 3.peptide: Two or more amino acids covalently joined by peptide bonds. 4.polypeptide: A long chain of amino acids linked by peptide bonds; the molecular weight is generally less than 10,000. 5.Configuration. The spatial arrangement in which atoms are covalently linked in a molecule. 6.Conformation. The spatial arrangement of atoms in a protein is called its conformation. 7.primary structure ：In a polymer, the sequence of amino acids and any interchain and intrachain disulfide bonds of a protein. This sequence is specified by genetic information. 8.secondary structure：The localized conformation of a protein. As the polypeptide chain folds, it forms certain localized arrangements of adjacent amino acids . 9.peptide unit: The six atoms of the peptide group (Cα1、C、O、N、H、Cα2) lie in a single plane, with the oxygen atom of the carbonyl group and the hydrogen atom of the amide nitrogen trans to each other. 10.T ertiary structure ：The overall three-dimensional conformation of a protein in its native folded state. 11.The molecular chaperones are large, multisubunit proteins that accelerate the folding process by providing a protected environment where polypeptides fold into native conformations and form quaternary structures. 12.quaternary structure：In proteins containing more than one polypeptide chain, the spatial arrangements of those chains (subunits) and the nature of contacts among them. 13.subunit: The independently three-dimensional structure in a protein with quaternary structure. 14.allosteric effect：an effect that a small molecule, called an effector, noncovalently binds to a protein and alters its activity. 15.Bohr effect : increase in the concentration of H+ and Pco2 reduces oxygen affinity to hemoglobin 16.isoelectric point of protein: The pH at which a protein solute has no net electric charge and thus does not move in an electric field. 17.denaturation of protein : Many physical and chemical reagents (urea or SDS, etc.) that break noncovalent bonds disrupt secondary, tertiary, and quaternary structure of protein with attendant loss of biologic activity. 第２０卷第６期２００８年６月 化 学进展 ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ０１．２０Ｎｏ．６Ｊｕｎｅ，２００８ 蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析＊ 仇晓燕１’２ 崔 勐１ （１．中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心 刘志强１ 刘淑莹Ｈ‘ 长春１３００２２；２．中国科学院研究生院 北京１０００３９） 摘 要 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰，对稳定蛋白质的空间结构，保持及调节其生物活性有 着非常重要的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。在众多实验方法中，现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。本文介绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展。 关键词 二硫键定位质谱串联质谱三羧乙基膦稳定同位素标记 中图分类号：０６５７．６３；Ｑ５１ 文献标识码：Ａ文章编号：１００５．２８１Ｘ（２００８）０６．０９７５—０９ ＰｒｏｔｅｉｎＤｉｓｕｌｆｉｄｅＢｏｎｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｑｉｕ Ｘｉａｏｙａｎｌ＇２ ＣｕｉＭｅｎ９１Ｌｉｕ劢ｉｑｉａｎ９１ＬｉｕＳｈｕ乒ｎ９１‘‘ （１．ＣｈａｎｇｃｈｕｎＣｅｎｔｅｒｏｆＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ） ＡｂｓｔｒａｃｔＤｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓ 蛋白质结构与功能 一级要求单选题 1 组成蛋白质的氨基酸基本上有多少种 A 300 B 30 C 20 D 10 E 5 C 2 蛋白质元素组成的特点是含有的16%相对恒定量的是什么元素 A C B N C H D O E S B 3 组成蛋白质的氨基酸之间分子结构的不同在于其 A Cα B Cα-H C Cα-COOH D Cα-R E Cα-NH2 D 4 氨基酸的平均分子量是 A 1000 B 500 C 110 D 100 E 80 C 5 组成蛋白质的酸性氨基酸有几种 A 2 B 3 C 5 D 10 E 20 A 6 组成蛋白质的碱性氨基酸有几种 A 2 B 3 C 5 D 10 E 20 B 7 组成蛋白质中的含巯基氨基酸是 A 酪氨酸 B 缬氨酸 C 谷氨酸 D 胱氨酸 E 半胱氨酸 E 8 蛋白质分子中属于亚氨基酸的是 A 脯氨酸 B 甘氨酸 C 丙氨酸 D 组氨酸 E 天冬氨酸 A 9 组成蛋白质的氨基酸在自然界存在什么差异 A 种族差异 B 个体差异 C 组织差异 D 器官差异 E 无差异 E 10 体内蛋白质分子中的胱氨酸是由什么氨基酸转变生成 A 谷氨酸 B 精氨酸 C 组氨酸 D 半胱氨酸 E 丙氨酸 D 11 精氨酸与赖氨酸属于哪一类氨基酸 A 酸性 B 碱性 C 中性极性 D 中性非极性 E 芳香族 B 12 下列那种氨基酸无遗传密码子编码 A 谷氨酰氨 B 天冬酰胺 C 对羟苯丙氨酸 D 异亮氨酸 E 羟脯氨酸 E 13 氨基酸间脱水的产物首先产生小分子化合物为 A 蛋白质 B 肽 C 核酸 D 多糖 E 脂肪 B 14 人体内的肽大多是 A 开链 B 环状 C 分支 D 多末端 E 单末端链,余为环状 A 15 谷胱甘肽是由几个氨基酸残基组成的小肽 A 2 B 3 C 9 D 10 E 39 B 16 氨基酸排列顺序属于蛋白质的几级结构 1.蛋白质的二级结构主要有哪些类型，其特点如何？ 答：α-右手螺旋，β-折叠，无规卷曲，U型回折（β-转角） <1>α-右手螺旋 α-螺旋为右手螺旋，每一圈含有3.6个aa残基（或肽平面），每一圈高5.4?，即每一个aa 残基上升1.5?，旋转了100度，直径为5 ?，2个二面角（ф,ψ）＝（-570，-480）。维持α-右手螺旋的力量是螺旋内氢键，它产生于一个肽平面的C=O与相邻一圈的在空间上邻近的另一个肽平面的N-H之间，它的方向平行于螺旋轴，每个氢键串起的长度为3.6个肽平面或3.6个aa残基，被氢键串起来的这个环上含有13个原子，故α-右手螺旋也被称为 3.613螺旋。Pro破坏α-螺旋。 <2>β-折叠 肽链在空间的走向为锯齿折叠状，二面角（ф,ψ）＝（-119℃，+113℃）。维持β-折叠的力量是折叠间的氢键，它产生于一个肽平面的C=O与相邻肽链的在空间上邻近的另一个肽平面的N-H之间，两条肽链上的肽平面互相平行，有平行式和反平行式两种， <3>U型回折：也叫β-转角，肽链在某处回折1800所形成的结构。这个结构包括的长度为 4个aa残基，其中的第三个为Gly，稳定该结构的力量是第一和第四个aa残基之间形成的氢键。 <4>无规卷曲：无固定的走向，但也不是任意变动的，它的2个二面角（ф,ψ）有个变化 范围。论 述 04 蛋 白 质 简述蛋白质一级结构的分析方法。 第一步：前期准备，第二步：肽链的端点测定，第三步：每条肽链aa顺序的测定，第四步：二硫键位置的确定。 <1>第一步：前期准备 分离纯化蛋白质：纯度要达到97％以上。 蛋白质分子量的测定：用于判断分子的大小，估计肽链的数目，有渗透压法、凝胶电泳法（聚丙烯酰胺、SDS）、凝胶过滤法、超离心法等 aa组成的测定：用于最后核对，氨基酸自动分析仪。 肽链拆分：非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种，可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。共价键的仅二硫键1种，可用巯基乙醇、碘代乙酸、过甲酸来拆分。 <2>第二步：肽链的端点测定 N端测定：Sanger法，DNFB→DNP-肽→水解→乙醚萃取→层析鉴定。 Edman法，PITC→PTC-肽→PTH-aa→层析鉴定。 C端测定：肼解法。 <3>第三步：每条肽链aa顺序的测定 事先要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽，再上机分析，而且要2套以上，便于以后拼接。 常用的工具酶和特异性试剂有： 胰蛋白酶：－（Arg、Lys）↓－。产物为C端Arg、Lys的肽链。 糜蛋白酶：表示为－（Trp、Tyr、Phe）↓－。 CNBr：－Met↓－。 <4>第四步：二硫键位置的确定 包括链内和链间二硫键的位置，用对角线电泳来测，这项工作在AA序测定完毕后进行。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开。再用巯基乙醇处理，将二硫键打断。最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品（多肽或寡肽），它们就是含二硫键的片段，上机测aa顺序，根据已测出的蛋白质的aa顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。 第二章蛋白质的结构与功能 复习测试 （一）名词解释 1. 肽键 2. 结构域 3. 蛋白质的等电点 4. 蛋白质的沉淀 5. 蛋白质的凝固 （二）选择题 A型题： 1. 天然蛋白质中不存在的氨基酸是： A. 胱氨酸 B. 谷氨酸 C. 瓜氨酸 D. 蛋氨酸 E. 丝氨酸 2. 下列哪种氨基酸为非编码氨基酸： A. 半胱氨酸 B. 组氨酸 C. 鸟氨酸 D. 丝氨酸 E. 亮氨酸 3. 下列氨基酸中哪种氨基酸无 L型与D型氨基酸之分： A. 丙氨酸 B. 甘氨酸 C. 亮氨酸 D. 丝氨酸 E. 缬氨酸 4. 天然蛋白质中有遗传密码的氨基酸有： A. 8种 B. 61种 C. 12种 D. 20种 E. 64种 5. 测定100克生物样品中氮含量是2克，该样品中蛋白质含量大约为： A. 6.25% B. 12.5% C. 1% D. 2% E. 20% 6. 蛋白质分子中的肽键： A. 是一个氨基酸的α-氨基和另一个氨基酸的α-羧基形成的 B. 是由谷氨酸的γ-羧基与另一个氨基酸的α-氨基形成的 C. 氨基酸的各种氨基和各种羧基均可形成肽键 D. 是由赖氨酸的ε-氨基与另一分子氨基酸的α-羧基形成的 E. 以上都不是 7. 多肽链中主链骨架的组成是 A. –CNCCNCNCCNCNCCNC- B. –CCHNOCCHNOCCHNOC- C. –CCONHCCONHCCONHC- D. -CCNOHCCNOHCCNOHC- E. -CCHNOCCHNOCCHNOC- 8. 蛋白质的一级结构是指下面的哪一种情况： A. 氨基酸种类的数量 B. 分子中的各种化学键 C. 多肽链的形态和大小 D. 氨基酸残基的排列顺序 E. 分子中的共价键 9. 维持蛋白质分子一级结构的主要化学键是： A. 盐键 B. 氢键 C. 疏水键 D. 二硫键 E. 肽键 10. 蛋白质分子中α-螺旋构象的特点是： A. 肽键平面充分伸展 B. 靠盐键维持稳定 C. 螺旋方向与长轴垂直 D. 多为左手螺旋 E. 以上都不是 11. 下列哪种结构不属于蛋白质二级结构： A. α-螺旋 B. 双螺旋 C. β-片层 D. β-转角 E. 不规则卷曲 蛋白质结构与功能的关系 摘要：蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的，各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。天然蛋白质的构象一旦发生变化，必然会影响到它的生物活性。由于蛋白质的构象的变化引起蛋白质功能变化，可能导致蛋白质构象紊乱症，当然也能引起生物体对环境的适应性增强！现而今关于蛋白质功能研究还有待发展，一门新兴学科正在发展，血清蛋白组学，生物信息学等！本文仅就蛋白质结构与其功能关系进行粗略阐述。 关键词：蛋白质分子一级结构、空间结构、折叠/功能关系、蛋白质构象紊乱症；分子伴侣正文： 1、蛋白质分子一级结构和功能的关系 蛋白质分子中关键活性部位氨基酸残基的改变，会影响其生理功能，甚至造成分子病(molecular disease)。例如镰状细胞贫血，就是由于血红蛋白分子中两个β亚基第6位正常的谷氨酸变异成了缬氨酸，从酸性氨基酸换成了中性支链氨基酸，降低了血红蛋白在红细胞中的溶解度，使它在红细胞中随血流至氧分压低的外周毛细血管时，容易凝聚并沉淀析出，从而造成红细胞破裂溶血和运氧功能的低下。 另一方面，在蛋白质结构和功能关系中，一些非关键部位氨基酸残基的改变或缺失，则不会影响蛋白质的生物活性。例如人、猪、牛、羊等哺乳动物胰岛素分子A链中8、9、10位和B链30位的氨基酸残基各不相同，有种族差异，但这并不影响它们都具有降低生物体血糖浓度的共同生理功能。 蛋白质一级结构与功能间的关系十分复杂。不同生物中具有相似生理功能的蛋白质或同一种生物体内具有相似功能的蛋白质，其一级结构往往相似，但也有时可相差很大。如催化DNA 复制的DNA聚合酶，细菌的和小鼠的就相差很大，具有明显的种族差异，可见生命现象十分复杂多样。 2、蛋白质分子空间结构和功能的关系 蛋白质分子空间结构和其性质及生理功能的关系也十分密切。不同的蛋白质，正因为具有不同的空间结构，因此具有不同的理化性质和生理功能。如指甲和毛发中的角蛋白，分子中含有大量的α-螺旋二级结构，因此性质稳定坚韧又富有弹性，这是和角蛋白的保护功能分不开的;而胶原蛋白的三股π螺旋平行再几股拧成缆绳样胶原微纤维结构，使其性质稳定而具有强大的抗张力作用 又如细胞质膜上一些蛋白质是离子通道，就是因为在其多肽链中的一些α-螺旋或β-折叠二级结构中，一侧多由亲水性氨基酸组成，而另一侧却多由疏水性氨基酸组成，因此是具有“两亲性”(amphipathic)的特点，几段α-螺旋或β-折叠的亲水侧之间就构成了离子通道，而其疏水侧，即通过疏水键将离子通道蛋白质固定在细胞质膜上。载脂蛋白也具有两亲性，既能与血浆中脂类结合，又使之溶解在血液中进行脂类的运输。 3、折叠/功能关系 体内各种蛋白质都有特殊的生理功能，这与空间构象有着密切的关系。肌红蛋门和血红蛋白是阐述空间结构与功能关系的典型例子。肌红蛋门(Mb))和血红蛋白(Hb)都是含血红素辅基的结合蛋白质。Mb有一条肽链，经盘曲折折叠形成三级结构，整条肽链由A~H8段α螺旋盘曲折叠成为球状，疏水氨基酸侧链在分子内部，亲水氨基酸侧链在分子外部，形成亲水的球状蛋白，血红素辅基位于Mb分子内部的袋状空穴中。Hb有四条肽链，两条β链也有与Mb 相似的A~H8段α螺旋，有两条α链只有7段α螺旋。Hb与Mb的折叠方式相似，也都能与氧进行可逆的结合。Hb的一个亚基与氧结合后可引起构象变化，是另一个亚基更易于与氧结合，这种带氧的亚基协助不带氧的亚基去结合氧的现象称为协同效应。氧与Hb结合后可蛋白质结构与功能的关系94592
蛋白质的二级结构
1 蛋白质结构和功能 作业
蛋白质结构与功能的关系
蛋白质的结构与功能习题
以多种蛋白为例阐述蛋白质结构与功能的关系
名词解释 第一章 蛋白质的结构与功能
蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析解析
2-蛋白质结构与功能
蛋白质的二级结构主要有哪些类型
第1章 蛋白质结构与功能习题
蛋白质的结构和功能的关系
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