骨骼肌卫星细胞的研究现状
阎振鑫S111666（四川大学生命科学学院细胞生物学专业成都）
摘要：肌卫星细胞是目前公认的骨骼肌干细胞，负责骨骼肌生长和损伤修复。干细胞研究
成为医学研究领域的热点，肌卫星细胞移植成为治疗骨骼肌损伤萎缩和心肌坏死的新的治疗方案，具有广阔的前景。肌卫星细胞的体外培养中大多采用胰酶胶原酶两步消化法得到细胞悬液。在原代培养中最关键的是细胞的纯化。防止成纤维细胞的污染，主要是采用查速铁壁的方法将细胞分离。胰岛素多肽家簇、MyoD转录因子家族和MEF2家族等对肌肉的形成起重要的调控作用。
关键词：骨骼肌卫星细胞体外培养干细胞移植
肌卫星细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生的储备力量，负责骨骼肌的生长和损伤修复。因此,肌卫星细胞特有的成肌能力倍受重视[1-4]。目前，干细胞研究成为医学领域研究的热点，肌肉干细胞因直接参与分化骨骼肌而受世人关注。胚胎和成体内都存在肌肉干细胞，成人体内存在两类具有干细胞样特性的细胞，一类称为卫星细胞(Satellite Cells，SC)也叫成肌祖细胞(Myogenic Progenitor Cell，MPC)，另一类称为肌源干细胞(Muscle Derived Stem Cell，MDSC)，也叫群旁细胞(Side Population S，SP)，后者在数量上远少于前者。目前公认的肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞[5]。
近年来，国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中，可改善肌肉功能[6]。组织缺损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、危害性大、花费高的问题之一。近年来随着组织工程技术的发展，应用肌组织工程技术，进行骨骼肌再生代替以往的手术方法修复动力性瘫痪，以其特有的优点避免了以往手术的缺陷，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。另外，骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长[7-10]。现就肌卫星细胞的研究现状作一综述。
1肌卫星细胞的体外培养
1961年Mauro首先发现了肌卫星细胞，并推测肌卫星细胞实质上是一种处于休眠状态下的成肌细胞[11]，是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工程技术的种子细胞，它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究，取得了显著的成果[ 12 ]。培养肌卫星细胞的材料来源，目前多数取自兔、鼠、犬、鸡等的肌肉组织，人体肌卫星细胞的培养已有报道，培养方法多采用胰酶、胶原酶分步消化，分离出单个成肌细胞，通过差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞，再进行单层细胞培养。在这些步骤中纯化卫星细胞防止纤维细胞的污染是关键，在这个步骤中较好的做法是：采用PrePlate差速贴壁法进行细胞纯化，去除杂质细胞的污染。将细胞接种于明胶包被的培养瓶中培养2h，贴壁细胞为P1P；未贴壁细胞悬液转皿培养12h，贴壁的细胞为P1P2；未贴壁细胞悬液再转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P3，未贴壁细胞悬液转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P4；再次将未贴壁的细胞悬液转皿培养24小时，贴壁的细胞为P1P5。P1P5培养3d后换液，以后隔天换液1次，倒置显微镜下观察，
待细胞生长至70%汇合度后传代培养。
骨骼肌卫星细胞属于组织干细胞，其体外培养的优点是取材方便，产量大，具有较强的增殖分化能力，营养条件好,如培养基中加入15 %～20 %的动物血清(即生长培养基)，成肌细胞以分裂、增殖为主。一旦成肌细胞长满整个培养瓶，相互接触时，增殖将明显受到抑制，表现为相邻成肌细胞相互融合，形成肌小管，表现出分化倾向。降低培养液中营养条件，如动物血清不超过5 %(即融合培养基)，能明显促进分化，使单位数目的成肌细胞形成肌小管的百分比增加。因此骨骼肌卫星细胞在肌组织工程研究中具有广阔的应用前景[13]，临床应用奠定了良好的基础。
2 调控肌卫星细胞发育的相关基因及各因子
胰岛素样生长因子(IGFs)属胰岛素多肽家簇，主要包括IGF-1和IGF-2两种，分别由70和67个氨基酸组成，结构上有62 %相同,据文献报道肌肉损伤后15 h可见再生骨骼肌细胞和肌卫星细胞表达IGF-1。IGF-1和IGF-2在发育骨骼肌中高水平表达，但在成熟骨骼肌水平很低[14]。睫状神经营养因子(CNTF)是一种具有神经营养功能的酸性蛋白质，近年来的研究发现它对肌肉也有营养作用,其作用途径可分为两个方面：一方面通过对肌肉的直接营养作用维持正常骨骼肌的形态和功能，参与神经肌肉损伤的修复。坐骨神经损伤后，大量的CNTF被释放，同时骨骼肌睫状神经营养因子受体α亚单位(CNTFRα)的表达量增加数十倍，这种CNTF和CNTFRα的协同作用可能在神经肌肉损伤修复中具有重要作用。另一方面CNTF能改善去神经所致的骨骼肌萎缩和继发性功能丧失，现已有人开展了用CNTF防止骨骼肌去神经性萎缩的药效动力学研究。
MyoD转录因子家族对于肌形成是必须的[15]，作为成肌调节因子(MRF)家族四成员(MyoD、MRF5、myogenin、MRF4)之一，肌分化因子(MyoD)不仅可促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化,，且能把许多种类型细胞(如成纤维细胞、脂肪细胞等)转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维。在肌形成肌肉特异基因转录调控中MyoD起着总开关的作用，可以结合到肌细胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用，促进它们的转录激活。MyoD基因家族成员以肌肉特异性基因转录激活物的形式发挥作用[16]，它们具有bHLH结构域, 与肌肉特异性基因调控区常见的顺式作用元件E-box结合。
MEF2(myocyte enhancer - bingding factor2) 家族的4个成员MEF2A - D的表达有助于肌肉特异性基因的激活[17 ]，它们与MyoD基因家族成员具有正协同作用。目前在小鼠中已经证实，myogenin中含有MEF2转录因子的结合位点，MyoD家族的其它成员中尚未见相关报道。目前有两种机制来解释MEF2转录因子的作用模式: MEF2 通过其转录激活结构域直接与肌肉特异性基因启动子或增强子结合，MEF2可能作为生肌作用的一种强制性辅助因子(cofactor)与MyoD/ E12 杂和二聚体发生相互作用[18 ,1 9 ]。
图1 MyoD基因家族成员与其它因子的相互作用[20]
3 肌卫星细胞移植对骨骼肌及心肌再生的作用
Koh等[21]1993年首次报道了将卫星细胞C2C12系成功移植到正常小鼠心脏，并观察形成具有骨骼肌细胞特征的多核肌管，从此掀开了骨骼肌卫星细胞移植治疗心梗的新篇章。由于卫星细胞可以从病人自身获得，此研究在临床上具有广阔的应用前景。肌卫星细胞作为一种治疗心肌梗死的供体细胞具有较多的优点，包括在体外有增殖能力，在缺血组织内仍然能够成活，能够进行自体移植等，但其标记问题一直是困绕人们的难题之一，尤其是超微结构研究方面。但目前在供体细胞的选择、标记追踪方面存在很多的分歧，治疗机制也不十分清楚[22-23]。
长期失神经支配的骨骼肌，肌卫星细胞含量下降，肌细胞核数量也下降，肌纤维变性坏死。当神经再支配时，由于肌卫星细胞耗竭，肌细胞再生能力下降，影响了骨骼肌功能的恢复。因此，增加骨骼肌中的肌卫星细胞能够促进肌纤维的再生，可提高神经修复手术的疗效。由于近年来对肌卫星细胞成肌规律的进一步了解，骨骼肌再生修复动力性瘫痪的研究受到了医学工作者们的重视并已取得了瞩目的进展，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。
4 肌组织工程的应用前景
肌卫星细胞作为肌组织工程的种子细胞来修复瘫痪肌肉，以恢复肌肉动力的功能有广阔的前景和实用价值。目前，肌卫星细胞与Ⅰ型胶原凝胶复合研究较多，Ⅰ型胶原能促进肌卫星细胞贴壁，而且在体外能很好地促进肌卫星细胞分化，使肌卫星细胞融合的百分比增加。目前研究较多的是肌卫星细胞的体外培养及增殖，将该细胞移植到体内的成肌效应目前研究甚少。因为肌组织工程技术距临床应用还有很大的差距，所以还需大量的研究工作来完善肌组织工程技术，为临床应用打下坚实的理论与实验基础。
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骨骼肌卫星细胞的研究现状 阎振鑫S111666（四川大学生命科学学院细胞生物学专业成都） 摘要：肌卫星细胞是目前公认的骨骼肌干细胞，负责骨骼肌生长和损伤修复。干细胞研究 成为医学研究领域的热点，肌卫星细胞移植成为治疗骨骼肌损伤萎缩和心肌坏死的新的治疗方案，具有广阔的前景。肌卫星细胞的体外培养中大多采用胰酶胶原酶两步消化法得到细胞悬液。在原代培养中最关键的是细胞的纯化。防止成纤维细胞的污染，主要是采用查速铁壁的方法将细胞分离。胰岛素多肽家簇、MyoD转录因子家族和MEF2家族等对肌肉的形成起重要的调控作用。 关键词：骨骼肌卫星细胞体外培养干细胞移植 肌卫星细胞是小的单核梭形细胞，是源于胚胎中胚层的干细胞，在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生的储备力量，负责骨骼肌的生长和损伤修复。因此,肌卫星细胞特有的成肌能力倍受重视[1-4]。目前，干细胞研究成为医学领域研究的热点，肌肉干细胞因直接参与分化骨骼肌而受世人关注。胚胎和成体内都存在肌肉干细胞，成人体内存在两类具有干细胞样特性的细胞，一类称为卫星细胞(Satellite Cells，SC)也叫成肌祖细胞(Myogenic Progenitor Cell，MPC)，另一类称为肌源干细胞(Muscle Derived Stem Cell，MDSC)，也叫群旁细胞(Side Population S，SP)，后者在数量上远少于前者。目前公认的肌肉干细胞主要是指肌肉卫星细胞[5]。 近年来，国外有报道将肌卫星细胞移植到冻伤的骨骼肌中，可改善肌肉功能[6]。组织缺损或器官功能障碍是人类保健中发生频繁、危害性大、花费高的问题之一。近年来随着组织工程技术的发展，应用肌组织工程技术，进行骨骼肌再生代替以往的手术方法修复动力性瘫痪，以其特有的优点避免了以往手术的缺陷，为瘫痪肌肉的动力修复开创了一个崭新的研究前景。另外，骨骼肌可能会通过分泌低分子量细胞因子即骨骼肌源性抑瘤物显著抑制肿瘤细胞生长[7-10]。现就肌卫星细胞的研究现状作一综述。 1肌卫星细胞的体外培养 1961年Mauro首先发现了肌卫星细胞，并推测肌卫星细胞实质上是一种处于休眠状态下的成肌细胞[11]，是肌细胞核的一种来源。肌卫星细胞作为肌组织工程技术的种子细胞，它的体外培养、鉴定及生物学特性已有大量实验研究，取得了显著的成果[ 12 ]。培养肌卫星细胞的材料来源，目前多数取自兔、鼠、犬、鸡等的肌肉组织，人体肌卫星细胞的培养已有报道，培养方法多采用胰酶、胶原酶分步消化，分离出单个成肌细胞，通过差速贴壁法去除混杂的成纤维细胞，再进行单层细胞培养。在这些步骤中纯化卫星细胞防止纤维细胞的污染是关键，在这个步骤中较好的做法是：采用PrePlate差速贴壁法进行细胞纯化，去除杂质细胞的污染。将细胞接种于明胶包被的培养瓶中培养2h，贴壁细胞为P1P；未贴壁细胞悬液转皿培养12h，贴壁的细胞为P1P2；未贴壁细胞悬液再转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P3，未贴壁细胞悬液转皿培养24h，贴壁的细胞为P1P4；再次将未贴壁的细胞悬液转皿培养24小时，贴壁的细胞为P1P5。P1P5培养3d后换液，以后隔天换液1次，倒置显微镜下观察，
肌肉卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。它们在一般情况下是处于静息状态的，当被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。在那里它们通过形成与肌肉纤维融合的先驱细胞来对损伤做出反应。有研究报告说，它们能充当干细胞，但卫星细胞群的混合性质意味着，它们的干细胞身份难以证明。” “最新一期Nature刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果：研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新，从而澄清了相关问题。他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中，发现它能够大量增殖，有助于肌肉纤维的形成，而且可以被再次移植。因此断定肌肉卫星细胞也是一种干细胞。” 肌肉中肌肉卫星细胞非常多。我们在进行性肌营养不良的肌肉病变中很容易发现大量的由卫星细胞分化而来的再生细胞。然而，这些干细胞中缺乏、缺损某些膜蛋白基因。因此，即使发生再生，也只能再生膜功能缺损肌纤维，免不了肌纤维变性坏死的命运。 我们实验室的研究重点是，如何保护膜蛋白缺损的肌纤维，而不是通过基因治疗，如何根治肌营养不良。因为目前世界上哪一个实验室也做不到这一点，某些研究成果，即使在动物身上似乎有效，但人身上还是没有得到证实。 在肌肉修复功能 当肌肉细胞进行损伤，静止卫星细胞从基底膜下方的释放。他们被激活，并重新进入细胞周期。这些分裂的细胞被称为“过境放大池”前接受生肌分化，形成新的肌管（有丝分裂后）。也有证据表明这些细胞能够与现有的肌纤维融合，促进生长和修复。 肌肉再生的过程，涉及相当大的重塑细胞外基质，并发生了广泛的破坏，是不完整的的。肌肉存款瘢痕组织成纤维细胞内，这可能削弱肌肉的功能，是一个的重要组成部分肌营养不良症的病理。 卫星细胞增殖肌肉损伤（西尔，等，2003），并形成新的肌纤维，通过对胎儿肌肉的发育（帕克等人，2003年）的过程类似。经过多次细胞分裂，卫星细胞开始与周边核保险丝损坏的肌管，并进行进一步的分化和成熟，作为标志（帕克等，2003）。 IGF - 1所描述的第一个角色之一是其在卫星细胞的增殖和分化的参与。此外，骨骼肌中IGF - 1的表达能力扩展激活卫星细胞的增殖（Charkravarthy，等，2000），增加和延长beneficaleffects老化的肌肉。 评述：Mourkioti和Rosenthal（2005），免疫学的发展趋势，第26卷，第1 号霍克和加里（2001），应用生理学杂志，19卷，第534-551 可塑性和治疗中的应用卫星细胞在体外或体内最小的刺激后，将经历一个生肌分化。
第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 V ol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March ，2014 收稿日期：2013-12-19 基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs 的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项 目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600） 作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail: aq19881209@https://www.doczj.com/doc/4611494327.html,。 文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定 代阳1 ，王轶敏 1，2 ，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬 1，通信作者 （1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨凌 712100） 摘 要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化， 并利用RT -PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT -PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。 关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定 中图分类号：Q813.1 文献标识码：A Isolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells DAI Yang 1 , WANG Yi-min 1,2 , LIU Xin-feng 1, F AN Han-lu 1, LI Ji-xia 1, GUO Hong 1, DING Xiang-bin 1,Corresponding Author (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Bioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaa n xi Province, China ) Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD ). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG ) and myosin heavy chain (MHC )showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated. Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification 骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通 常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1] ，在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形 成骨骼肌细胞。1961年，Mauro [2] 首次在蛙的肌肉中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而 肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响[3] ，目前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。本研究采用胶原酶和胰蛋白酶联用的酶消化法从小鼠肌肉组织中分离肌卫星细胞，并对其进行了诱导分化和鉴定，以期为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供参考。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 10日龄昆明小鼠，体重约3.2 g。 1.1.2 主要试剂 胎牛血清（Gibco）；马血清（Gibco）；DMEM 高糖培养基（Hyclone）；胶原酶Ⅱ（Sigma）；0.25%胰蛋白酶溶液（索来宝）；青链霉素混合液（10 000 m g /L青霉素、10 000 m g/L链霉素，索莱宝）；PBS （自配）；4%多聚甲醛、山羊封闭血清、羊抗兔Cy3标记二抗、羊抗兔FITC标记二抗、羊抗小鼠FITC 标记二抗（武汉博士德）；DAPI、兔抗Pax7抗体、兔抗MyoD抗体、兔抗MyoG抗体（北京博奥森）；鼠抗Myosin抗体（中杉金桥）；TRIzol试剂（Invitrogen）；
骨骼肌细胞的超微结构特点 肌肉和肌纤维周围均包有结缔组织，按其位置不同分为肌外膜、肌束膜和肌内膜。 包在整块肌肉外面的致密结缔组织，称肌外膜。 若干条肌纤维集成束，束的外周包有较厚的结缔组织，称肌束膜。 分布在每条肌纤维周围的少量结缔组织，称肌内膜。 骨骼肌纤维表面附有肌卫星细胞，肌纤维损伤后肌卫星细胞分化形成肌纤维。 （一）骨骼肌纤维的光镜结构 骨骼肌纤维呈长圆柱形，一条肌纤维内含多个细胞核，核呈扁椭圆形，位于肌膜下方； 肌浆内含大量肌原纤维，每条肌原纤维上都有明暗相间的横纹，后者由明带和暗带组成明带又称Ι带，其中部为Z线 暗带又称A带，其中部较浅的窄带称H带，H带中央为M线 * 肌节（sarcomere）为两条相邻Z线之间的一段肌原纤维，由?I带+A带+?I带组成；是骨骼肌收缩的基本结构单位 肌膜外有基膜紧贴，肌膜与基膜间有肌卫星细胞，肌纤维损伤后，肌卫星细胞分化形成肌纤维。 （二）骨骼肌纤维的超微结构 肌原纤维、横小管和肌浆网等是骨骼肌纤维最主要的超微结构。 1．肌原纤维（myofibril） 由粗、细两种肌丝（myofilament）规律排列组成。 粗肌丝位于肌节的暗带，中央固定在 M线上，两端游离。 细肌丝位于肌节两端，一端附于Z线，另一端伸至粗肌丝间，末端游离，止于H带外侧； Ι带仅有细肌丝；H带(A带中部) 仅有粗肌丝；H带两侧的A带既有粗肌丝，又有细肌丝； （1）粗肌丝的分子结构： 由肌球蛋白分子组成，肌球蛋白形似豆芽，分头和杆两部分，头部具有ATP酶活性。 （2）细肌丝的分子结构： 细肌丝由肌动蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白组成。 骨骼肌肌纤维的结构 骨骼肌由骨骼肌纤维组成。骨骼肌纤维呈长圆柱状，其大小因肌肉类型和生理活动的状况而不同，一般长度约3－－40mm，镫骨肌纤维最短，长约lmm；缝匠肌纤维长达125mm。肌纤维的宽度约为10－－100μm，加强体育锻练能使肌纤维体积增粗。