中国农业科学2008,41(8):2537-2545
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.08.046 柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究
陈力，王中康，黄冠军，曹月青，夏玉先，殷幼平
（重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市基因功能及调控技术重点实验室，重庆400030）
摘要：【目的】筛选鉴定柑橘溃疡病菌拮抗菌，研究其培养特性及拮抗物质的初步性质，为柑橘溃疡病的生物制剂研制奠定基础。【方法】利用对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌具有良好抑制作用的生防菌，并通过对菌株形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析鉴定其分类地位；以单因素试验和正交设计方法对影响CQBS03菌株抑菌活性物质产生的各种培养条件进行优化；利用硫酸铵沉淀获得抑菌物质粗提物并测定其对温度、蛋白酶及氯仿的敏感性。【结果】经鉴定CQBS03为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。CQBS03抑菌活性成分主要存在于培养液中，能被80%饱和度硫酸铵沉淀，最高可耐受的温度范围为60～70℃；活性成分在280 nm 处有最大吸收峰，分子量大于10 kD，对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定，而对氯仿部分敏感。培养特性研究表明，CQBS03最适培养基为YPG 液体培养基，抑菌物质产生的最适培养条件为：pH 8.0左右，28℃培养72 h。【结论】枯草芽孢杆菌CQBS03所产生的抑菌物质主要成分是蛋白质，且属于外泌型蛋白；该抑菌蛋白对多种植物病原菌有抑菌作用，尤其对柑橘溃疡病菌抑菌活性高，稳定性好，是一株极具开发潜力的生防菌株。
关键词：枯草芽孢杆菌；拮抗细菌；生物防治；柑橘溃疡病；抑菌蛋白
Evaluation of Bacillus subtilis Strain CQBS03 Against
Xanthomonas axonopodis pv. citri
CHEN Li, WANG Zhong-kang, HUANG Guan-jun, CAO Yue-qing, XIA Yu-xian, YIN You-ping
(The Key Laboratory of Gene Function and Regulation of Chongqing Municipal Education Commission, The Bioengineering College
of Chongqing University, Chongqing 400030)
Abstract: 【Objective】Citrus bacterial canker caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri ( Xac.) is one of the most important plant diseases. The aims of the experiment are at screening higher activities antibacterial strain to control this disease, and studing the antibacterial substance characteristics.【Method】The bacterial strain CQBS03 was isolated from microorganism flora of citrus leaf surface. The strain was identified based on the bacteriological characteristics and the 16S rDNA sequence. The culture conditions of CQBS03 strain were optimized by single factor and orthogonal experiment. Crude antibacterial substance was obtained by ammonium sulfate from fermented liquid of the CQBS03 strain, and the thermal stable, optimum reactive temperature and pH were tested. 【Result】The strain was identified as Bacillus subtilis. The antibacterial activity substance from CQBS03 could designate as one kind of protein based on the large molecular weight (more than 10 kD), unstable at higher temperature (60℃ to 70℃), partly sensitive to chloroform, stable to proteinase K and trypsin. The optimal culture conditions of the bacteria for the antibacterial protein producing are pH 8.0, 28℃in yeast peptone glucose liquid medium with shaking for 72 h. 【Conclusion】Antibacterial substance excreted by Bacillus subtilis CQBS03is antibacterial protein. It has high activity to Xac. The CQBS03 strain can be developed as a promising bio-control bacterium strain.
Key words: Bacillus subtilis; Antagonistic bacteria; Biocontrol; Xanthomonas axonopodis pv. citri; Antibacterial protein
收稿日期：2006-12-22；接受日期：2007-03-04
基金项目：农业部，农作物病虫害疫情监测与防治（农植保字[2006]第003号）
作者简介：陈力（1979-），男，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向为资源微生物学。E-mail：clli2006@https://www.doczj.com/doc/448541751.html,。通讯作者殷幼平（1955-），女，重庆人，教授，研究方向为生物资源研究。Tel：023-********；E-mail：ypy128@https://www.doczj.com/doc/448541751.html,
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0 引言
【研究意义】柑橘溃疡病是国内外柑橘生产上的重要病害，其病原菌为地毯草黄单胞柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri，Xac），是国内外重大检疫性有害生物。在美国、巴西、澳大利亚、中国等大多数国家和地区的非疫区，对外来入侵的柑橘溃疡病一般采用挖树烧毁法根除，该病给这些国家和地区的经济造成重大损失[1,2]。而在病区，人们采取化学防治为主、农业防治为辅的综合防治策略控制病菌危害。但化学保护法也只能在一定程度上降低发病率，而且病原菌会对一些药物产生耐药性。同时大部分使用的化学农药会在柑橘果实上残留且对环境有一定的污染。而用生物防治方法由于采用自然界本身存在的生物或其产物，对环境友好，而且生防制剂的毒性普遍也较低，不易在果实上残留，因而受到人们的广泛关注。【前人研究进展】关于柑橘溃疡病拮抗微生物方面的研究国内外虽有不少报道，但尚处于探索阶段[1,3~5]。已知对柑橘溃疡病菌有拮抗作用的微生物有草生欧氏杆菌[Erwinia herbicola（Lohnis）Dye 1964，268]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn 1872，174]、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula 1895，29）和丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae van Hall 1902，141）以及腐生的Xanthomonas spp.[1,3,5]。在国内，周吉奎等[4]报道了K-2与K-8 两种细菌在温室和大田防治试验中对柑橘溃疡病表现出良好的防治效果，但未确定这两种细菌的分类地位。谭小艳等[5]从柑橘园土壤中分离筛选到1株对柑橘溃疡病菌具有抑制作用的鲍氏不动杆菌Bt8，研究了温度、pH及培养基等因素对该菌株的抑菌效果的影响以及在温室条件下菌悬浮液对柑橘叶片上病斑的抑制效果，但对Bt8菌株的抑菌活性成分没有进一步研究。【本研究切入点】广泛分布于各种微生态环境的芽孢杆菌，因具有抗逆性强的内生芽孢，在土壤和植物表面普遍存在，它能产生抗生素、抗菌蛋白等活性物质，可以通过竞争、拮抗作用、诱导植物抗性等方式控制病害[6]，是一类重要的生防细菌。目前国内外尚无关于柑橘溃疡病生防菌枯草芽孢杆菌拮抗物质方面的报道。【拟解决的关键问题】本研究从柑橘植株叶面分离到的一株具有广谱拮抗作用的细菌菌株CQBS03，对该菌株的分类地位、生理生化特性以及菌株的抑菌谱等进行较为详细的研究，并对该菌对柑橘溃疡病菌的拮抗作用及其活性物质进行初步探讨，将为确定该菌株的抑菌机制和生防菌剂开发及其应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌株来源与培养基
菌株CQBS03，分离自柑橘叶面，经分离纯化后保存于重庆大学基因工程中心。CQBS03菌的活化培养基为LB固体培养基[7]。液体培养采用YPG培养基（培养基配方为：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0），28℃振荡培养。1.2 供试的其它菌株与培养
柑橘溃疡病菌（Xac01）和参试的其它植物病原微生物包括柑橘绿霉（Penicillium digitatum）、柑橘青霉（P.italicum）、柑橘炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柑橘芽枝霉（Cladosporium herbarum）和玉米青枯菌（Fusarium oxysporum）均由重庆大学基因工程研究中心提供。以上菌株在PDA培养基上28℃培养供试。
1.3 拮抗菌株CQBS03的抑菌活性测定
采用改良的纸碟法[7]测定CQBS03菌抑菌谱：配制PDA平板，在冷凝平板上分别加入100 μl活化待测靶标菌悬液（Xac01、青霉、绿霉、柑橘炭疽菌、玉米青枯病菌和柑橘芽枝霉菌），涂抹分散[7]均匀制成待测平板。在每个平板上均匀放置3个各加有10 μl CQBS03菌悬液的6 mm滤纸片，28～30℃培养，每处理设3次重复，同时用无菌水代替靶标菌菌悬液作为对照（CK）。分别在培养24、48和72 h时对CQBS03菌株产生的抑菌圈进行观察，测量记载抑菌圈大小，以评价其对参试靶标病原菌的抑制作用。
1.4 菌株CQBS03鉴定
菌株的形态学和生理生化性状分析按照常规细菌学方法[8~11]进行。
对菌株CQBS03的16S rDNA序列鉴定方法如下：将活化的CQBS03接种在LB平板上，28℃培养过夜，采用细菌单菌落直接PCR扩增法，扩增制备细菌DNA。
PCR扩增采用细菌通用引物[9]，序列为：Primer1（F27）：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，Primer 2（R1492）：5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μl，MgCl22 μl （25 mmol·L-1），dNTPs Mixture（各10 mmol·L-1）0.5 μl，Primer 1和Primer 2各1 μl（10 μmol·L-1），DNA Polymerase（5 U·μl-1）0.2 μl，Template 1 μl，dd H2 O 16.8
8期陈力等：柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究2539
μl，总体积25 μl。
PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。
反应结束后，取5 μl反应液用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，委托上海英骏生物技术公司进行双向序列测定。将测定结果与数据库信息比对分析，结合菌落菌体形态及生化测定确定生防菌株种类。
1.5 CQBS03培养特性研究
1.5.1 培养液配方筛选分别配制玉米粉（玉米粉30 g，蒸馏水1 000 ml）、PDA、YPD（酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0）、LB、YPG液体培养基，按5%比例将CQBS03分别接种在各培养液中，恒温振荡培养（250 r/min，28℃），连续培养72 h，取培养液离心（10 000 r/min，15 min），取上清液按1.3所述抑菌圈法测试抑菌活性，确定产抑菌活性物质的最佳培养基。
1.5.2 影响CQBS03菌株抑菌活性物产生的培养条件初步筛选
1.5.
2.1 培养基pH值粗筛将筛选确定的YPG培养基分别调至
3.0、6.0和9.0等3个不同起始pH值，按5%比例接种CQBS03，在28℃、250 r/min振荡培养72 h。培养液离心，取上清液按1.3所述方法测定抑菌活性。
1.5.
2.2 发酵温度粗筛CQBS03菌株分别接种于YPG培养基，在25℃、30℃、35℃下250 r/min振荡培养72 h后培养液离心，取上清液测定抑菌活性。
1.5.
2.3 装液量（溶解氧）粗筛在1 000 ml三角瓶中，分别加入200、400、600 ml 的YPG培养基，经28℃、250 r/min恒温振荡培养72 h。分别对培养液离心所获上清液按1.3所述方法测定抑菌活性。
1.5.
2.4 不同发酵时间粗筛分别在选定的最适培养基和培养条件下，在发酵24、48、72、96 h时分别取10 ml发酵液，离心后将上清液按1.3所述方法测定抑菌活性，以确定抑菌物质产生的高峰期。
1.5.3 多因子最适培养条件确定在初步确定各种单因子对抑菌活性影响的基础上，选择培养温度、培养液pH和装液量3个主要影响因子，每个因子设定3个不同处理水平进行正交试验，以确定CQBS03在多因子相互作用下的最适培养条件和培养特性。
1.6 拮抗菌株抑菌活性物质的初步纯化及活性测定
接种活化的CQBS03菌至100 ml的1/4 SDA液体培养基中，摇瓶按上述条件振荡培养过夜作为种子液。次日取种子液按5%比例接种到400 ml YPG液体培养基中发酵，继续振荡培养72 h。取发酵液，10 000 r/min 离心15 min，分别取上清液和菌体细胞经下列方法处理后进行抑菌活性测定，每个处理3次重复。
上清液：用80%饱和度硫酸铵进行盐析分离，将盐析离心后所得沉淀以原培养液体积1/20的50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）重新溶解，透析脱盐，获得抑菌活性物质粗提液。按1.3所述方法制备柑橘溃疡病菌平板，将粗提液10 μl滴加在滤纸片上放于平板上，28℃培养箱内培养48 h后观察其对Xac01的抑制作用，测量记载其抑菌圈直径。
菌体细胞：将分离获得的CQBS03菌体部分（沉淀）用液氮充分研磨后，加入原培养液1/20体积的50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）悬浮，按上述方法将悬浮液滴加于滤纸片上，测定悬浮液对Xac01的抑制作用，测量并记载各处理抑菌圈直径。
1.7 CQBS03抑菌活性成分性质测定
1.7.1 抑菌活性成分耐热性测定取上述具有抑菌活性的粗提液，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、100℃温度下水浴处理30 min，以未处理的粗提液作为对照。按1.3所述抑菌圈法测定抑菌活性。每处理设3个重复，以测定菌株CQBS03抑菌活性成分对温度的耐受性。
1.7.2 抗菌物质对蛋白酶K、胰蛋白酶敏感性的测定将抑菌活性粗提液分别与0.5 mg·ml-1蛋白酶K、胰蛋白酶溶液混合，在37℃水浴孵育30 min后以上述方法检测其抑菌活性，每处理设3个重复,以未加蛋白酶的活性粗提液为对照。
1.7.3 抗菌物质对氯仿敏感性的测定活性粗提液与等量氯仿混合振荡抽提60 min，离心，分层后取上层水相。待残留氯仿挥发后，按1.3所述方法检测其抑菌活性，以测定氯仿对抑菌活性物质的影响。
1.7.4 抗菌物质分子量范围粗测用截留分子量 3 kD和10 kD的超滤管对粗提液进行超滤，分别对得到的截留液和滤过液按1.3所述抑菌圈法测定抑菌活性，观察并分析抑菌效果。
2 结果与分析
2.1 菌株CQBS03的分类鉴定
2.1.1 CQBS03的形态学特征CQBS03在LB培养基上培养后，菌落呈圆形，隆起，表面皱褶，不透明，灰白色；在液体静止培养时有菌膜形成。CQBS03细胞呈直杆状，0.7 μm×2.3 μm，能运动，革兰氏染色
2540 中国农业科学41卷
阳性，有芽孢，芽孢呈椭圆形近中生，为典型的芽孢杆菌（图1～图3）。
图1 CQBS03菌体形态
Fig. 1 Cell morphology of CQBS03 strain
图2 CQBS03菌株芽孢形态
Fig. 2 Spores conformation of CQBS03 strain
2.1.2 CQBS03生理生化特征CQBS03的生理生化特征如表1所示，结果表明，CQBS03与枯草芽孢杆菌的特征一致。
图3 CQBS03菌落形态
Fig. 3 Colonial morphology of CQBS03 strain
2.1.3 CQBS03菌株的16S rDNA序列测定与分析利用细菌16S rDNA通用引物，挑取单菌落直接进行PCR扩增，获得CQBS03 1.5 kb的DNA片段（图4），凝胶回收纯化后，将PCR产物直接送上海博亚进行DNA双向测序。测序结果经GenBank的BLASTn比对，CQBS03 16S rDNA序列与Bacillus subtilis的序列同源性达到99%。因此依据16S rDNA序列同源性，并结合CQBS03菌株的细胞形态、培养性状、理化特征等综合分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
2.2 CQBS03菌株的抑菌作用及抑菌谱
纸碟法测定CQBS03菌抑菌谱，72 h后观察，可见CQBS03菌株对柑橘溃疡病菌（Xac01）有良好的拮抗效果，其抑菌圈直径能达到25 mm（图5）；对供试的柑橘青霉、柑橘绿霉以及玉米青枯病菌也有一定的抑制菌丝生长和产孢的生物活性（表2）。
通过对不同植物病原菌的抑菌圈进行观察，发现绿霉平板上CQBS03周围的抑菌圈内，培养基比较透
表1 菌株生理生化特征
Table 1 Physiological and biochemical characters of the CQBS03 strain
“+”表示阳性；“-”表示阴性。“+”: Positive; “-”: Negative
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S：PCR产物；B：阴性对照；M：Marker
S: PCR product; B: Negative control; M: Marker
图4 CQBS03菌株16S rDNA扩增片段
Fig. 4 Amplification of the DNA fragment of CQBS03 strain
表2 CQBS03菌株对不同病原菌的抑菌活性
Table 2 Inhibitory activity of CQBS03 to different plant pathogenic bacteria
病原菌Pathogen
培养时间及抑菌圈直径
Time of treatment and inhibitory activity (mm) 24 h48 h72 h
柑橘青霉P.italicum 1.0Cd 18.0Bb 19.0Bb 柑橘绿霉Penicillium digitatum 2.0Bc 28.0Aa 29.0Aa 柑橘炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 2.5ABb 2.5Dd 2.5Dd 柑橘芽枝霉Cladosporium herbarum 1.0Cd 2.0Dd 3.0Dd 玉米青枯病菌Fusarium oxysporum 3.0Aa 8.5Cc 9.0Cc CK 0.0De 0.0Ee 0.0Ee
数据后的小写字母表示差异显著（P＜0.05），不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。下同
The small letters following the data showing great difference at 0.05 and capital letters significant difference at 0.01. The same as below
图5 CQBS03菌株对Xac01的抑菌圈（φ90 mm）
Fig. 5 Inhibitory zones of CQBS03 on Xac01
明，几乎观察不到菌丝和绿霉孢子（图6）。在青霉平板上，培养48 h后，抑菌圈内虽然也较透明，但圈内明显存在一些青霉菌丝，还有部分青霉孢子存在。在72 h观察时，虽然抑菌圈还可用肉眼观察到，但是抑菌圈内已经密布青霉菌丝和孢子（图7）。后续观察表明，CQBS03菌对绿霉具有较长期的抑菌效果，而对青霉的拮抗作用随时间延长逐渐减弱，直至基本消失。CQBS03对玉米青枯病菌也有一定的抑制作用，而对柑橘炭疽菌和柑橘芽枝霉基本没有抑制作用。
图6 CQBS03菌株对绿霉的抑菌圈（72 h）
Fig. 6 Inhibitory zones of CQBS03 on green mold (after 72 h)
图7 CQBS03菌株对青霉的抑菌圈（72 h）（φ90 mm）Fig. 7 Inhibitory effect of CQBS03 on blue mold (after 72 h)
2.3 CQBS03的抑菌活性成分性质分析
2.3.1 抑菌活性成分的来源将CQBS03菌株摇瓶培养后分别测定培养细胞内物质和除细胞培养液抑菌活性发现，培养48、72 h时的CQBS03菌体细胞内容物对Xac01的抑制作用极小（图8）。主要的抑菌活性成分在除菌培养液中，因此认为CQBS03菌株的抑菌活性物质主要为胞外分泌。
2.3.2 抑菌活性物质的粗提去细胞培养液经硫酸铵沉淀后，分别测定沉淀物重新悬浮液（粗提液）和上清部分对靶标菌Xac01的抑菌效果，发现在培养72 h后，蛋白沉淀后的上清部分几乎看不出抑菌效果，
2542 中国农业科学41卷
1：48 h培养物（抑菌圈2.5 mm）；2：72 h培养物（抑菌圈2 mm）；3：CK（抑菌圈0 mm）
1: Diameter of inhibitory zone incubated with homogenization of bacteria cells after 48h culturing (about 2.5 mm); 2: Diameter of inhibitory zone incubated with homogenization of bacteria cells after 72h culturing (2 mm); 3: Control (without inhibitory zone)
图8 CQBS03菌株胞内成分对Xac01的抑菌圈
Fig. 8 Inhibitory activity of the homogenization of CQBS03 cell to Xac01
而粗提液有强烈的抑菌作用，对Xac01的抑菌圈约为16 mm×15 mm（图9）。证明CQBS03菌株抑菌活性成分能被硫酸铵沉淀，可能为蛋白质类物质。
图9 培养粗提液对Xac01的抑菌作用
Fig. 9 Inhibitory zone of the crude extract of CQBS03 culture supernate on Xac01
2.3.3 抑菌活性成分的特性分析将培养粗提液经不同温度处理后加入柑橘溃疡病菌培养液进行抑菌测定，经过72 h 28℃培养后，结果如图10所示。粗提液中活性成分在经过60℃及以下温度30 min处理后仍能保持100%的抑菌活力，而70℃处理后失去了约80%的抑菌作用，100℃处理后完全失活。
测定活性成分对蛋白酶K、胰蛋白酶、氯仿敏感性发现，CQBS03抑菌活性成分对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定，处理前后其抑菌活性基本没有变化；而对氯仿部分敏感，处理后其抑菌活性为处理前的71%。
抑菌活性成分分子量范围测定显示，3 kD和
10 图10 不同温度处理对CQBS03抑菌粗提物抑制作用的影响Fig. 10 Effect of temperature on the inhibition activities of the antibacterial substance on Xac01
kD的超滤膜均能有效截留活性成分分子，二者的截留成分抑菌效果相当（抑菌圈13 mm），而二者的滤过液都未显出抑菌活性，因此可知该抗菌物质分子量应大于10 kD。
2.4 CQBS03菌株的培养特性和主要培养参数
2.4.1 不同培养基对抑菌活性物质产生的影响不同培养基成分发酵培养对抑菌活性物质的产生影响很大。5种不同培养基摇瓶培养后的去细胞培养液对Xac01的抑菌测定表明，PDB、YPG培养的CQBS03粗提物的抑菌圈最大（表3），说明PDB、YPG培养基更适合CQBS03菌株抗菌物质的产生与分泌。
表3 不同培养基对抑菌圈的影响
Table 3 Impact of different culture medium on inhibitory activities
培养基
Medium
抑菌圈直径
Diameter of inhibitory zone (mm)
24 h48 h72 h
玉米粉Corn meal medium 1.5Dd 2.5Dd 3.0Cd
PDB 8.0Aa 10.0Aa 11.0Ab
YPD 3.0Cc 6.5Bb 7.0Bc
LB 3.0Cc 5.0Cc 7.0Bc
YPG 6.0bB 10.0Aa 12.0Aa
2.4.2 CQBS03 的生长曲线及抑菌活性物质的产生曲线由图11可以看出，菌株CQBS03在培养24 h内，菌量呈对数增长，到40 h左右生物产量达最大值，OD600的吸收值出现最高峰。而培养72 h的发酵液对Xac01菌有最强的抑制作用，72 h以后发酵液的抑菌活性开始下降，这说明抑菌活性物质的产生延后于菌体的对数增长期。培养40 h以后虽然CQBS03的生长
8期陈力等：柑橘溃疡病生防菌株CQBS03的鉴定及其培养特性研究2543
衰退，菌体逐步死亡，但是抑菌活性产物的量还处于一个积累的过程。因此，CQBS03菌株产抑菌活性物质的最适培养时间为72 h。
图11 CQBS03生长曲线及抑菌活性成分产生曲线
Fig. 11 The growth curve of CQBS03 and the curve of produced inhibitory activity
2.4.3 pH、温度和装液量对CQBS03菌株抑菌活性物质产量的影响不同初始pH培养基对抑菌物质的产生有明显的影响。当pH为3时，菌体生长极为缓慢。当pH为6和9时，菌体生长明显加快，产生抑菌物质的量也与此一致。这说明该菌适合在中性偏碱的条件下生长。
CQBS03菌株在25℃、30℃、35℃的条件下培养均能很好生长，以30℃的生长率最高，产生的抑菌物质也最多。
不同装液量直接影响培养液中的溶氧，当装液量为200 ml/1 000 ml和400 ml/1 000 ml时，发酵液抑菌活性基本一致；而当装液量为600 ml/1 000 ml时其菌体产量明显降低，培养液的抑菌活性也随之下降。
基于以上初步试验结果设计了对CQBS03菌株的培养温度、培养基pH值和培养基通气量3个主要影响因子3水平的正交试验，结果如表4、表5。
从方差分析结果得出，ABC 3个因子在选定条件下对培养结果没有显著差异。根据极差分析确定最优试验方案及水平为C1A1B3，即CQBS03菌株的最佳发酵条件应为：培养温度28℃、培养基的pH为8.0、摇瓶装液量1/5体积，这样可以达到抑菌物质的最佳积累。考虑到生产效率和成本因素，可以采用C3A1B3，即培养温度28℃、培养基的pH为8.0、摇瓶装液量2/5体积。
表4 主要培养条件参数 L9（34）正交表Table 4 The result of orthogonal experiment
试验号Test number
试验因素Test factor 蛋白吸光度(A280)
Protein absorbency 温度(A)
Temperature
初始pH (B)
pH value
装液量(C)
Volume of medium
空白
Blank
1 1(28℃) 1(6) 1(200 ml/1000 ml) 1 0.490
2 1(28℃) 2(7) 2(600 ml/1000 ml) 2 0.329
3 1(28℃) 3(8) 3(400 ml/1000 ml) 3 0.444
4 2(30℃) 1(6) 2(600 ml/1000 ml) 3 0.327
5 2(30℃) 2(7) 3(400 ml/1000 ml) 1 0.387
6 2(30℃) 3(8) 1(200 ml/1000 ml) 2 0.439
7 3(32℃) 1(6) 3(400 ml/1000 ml) 2 0.319
8 3(32℃) 2(7) 1(200 ml/1000 ml) 3 0.338
9 3(32℃) 3(8) 2(600 ml/1000 ml) 1 0.289 K1 1.263 1.136 1.267 1.166
K2 1.153 1.054 0.945 1.087
K3 0.946 1.172 1.150 1.109
k1 0.421 0.379 0.422 0.389
k2 0.384 0.351 0.315 0.362
k3 0.315 0.391 0.383 0.370
2544 中国农业科学41卷
表5 方差分析结果
Table 5 The result of variance analysis
方差来源Variance analysis
偏差平方和
Sum of standard deviation S
自由度
Degree of freedom f
均方平方和
Sum of mean square V
F值
F test
A 0.0173 2 0.00864 15
B 0.0024 2 0.00122 2
C 0.0177 2 0.00886 16 误差Error 0.0011 2 0.00055
总和Summation 0.0385 8
F0.10(2, 2)=9.00 , F0.05(2, 2)=19.00 , F0.01(2, 2)=99.00
3 讨论
国内外关于芽孢杆菌拮抗菌株防治植物病原真菌和细菌的报道较多，其中枯草芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌等能产生抗生素、抗菌蛋白或抗微生物多肽等活性物质，通过竞争、拮抗作用、诱导植物抗性等方式抑制多种植物病原微生物[6,12~20]。但国内利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为柑橘溃疡病菌生防菌的研究还很少，尤其对抑菌活性物质的研究还未见报道。本研究确定了枯草芽孢杆菌CQBS03对柑橘溃疡病菌的抑菌活性成分是蛋白质，而且对其主要性质进行了初步研究；测定了菌株的抑菌谱，发酵及活性蛋白产生的培养条件。这对于该菌活性成分的进一步分离纯化，研究分析其抑菌机理，构建生防工程菌及进一步开发利用该菌株奠定了良好的基础。但要使其真正成为柑橘溃疡病的生物制剂尚有很长的路要走。
4 结论
枯草芽孢杆菌CQBS03菌株不仅对柑橘溃疡病细菌有明显的抑制作用，而且对柑橘绿霉等植物病原真菌也有很好的拮抗作用。其抑菌蛋白活性强，对蛋白酶不敏感，对温度耐受性较好；菌株有较宽的适生温区和pH范围，其芽孢对外界的不良环境抵抗力强，易于在柑橘叶片表面定殖，可以对柑橘溃疡病菌起到持续控制作用，是一株极具有开发应用前景的生防菌株。
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（责任编辑赵利辉，毕京翠）