豌豆Le启动子的功能研究
Production of the Promoter of Le(Length gene)in Garden
Pea
生命科学学院97级王萌
摘要
用PCR的方法从豌豆总DNA中克隆了Le基因（length gene）的启动子，命名为Le 启动子。Northern杂交的结果证明，Le基因主要在豌豆的根、茎中表达，在花和叶中的表达量很少，而果实中几乎没有表达。根据Le基因伸长组织特异的表达图式，推测Le 基因的启动子为伸长组织特异的启动子。GFP基因作为报告基因，由Le启动子调控，在转基因烟草中表达。对转基因烟草叶片的荧光显微镜观察结果，以及用GFP基因作为探针，转基因烟草的Northern杂交的结果，证实了Le启动子的组织特异性。利用Le启动子，可以实现目的基因的组织特异表达，在理论研究和生产实践上都有重要的应用价值。
Abstract
Stem length is one of the seven traits of garden pea from which Gregor Mendel established the laws of inheritance.The length gene(Le)encodes3β-hydroxylase,which controls the GA1 biosynthesis from GA20in pea.GA1is the major gibberellin(GA)controlling stem elongation in pea(Pisum sativum L.).The Northern Blotting analysis showed the tissue-specific expression of Le gene in roots and shoots,using the coding sequence of Le gene as a probe.Based on the
result,the promoter of Le gene shoμLd have https://www.doczj.com/doc/437116090.html,ing PCR(Polymerase Chain Reaction),we cloned the promoter of Le gene(Le promoter)from the genomic DNA of G2pea. Under the control of the Le promoter,the GFP gene was expressed in https://www.doczj.com/doc/437116090.html,ing the GFP gene as a probe,the Northern Blotting analysis of transgenic tobacco showed that the GFP gene expressed specifically in roots and shoots,especially in younger roots and shoots.The result identified the Le promoter is an elongating-tissue-specific https://www.doczj.com/doc/437116090.html,ing the promoter,we can realize the elongating-tissue-specific expression of the foreign genes.
关键词
Le基因，Le启动子，GFP基因,伸长组织特异
前言
Le基因
孟德尔在建立遗传法则的过程中研究了豌豆的七个表型性状（种子的形状，种子和花的颜色，子叶的颜色，豆荚的形状，豆荚的颜色，花的位置，茎的高矮），茎的高矮（stem length）是其中之一。1917年，White发现茎的高矮决定于一种高度因子是否存在，并引入基因符号Le（Length）。隐性等位基因le的纯合体植株，与野生型Le的纯合体植株相比，茎节间距较短，植株矮小，高度只有Le植株的1/4-1/5。
Brain和Hemming第一次将豌豆茎的高矮和赤霉素的作用（GA，gibberellins）联系在一起，给豌豆芽施加GA3，可刺激原本矮小的豌豆茎干伸长。Brain认为高茎豌豆中通常会产生与赤霉素相似的内源物质，并通过实验得以证实。赤霉素作为一种重要的植物激素，在茎干的伸长，种子的萌发和发育过程中，发挥着重要的作用。
豌豆中控制茎干伸长的赤霉素主要是GA1，由GA20经过3β-羟化酶的羟化作用形成。1984年Ingram等人通过放射性标记的方法，发现GA20向GA1的转化作用在le（矮干）植株内比在Le（高干）植株内大大降低了；同时发现，le植株内GA20的含量很高，而Le植株内GA1的含量很高；由此认为，Le基因编码了赤霉素3β-羟化酶（3β-hydroxylase）。
1997年David等克隆了赤霉素3β-羟化酶基因的cDNA，同年，Diane等人通过筛选
豌豆的亚基因组文库，得到了Le基因及其两侧的序列。David等人对Le基因的研究证明它的表达具有组织特异性，在正在萌发的豌豆中，Le基因在根、茎和子叶中特异表达；在萌发后的豌豆中，Le基因在幼根、幼茎和节间中特异表达。根据Le基因组织特异的表达模式，可以推断它的启动子是一个伸长组织特异的启动子。
植物基因启动子
启动子是基因5’末端与RNA聚合酶及一些反式作用因子结合的区域。一般情况下，基本启动子含有转录起始位点和TATA-box结构。转录起始点一般为A,TATA-box的序列为TATA[A/T]A[A/T]，位于转录起始位点-25—-30bp之间。RNA聚合酶II和启动子结合后开始转录。
由于启动子中的顺式作用元件在基因的特异表达中发挥着重要的作用，可使目的基因在不同的生长发育阶段或特定的环境条件下得到表达。因此，可通过连入特异启动子，获得基因表达的时空特异性。特异启动子的类型主要有：环境相应启动子，如：光响应启动子、温度响应启动子等；激素响应启动子，如：GA响应启动子、ABA响应启动子等；组织特异启动子，如：种子特异性表达启动子、维管束特异表达启动子等。
研究植物启动子常用的报告基因有GUS（β-glucuronidase），CAT（chloramphenical acetyl transferase），LUC（luciferase）和GFP（green fluorescent protein）。用于启动子-报告基因表达特异性检测的系统有原生质体转化检测，基因枪轰击后的瞬时表达检测和转基因植物的稳定表达检测。烟草和水稻是常用的模式植物，分别代表双子叶和单子叶植物。通常启动子的分离和分析在不同的植物中进行，因此分析发现的结果可能不能完全代表它在原植物中的特性，但在双子叶或是单子叶植物中间，启动子的组织特异性无明显变化。本实验采用GFP作为报告基因，通过转基因烟草，验证了Le启动子的伸长组织特异性。
GFP报告基因
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）最早是由Shimomura等（1962年）在海洋生物水母（Aequorea victoria）中发现的（Chalfie etal，1994）。GFP蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，可在紫外光源下发出稳定的绿色荧光。GFP的这种荧光发射无需外加辅助因子或进行任何特殊处理，作为报告基因和分子探针有很大的优越性，所以目前被广泛地用于生化和细胞生物学的各个领域。
GFP基因表达产物只需长波紫外和蓝光激发即可显示荧光，对它的检测不会影响对细胞生长和功能的检测，所以可以方便地进行活体和生长状态的观察。转化的受体组织细胞和整个个体都可以用手持紫外灯观察，对亚细胞水平的观察利用普通的荧光显微镜即可。
材料和方法
实验材料
1.植物材料
G2豌豆（Pisum sativum L）：由PJ Davies教授（Cornell University）赠种，实验室培育。
2.菌株和质粒
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101：实验室保存。
植物表达中间载体pCAMBIA3300：澳大利亚国际农业分子生物学应用中心惠赠（Center for the Application of MolecμLar Biology to International AgricμLture）。
中间载体pAVA120：由PJ Davies教授惠赠。
3.酶和试剂盒
植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit），植物核DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）：QIAGEN公司产品。
pGEM-T Easy Vector Systems：Promega公司产品。
质粒DNA提取试剂盒（Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System）：Promega公司产品。
DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）：QIAGEN公司产品。
核酸限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA Polymerase I Large(Klenow)Fragment：Promega 公司产品。
Taq DNA Polymerase：鼎国，华美公司产品
随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling Kit）：Takaba公司产品。
4.Northern Blotting试剂
Loading Dye（20mL）：80mg Bromophenol Blue（0.4%），80mg Xyiene Cyanole（0.4%），40μL0.5M EDTA（1mM），10mL Glyceol（50%），10mL H2O。
10×MSE（1升，pH7.0）：41.8g MOPS(free acid)，3.72g Na2EDTA?2H2O，6.8g NaAcetate
?3H
O，加水定容至1000mL。
2
20×SSC（1升，pH7.0）：175.3g NaCl，88.2g NaCitrate，加水定容至1000mL。
杂交液：1%BSA，1mM EDTA，0.5M NaPhosphate(pH7.2)，7%SDS。
Washing medium1：1%BSA，1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，5%SDS。Washing medium2：1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，1%SDS。
5.烟草转化试剂
1/2MS培养液(1000ml，pH5.8)：2.2g MS，15g sucrose，加水定容至1000mL。
MS固体培养基(1000ml，pH5.8)：4.4g MS，30g sucrose，8g Agar，加水定容至1000mL。T1培养基（pH5.6-5.8）：MS固体培养基，1mg/L6-BA，0.1mg/L NAA。
T2培养基：T1培养基，500mg/L Carb。
T3培养基：T1培养基，10mg/mL PPT。
T4培养基：MS培养基，10mg/mL PPT。
6-BA母液（1mg/mL）：1mol/mL HCl溶解，用水定容。
NAA母液（1mg/mL）：95%乙醇溶解，用水定容。
6.PCR引物
均由GIBCO BRL公司合成，序列如下：
LP（Le Promoter，Le启动子）合成引物
LP1（5’Primer）38bp
ATGGT ACCGT CGTAA AGAAT GGTTG AAGAT GGTTG ATG
LP2（3’Primer）38bp
GCTCT AGAGT AAAAG TAGTA GCTAT AGAGA AAATA ATG
LGP（Le Gene Probe，Le基因探针）合成引物
LGP1（5’Primer）25bp
TAGTG AAAGT GACAT AGCAA ATTTG
LGP2（3’Primer）24bp
GAATA GTAAT TTTGG CATTA ATTG
7.溶液和培养基
各种溶液和培养基配方见《分子克隆》。
实验方法
1.提取G2豌豆总核DNA
用植物核DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）。称取100mgG2豌豆叶片，用液氮将其研磨成粉末后，迅速转入1.5mL离心管，使液氮挥发。加入400μL Buffer AP1和4μL RNase A stock solution（100mg/mL），剧烈振荡至看不到明显的组织块。
65℃水浴10min，间或颠倒混合2-3次。加入130μL Buffer AP2，混合，冰浴5min。
将悬液（连同生成的沉淀）上柱（QIAshredder spin column），最大转速离心2min。将清液移入1.5mL离心管，加入0.5倍体积的Buffer AP3，1倍体积的无水乙醇，混匀。
转移650μL混合液上柱（DNeasy mini spin column），10，000rpm离心1min，弃下清。
加入500μL Buffer AW，10，000rpm离心1min，弃下清。加入500μL Buffer AW，最大转速离心2min。把柱子转到1.5mL离心管上，加入100μL65℃预热的Buffer AE 洗脱，室温下放置5min，10，000rpm离心1min。
2.准备Le基因的探针
1)PCR扩增Le基因片断
根据Le基因的全序列设计引物，序列见实验材料部分。以提取的G2豌豆的核DNA为模板，PCR克隆Le基因部分编码序列，作为Northern Blotting分析的探针。
50μL PCR反应混合液，37μL ddH2O，1μL dNTP，5μL10×Buffer（含MgCl2），1μL LGP1，1μL LGP2，4μL G2核DNA，1μL Taq DNA polymerase。PCR反应条件，94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火1.5min，72℃延伸1min，循环30次；72℃再延伸10min。
2)PCR产物回收
8%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit），回收600bp的DNA片断。在紫外灯下切下含有DNA片断的胶块，称重（每100mg 重量对应于100μL体积）。加入3倍体积的Buffer AW，65℃水浴10min，间或颠倒混匀。加入1倍体积的异丙醇，混匀后吸取800μL上柱。13，000rpm离心1min，倒去滤液。加入750μL Buffer AP，13，000rpm离心1min，倒去滤液，13，000rpm再离心1min。将柱子转至1.5mL离心管上，加入30μL Buffer EB，室温放置1min后，最大转速离心1min。
3)连入T vector
用pGEM-T Easy Vector Systems将回收的PCR产物和T vector相连。短暂离心pGEM-T Easy Vector，使用0.5mL离心管，制备10μL连接反应混合液，5μL2×Rapid Ligation Buffer，1μL pGEM-T Easy Vector，3μL PCR产物，1μL T4DNA Ligase。
4℃连接过夜（>18小时）。
4)转化
制备DH5α感受态。100μL DH5α感受态加入10μL连接产物，冰上放置30min，42℃热激2min，冰上放置5min。加入800μL LB液体培养基，37℃保温30min。
12,000rpm离心1min，倒去大部分上清，用剩余的100μL左右的LB液体培养基悬浮细菌沉淀，涂板（涂有40μL X-Gal和4μL IPTG）。转化产物在LB固体培养基（含有氨苄青霉素）上，37℃培养14小时。
5)提质粒，酶切鉴定
挑取单个菌落，接种于3mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)，37℃振荡培养16小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆。
6)酶切得到Le基因片断
用EcoRI酶切质粒，反应混合液，2μL10×酶切缓冲液，2μL BSA，1μL EcoRI，6μL质粒DNA，9μL ddH2O。37℃酶切6小时，电泳回收酶切片断，即为Le基因探针DNA。
3.Le基因的Northern Blotting分析
1)提取植物各组织总RNA
用植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取豌豆各组织的RNA。称取G2豌豆的叶片，茎，根，花，果实各100mg，分别用液氮研磨成粉末后，迅速转入1.5mL离心管，使液氮挥发。加入450μL Buffer RLT，剧烈振荡。56℃水浴1-3min。
裂解液上柱QIAshredder spin column，最大转速离心2min，转移清液至1.5mL离心管。
加入0.5倍体积（约225μL）无水乙醇，枪头混匀。将675μL样品（包括生成的沉淀）上柱RNeasy mini spin column，10，000rpm离心15s，弃下清。加入700μL Buffer RW1，10，000rpm离心15s洗涤，弃下清（连同收集管）。把柱子转移到新的收集管上，加入500μL Buffer RPE，10，000rpm离心15s，弃下清。加入500μL Buffer RPE，最大转速离心2min，弃下清（连同收集管）。把柱子转到1.5mL离心管上，加入30μL RNase-free的水，10，000rpm离心1min，重复5次，每种样品各得到150μLRNA
溶液。取出15μL，稀释50倍，测定光吸收。其余样品加入3倍体积无水乙醇，-70℃保存。
2)电泳准备
用去污剂、自来水和蒸馏水顺序洗涤电泳槽、梳子和胶板，无水乙醇干燥后，用3%H2O2浸泡，然后用RNase free的水清洗。称取1.2g琼脂糖加入100mL1×MSE，熔化后水浴冷却至65℃。加入1μL EB，1.8mL甲醛，混匀后倒胶（厚度不超过4mm），凝胶40min。
3)RNA样品准备
保存的RNA样品，加入1倍体积的0.3M NaAC，-20℃沉淀30min。4℃12，000rpm 离心15min，加入750μL70%乙醇洗涤，4℃12，000rpm离心5min，冷冻干燥后，溶解于5μL RNase free的水中。每种样品取相应体积（保证总RNA量相同），加入2μL10×MSE，3.5μL甲醛，10μL甲酰胺，65℃水浴15min，加入2μL Loading Dye。
4)电泳
加样电泳3小时左右，电泳距离6-8cm。电泳缓冲液为1×MSE，电泳中间，每隔0.5
O中，紫外灯下检查RNA的完小时将正负两极缓冲液混合一次。电泳后将胶浸入ddH
2
整性。
5)转膜
根据胶的大小，剪出相应大小的NC膜，把膜浸入ddH
O中5min，取出浸入20×SSC
2
中5min。同时，把“stack tray”放在桌面上，调水平；放上20张干燥的GB004滤纸，其上放置4张干燥的GB002滤纸，其上放置1张在20×SSC中润湿的GB002滤纸，在润湿的GB002滤纸上平铺润湿的NC膜，在它的上面平铺电泳胶（GB002滤纸，NC 膜和电泳胶之间不要有气泡）。在胶的上面加上20×SSC，放上3张润湿的GB002滤纸；放上“buffer tray”，槽内加入125mL20×SSC，放上“buffer wick”，转膜2小时。在2×SSC中洗膜5min，把膜放在滤纸上，吸去残余的溶液。紫外交联仪中自动交联。滤纸包膜，外加锡箔纸，80℃烘烤2小时，4℃保存。
6)预杂交，标记探针
用2mL注射器，装G50的柱子。用RNase-free的水洗杂交瓶，用杂交液润洗杂交瓶3次，放入膜，加入100mL杂交液，预杂交0.5小时。同时，准备用标记反应液，2μL Le基因探针DNA（200ng），2μL Random Primer,10μL TE Buffer；95℃水浴
3min后迅速置于冰中冷却，放置5min；加入2.5μL10×Buffer，2.5μL dNTP Mixture，5μL用于标记的dCTP（50uCi），加水定容至24μL，加入1μL Exo-free Klenow Fragment；37℃反应15min。加入3μL溴芬兰，混匀，上柱（G50），加入800μL TE 洗脱，收集溴芬兰前的溶液，95℃加热3min后迅速置于冰中冷却，立即用于杂交。
7)杂交
在杂交瓶中加入25mL65℃预热的杂交液，加入探针后混匀，65℃杂交16-24小时。
8)洗膜
65℃预热洗液，用Washing medium1洗2次，每次5min；用Washing medium2洗3-5次，每次5min，用计数器监测膜的放射性强度变化，决定洗膜的次数。
9)压片
洗膜后室温下将膜自然晾干（30-60min），包上一层保鲜膜，和x光片一起放入压片夹中，-70℃压片16-72小时。洗片前将压片夹于室温晾干1-2小时后，暗室洗片。
4.Le启动子的克隆
1)PCR克隆Le启动子
根据Le基因及其上游序列设计引物LP1、LP2，见实验材料部分。PCR克隆Le 基因上游1.1kb的DNA片断，分析表明含有Le基因的启动子。50μL PCR反应混合液，34μL ddH2O，1μL dNTP，5μL10×Buffer，3μL MgCl2溶液，1μL LP1，1μL LP2，4μL G2核DNA，1μL Taq DNA polymerase。PCR反应条件，94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min，循环30次；72℃再延伸10min。
2)连接，回收，转化
用pGEM-T Easy Vector Systems将回收的PCR产物和T vector相连，连接产物转化DH5α，转化产物涂板，蓝白斑筛选和抗性筛选得到阳性斑，提取质粒，酶切鉴定得到阳性克隆，质粒命名为pGEM-LP。
六合通公司测序鉴定。
5.植物表达中间载体的构建
1)酶切，回收
用XbaI，EcoRI限制性内切酶双切pGEM-LP载体，EcoRI端补平。首先用0.5μL EcoRI 酶切质粒，65℃加热终止反应；冷却后加入1μL Klenow酶，1μL dNTP，室温下放置30min，65℃加热终止反应；冷却后加入0.5μL XbaI酶切质粒。电泳回收1.1kb酶
切片断。使用XbaI，SmaI限制性内切酶双切pCAMBIA3300质粒，电泳回收酶切后的质粒片段。
2)连接
将Le启动子的酶切回收产物和pCAMBIA3300质粒酶切回收产物混合，加样如下：1μL10×连接缓冲液，1μL T4连接酶，4μL Le启动子回收产物，4μL pCAMBIA3300，16℃连接过夜。
3)转化，鉴定
制备DH5α感受态。转化连接产物，涂板。转化产物在LB固体培养基（含卡那霉素）上，37℃培养14小时。挑取单个菌落，接种于3mL LB液体培养基（含卡那霉素），37℃振荡培养16小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆，新合成的载体命名为pLP。
4)构建中间载体pLP-GFP
用EcoRI，PstI限制性内切酶双切pAVA120载体，EcoRI端补平。电泳回收1kb的酶切片断。使用XbaI，PstI限制性内切酶双切pLP质粒，电泳回收酶切后的质粒片段。
连接，转化，培养，酶切鉴定后得到阳性克隆，新的中间载体命名为pLP-GFP。6.冻融法转化农杆菌
1)制备农杆菌感受态
28℃，在LB液体培养基（含有庆大霉素）中振荡培养农杆菌（GV3101）24小时。
1：100转接，28℃振荡培养6-7小时，至OD600为0.6。制备感受态。取1.5mL菌液，13，000rpm离心30s，弃上清。用800μL250mMCaCl2重悬菌体沉淀，13，000rpm 离心30s，弃上清。用100μL250mM CaCl2重悬沉淀，冰上放置4小时。
2)冻融法转化农杆菌。
在100μL农杆菌感受态中加入6μL pLP-GFP质粒，冰上放置30min，浸入液氮中5min，37℃水浴5min。加入4-6倍体积的LB液体培养基，28℃温育3-5小时后，涂板，在LB固体培养基（含卡那霉素和庆大霉素）上，28℃培养24小时。
3)鉴定阳性克隆
挑取单个菌落，接种于3mLLB液体培养基（含卡那霉素和庆大霉素），28℃振荡培养24小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆。
7.转基因烟草的获得
1)制备农杆菌悬液
将转化的农杆菌接种于LB液体培养基（含庆大霉素和卡那霉素）中，28℃振荡培养24-36小时，取5ml菌液4，000g离心10min，用1/2MS培养液洗涤菌体，再离心，菌体悬浮于20-40ml1/2MS液体中（OD600=0.5）。
2)叶盘法转化烟草
取培养好的无菌烟草小苗的叶片，剪成1cm2左右的小块，放入准备好的农杆菌悬液中，浸泡3-5min。取出叶块，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在铺有一层无菌滤纸的T1培养基上，在28℃暗培养48小时后，将叶块转入T2培养基中，25-28℃光下培养24小时。将叶块转入T3培养基中，25-28℃光下培养，约15天后叶块切口处有愈伤生成，25-28℃继续培养，每10天左右换一次新鲜培养基，愈伤逐渐分化形成芽点，2-3月后，芽长成3-5cm高的小苗。切下较大的植株，转入T4培养基中，10天左右开始有根生成，待根系发达时，将苗转入灭菌土中，置温室培养。
8.PCR鉴定
提取转基因烟草和野生型烟草的总DNA为模板，以Le启动子的引物LP1，LP2为引物，进行PCR分析。50μL PCR反应混合液，34μL ddH2O，1μL dNTP，5μL10×Buffer，3μL MgCl2溶液，1μL LP1，1μL LP2，4μL烟草核DNA，1μL Taq DNA polymerase。PCR反应条件，94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火1.5min，72℃延伸1min，循环30次；72℃再延伸10min。同时，以pLP质粒为模板，以Le启动子的引物LP1，LP2为引物，PCR作为对照。50μL PCR反应混合液，37.5μL ddH2O，1μL dNTP，5μL10×Buffer，3μL MgCl2溶液，1μL LP1，1μL LP2，0.5μL质粒DNA，1μL Taq DNA polymerase。反应条件同上。
PCR产物电泳分析，结果见图5f
9.转基因烟草的Northern Blotting分析
1)制备探针
用XbaI，NcoI限制性内切酶双切pAVA120载体，电泳回收1kb左右的GFP基因酶切片断，用随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling Kit）标记后用作探针。
2)Northern Blotting
用植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）分别从转基因烟草的茎（幼
茎、老茎），根（幼根、老根），叶和节间中提取各组织的RNA。电泳后转膜，以GFP 基因为探针进行杂交，放射自显影后得到杂交结果，见图
10.用荧光显微镜观察转基因烟草的叶片
取转基因烟草无菌苗的顶端叶片，取叶尖、叶缘部分，切成小片；在载玻片上滴50%的甘油一滴，将叶片展放于载片中间，放上盖玻片（尽量避免气泡）。立即置于20倍荧光显微镜下观察，照相。
结果与讨论
Le基因的Northern Blotting结果分析
Northern Blotting结果显示，在光照条件下生长的豌豆中，Le基因转录产物在根和茎中大量存在，在叶中只有少量的存在，在花和幼嫩的种子中不存在；在暗中培养的黄化豌豆中，Le基因转录产物在根和茎中的含量特别丰富。（见附图3b）
根和茎是植物主要的伸长组织，二者均通过细胞的伸长进行生长；而叶，花和种子则主要是通过细胞数量的增加进行生长，细胞基本不伸长；暗中培养的黄化苗，表型上存在十分明显的伸长现象，根、茎细而长。Northern Blotting的结果证实了Le基因伸长组织特异的表达模式，根据启动子对基因表达的调控作用可以推测Le基因的启动子也具有伸长组织的特异性。
Le启动子的克隆
Le基因翻译起始位点ATG上游80bp处，含有TATA-box，（），对照Le基因的cDNA 序列和核DNA及其上游序列，可知TATA-box位于转录起始位点上游-34bp处，含有TATA-box的上游序列为Le基因的启动子。设计引物LP1、LP2，克隆Le基因上游1.1kb 的序列，并在DNA序列的5’端和3’端分别添加KpnI和XbaI酶切位点。六合通公司测序鉴定，测序结果和已知序列比较，核苷酸序列相同，认为得到了Le基因的启动子，命名为Le Promoter。Le启动子的序列及测序结果见附图2，7。
植物表达中间载体的构建
构建流程图见附图1。pCAMBIA3300植物表达载体，具有除草剂（phosphinothricin，
简称PPT）和卡那霉素（kanamycin）两个不同的抗性基因，分别用于真核、原核生物内的筛选。在多克隆位点连入Le启动子，通过酶切和PCR进行鉴定（见附图4b,c），结果证实，成功构建了新的植物表达载体pLP。pLP带有伸长组织特异启动子，可实现目的基因在伸长组织中的特异表达。
来自中间载体pA V A120的GFP报告基因，已经改造并在基因的5’端连有转录增强子（TL），可在植物细胞中高效率的表达。将其连入载体pLP，获得新的植物表达载体pLP-GFP，酶切鉴定结果见附图4d。利用载体pLP-GFP可以获得转基因植物，利用GFP 报告基因进行Le启动子的表达特异性检测。
转基因烟草的获得
通过叶盘法转化获得转基因的烟草。烟草转化结果见附图5a-e。
以LP1，LP2为引物，对转基因烟草进行PCR检测，电泳结果（见附图5f）显示，pLP质粒和转基因烟草PCR产物为1.1kb的条带，与Le启动子大小一致；野生型烟草的PCR产物没有特异的条带，该结果证实已获得含有Le启动子的转基因烟草。对Le启动子转化拷贝数的检测需进一步的Southern Blotting结果（实验正在进行）。
表达特异性检测
Northern Blotting结果（见附图6e）显示，转基因烟草中，GFP基因转录产物在根和茎中含量丰富，在叶中只有少量的存在；GFP基因转录产物，在幼根和幼茎中的含量又明显高于老根和老茎。
在荧光显微镜下观察转基因烟草的叶片，叶毛中可观察到明显的绿色荧光，但在叶片细胞中看不到明显的绿色荧光；同样的，在荧光显微镜下观察野生型烟草的叶片，叶毛和叶片细胞中都不能观察到绿色荧光。结果见附图6a-d。叶片的生长主要通过细胞数量的增加实现，细胞伸长的现象不明显；而叶毛属于表皮毛，是由表皮细胞的伸长形成的。
上述结果证实，Le启动子确实是一个伸长组织特异的启动子。
研究意义
克隆得到的Le启动子是一个伸长组织特异的启动子，对叶片细胞观察的结果初步证明该启动子具有伸长细胞的特异性。利用Le启动子可以实现外源基因在伸长组织，或是
非伸长组织伸长细胞中的特异表达。可广泛用于有关伸长组织或细胞的理论研究中。
虫害一直是造成农业减产的重要原因之一，通过基因工程的手段将抗虫基因引入农作物细胞并使其稳定的表达和遗传，从而培育抗虫作物新品种，获得农作物的稳产高产，已成为现代农业发展的方向。一般情况下，抗虫基因的作用是通过表达毒蛋白实现的，所以，在提高作物抗性的同时，必须注意转基因作物的食用安全性。通过特异的启动子，有目的的实现抗虫基因在特定组织中的特异表达，是利用基因工程手段获得抗虫作物最为理想而有效的方式。Le启动子正是具有这样的组织特异性，可以预计它在基因工程的实践中会有重要的用途。
图例
图1植物表达中间载体构建流程图 a.pLP中间载体构建；b.pLP-GFP中间载体构建
图2Le启动子的克隆
图3豌豆的Northern Blotting分析 a.Northern Blotting转膜示意图；b.豌豆Northern Blotting结果
图4PCR产物、酶切产物电泳图 a.Le启动子PCR产物；b.酶切鉴定中间载体pLP；c.PCR 鉴定中间载体pLP；d.酶切鉴定中间载体pLP-GFP
图5转基因烟草的获得 a.未转化农杆菌浸染的烟草叶片；b.转化农杆菌浸染的烟草叶片在T3培养基上长出愈伤；c.转化农杆菌浸染的烟草叶片在T3培养基上长出小苗；d.转化的烟草小苗在T4培养基中生根；e.初步长成的转化烟草；f.转基因烟草的PCR鉴定图6表达特异性检测 a.野生型烟草叶片在荧光显微镜下观察结果；b.图a的局部放大；
c.转基因烟草叶片在荧光显微镜下观察结果；
d.图c的局部放大；
e.转基因烟草Northern Blotting结果
图7Le启动子PCR产物测序结果
致谢
首先感谢李政道先生和秦惠 女士为我提供这样好的机会，使我可以在本科生期间就参与到学科前沿的实验研究工作中。两年来，在独立承担科研任务的过程中，我的理论水平和实践能力都有了质的飞跃，树立了初步的科研思想，掌握了丰富的实验技能，具备了一定的科研能力。这将为我今后进一步的科学研究工作打下一个良好的基础。
师恩难忘，是导师朱玉贤教授的悉心指导，把我一步步带进生命科学的殿堂。他对科研工作火一般的热情和忘我的拚搏精神时刻激励着我前进的脚步，他严谨的治学态度和渊博的生物学知识帮我培养起良好的科研品质。两年来，朱博的关怀和教诲时刻鼓舞着我，帮我战胜实验中的一次次的困难和挫折，让我懂得做人、做学问的道理。
参考文献
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5Rachel J.Cowling,et al.Gibberellin Dose-Response Regulation of GA4Gene Transcript Levels in Arabidopsis.Plant Physiol.1998,117:1195–1203
6Tomonobu Toyomasu,et al.Phytochrome Regulates Gibberellin Biosynthesis during Germination of Photoblastic Lettuce Seeds.Plant Physiol.1998,118:1517–1523
7Shinjiro Yamaguchi,et al.Phytochrome Regulation and Differential Expression of Gibberellin 3b-Hydroxylase Genes in Germinating Arabidopsis Seeds.Plant Cell,1998,10:2115–2126
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13T Lange,et al.Cloning and expression of a gibberellin2beta,3beta-hydroxylase cDNA from pumpkin endosperm.Plant Cell.1997,9:1459-1467
14朱玉贤，李毅，《现代分子生物学》，高等教育出版社。1997
作者简介：王萌，女，生命科学学院生物化学和分子生物学专业97级本科生。现在生科院蛋白工程和植物基因工程国家重点实验室工作。四年来，学习成绩优异，实验工作出色，曾两次获得北京大学“创新奖”、学习优异奖，“光华”、“书卷”奖学金，“学术希望之星”优异奖。爱好广泛，国画作品曾赴日本展出，运动会上曾获女子三千米铜牌。
感情与寄语：获得“ 政”以来，曾被各样的人问起感受，仔细想来，“参与”是
最简练也较为准确的答案。报名参加只是源于自己“万事try为上”的个性，有幸获选，也只是庆幸自己又多了一次参与和实践的机会。两年来，有过失败的泪水，但更多的是成功的喜悦，收获的，失去的，珍惜的，遗憾的，种种都不是笔下所能承载。“谢谢你， 政”，一次机会，珍惜了，必然是一次收获。
指导教师简介：朱玉贤，男，1955年12月出生于浙江富阳市。1982年7月大学本科毕业于浙江农业大学，1989年12月在美国康奈尔大学获得博士学位，先后在华盛顿大学、北京大学和加州伯克利大学从事博士后研究，现为北京大学教授、博导，蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室副主任，兼任中国生物工程学会理事及农业生物技术专业委员会副主任，中国植物学会分子生物学专业委员会副主任，《植物学报》副主编。担任中科院上海植生所植物分子遗传国家重点实验室学术委员会委员，中科院遗传所和微生物所联合植物生物技术部门开放实验室学术委员会委员，教育部科学技术委员会生命科学学部委员。
2008年全国硕士研究生人学统一考试 植物生理学与生物化学 植物生理学 一、单项选择题：1一15小题，每小题1分，共15分。下列每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 1．下列元素缺乏时，导致植物幼叶首先出现病症的元素是 A．N B．P． C.Ca D．K 2．能诱导果实发生呼吸跃变的植物激素是 A．ABA B．IAA C．ETH D．CTK 3．植物一生的生长进程中，其生长速率的变化规律是 A．快一慢一快 B．快一慢 C．慢一快一慢 D．慢一快4．植物细胞中质子泵利用ATP水解释放的能量，逆电化学势梯度跨膜转运H+，这一过程称为 A．初级主动运输 B．次级主动运输 C．同向共运输 D．反向共运输5．植物叶片中进行亚硝酸还原的主要部位是 A．线粒体 B．细胞基质 C．液泡 D．叶绿体 6．高等植物光系统Ⅱ的作用中心色素分子是 A．P680 B．P700 C．A0 D．Pheo 7．植物光呼吸过程中，氧气吸收发生的部位是 A．线粒体和叶绿体 B．线粒体和过氧化物酶体 C．叶绿体和乙醛酸循环体 D．叶绿体和过氧化物酶体 8．类胡萝卜素对可见光的吸收范围是 A．680～700nm B．600～680 nm C．500～600 nm D．400～500nm 9．1mol NADH + H+经交替氧化途径将电子传给氧气时，可形成A．4molATP B．3molATP C．2.molATP D．1molATP 10．若某一植物组织呼吸作用释放C02摩尔数和吸收O2摩尔数的比值小于1，则该组织在此阶段的呼吸底物主要是 A．脂肪B．淀粉C．有机酸D．葡萄糖
11．某植物制造100g干物质消耗了75kg水，其蒸腾系数为 A．750 B．75 C．7．5 D．0．75 12．下列蛋白质中，属于植物细胞壁结构蛋白的是 A．钙调蛋白B．伸展蛋白C．G蛋白D．扩张蛋白 13．在植物的光周期诱导过程中，随着暗期的延长 A．Pr含量降低，有利于LDP开花 B．Pfr含量降低，有利于SDP开花C．Pfr含量降低，有利于LDP开花D．Pr含量降低，有利于SDP开花 14．根据花形态建成基因调控的“ABC模型”，控制花器官中雄蕊形成的是A．A组基因B．A组和B组基因 C．B组和C组基因D．C组基因15．未完成后熟的种子在低温层积过程中，ABA和GA含量的变化为 A．ABA升高，GA降低 B．ABA降低，GA升高 C．ABA和GA均降低 D．ABA和GA均升高 二、简答题：16—18小题，每小题8分，共24分。 16．把一发生初始质壁分离的植物细胞放入纯水中，细胞的体积、水势、渗透势、压力势如何变化? 17．简述生长素的主要生理作用。 18．简述韧皮部同化物运输的压力流动学说。 三、实验题：19小题，10分。 19．将A、B两种植物分别放置在密闭的光照生长箱中，定期抽取生长箱中的气体样品，分析其中的C02含量。以C02含量对光照时间作图，得到下列曲线图。据图回答： (1)分析图中曲线变化的原因。 (2)推测两种植物的光合碳同化途径。 (3)请用另一种实验方法验证你的推测。
真核启动子 EF1a 常规表达用 mRNA 人延长因子1α来源 的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子杂交 TRE 常规表达用 mRNA 四环素响应元件启动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达 Ac5 常规表达用 mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动子 组成型 果蝇表达系统的常用启动子
CaMKIIa 光遗传学 基因表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶II 启动 子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受到 钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表达 用 mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表达 用 mRNA 乙醇脱氢酶I的酵母 启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表达 用 mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达 U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子
T7lac 高水 平基 因表 达 T7噬菌体来 源的启动子 加上lac操 纵子 几乎没有本底表 达，需要T7 RNA 聚合酶，受到lac 操纵子的控制， 可以被IPTG诱 导。 常用与pET载体，受到lac操纵子的严格调控 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代 谢操纵子的 启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD载体。适合于快速调控和低的本底表达 lac 常规 表达 用 Lac操纵子 来源的启动 子 可以被IPTG或 者乳糖诱导 在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细 胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非 诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达， 能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为 Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上 通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的 诱导调控。 pL 高水 平基 因表 达 Lambda噬 菌体来源的 启动子 温度调节通常和温度敏感的cI857 抑制子搭配使用
2012年全国硕士研究生入学统一考试 农学门类联考 植物生理学与生物化学 植物生理学 一、单项选择题：l～15小题，每小题1分，共15分。下列每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 1．光呼吸过程中氧气的吸收发生在 A线粒体和高尔基体B叶绿体和过氧化物体 C 线粒体和过氧化物体D叶绿体和线粒体 【参考答案】B 【考查知识点】《光合作用》——光呼吸 2．能诱导禾谷类植物种子产生α-淀粉酶的植物激素是 A.ABA B.GA C.CTK D.IAA 【参考答案】B 【考查知识点】《植物生长物质》——赤霉素的作用 3．下列关于蛋白复合物在细胞中存在部位的叙述，正确的是 A.纤维素合酶位于高尔基体上 B.PSⅡ位于叶绿体基质中 C.F O-F1复合物位于叶绿体内膜上 D.LHCⅡ位于叶绿体类囊体膜上 【参考答案】A 【考查知识点】《植物细胞的结构与功能》，《光合作用》——植物细胞亚显微结构与功能，叶绿体和光和色素 4．下列能支持韧皮部运输压力流动学说的是 A.筛管分子间的筛板孔是开放的 B.P蛋白特异地存在于筛管细胞中 C.蔗糖是筛管汁液中含量最高的有机物 D.韧皮部物质的运输存在着双向运输现象 【参考答案】A 【考查知识点】《同化物的运输、分配及信号转导》——韧皮部运输机理 5．照射波长为730mm的远红光，植物体内Pfr和Pr含量变化为 A.Pfr升高，Pr降低 B.Pfr降低，Pr升高 C.Pfr降低，Pr降低 D.Pfr升高，Pr升高 【参考答案】B 【考查知识点】《植物的生长生理》——光形态建成的作用机理 6．下列蛋白质中，在酸性条件下具有促使细胞壁松弛作用的是： A.扩张蛋白 B.G蛋白 C.钙调蛋白 D.肌动蛋白 【参考答案】A 【考查知识点】《植物细胞的结构和组成》
真核启动子 EF1a 常规表 达用 mRNA 人延长因子1α来 源的强哺乳动物表达启动子 组成型 表达水平十分稳定，与细胞类型无关 PGK1 (人/小鼠) 常规表 达用 mRNA 磷酸甘油酸酯激酶 基因来源的哺乳动物启动子 组成型 广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用，倾向于抵抗启动子下调。 human beta actin 常规表 达用 mRNA β-肌动蛋白基因来 源的哺乳动物启动子 组成型 无处不在，鸡的启动子常用与启动子 杂交 TRE 常规表 达用 mRNA 四环素响应元件启 动子 被四环素或 者类似物诱导 通常有本底表达
Ac5 常规表 达用mRNA 果蝇Actin 5c 基因 来源的强昆虫启动 子 组成型果蝇表达系统的常用启动子 CaMKIIa 光遗传 学基因 表达 mRNA Ca2+/钙调蛋白依赖 的蛋白激酶 II 启 动子 特异的 用于中枢神经系统/神经元表达。受 到钙和钙调蛋白调节。 TEF1 常规表 达用mRNA 酵母转录延伸因子 启动子 组成型与哺乳动物的EF1a 启动子类似 ADH1 常规表 达用mRNA 乙醇脱氢酶I的酵 母启动子 被乙醇抑制 全长版本很强，促进高表达。截短启 动子是组成型的，表达较低。 Ubi 常规表 达用mRNA 玉米泛素基因的植 物启动子 组成型在植物中促进高表达
U6 小RNA 表达 shRNA 来源于人U6小核启 动子 组成型 小鼠U6也使用,但效率略差。 常用的原核表达系统启动子 T7lac 高水平基因表达 T7噬菌体来源的启动子加上lac 操纵子 几乎没有本底 表达，需要T7 RNA 聚合酶，受 到lac 操纵子的控制，可以被 IPTG 诱导。 常用与pET 载体，受到lac 操纵子的严格调控 Sp6 体外 转录/ 常规 表达 Sp6噬菌体来源的启动子 组成型, 需要SP6 RNA 聚合 酶 当用于体外转录的时候，专路方向有可能是正向的也可能是 反向的，取决于启动子相对于目的基因的方向 araBAD 常规 表达 用 阿拉伯糖代谢操纵 子的启动子 阿拉伯糖诱导 弱，常用与pBAD 载体。适合于快速调控和低的本底表达
论生物医学工程的现状及发展前景 生物医学工程(Biomedical Engineering, BME)崛起于20世纪60年代。其内涵是: 工程科学的原理和方法与生命科学的原理和方法相结合, 认识生命运动的规律，并用以维持、促进人的健康。它的兴起有多方面的原因，其一是医学进步的需要；其二则是医疗器械发展的需要。 四十年来, 生物医学工程已经深入于医学，从临床医学到医学基础，并深刻地改变了医学本身, 而且预示着医学变革的方向。可以说，没有生物医学工程就没有医学的今天。另一方面, 生物医学工程的兴起和发展不仅推动了医疗器械产业的发展，而且使它发生了质的改变，最根本的是，将使用对象和使用者以及医疗装置看作是一个系统整体, 强调其间的相互作用, 进而用系统工程的观念研究发展所需要的医疗装置，实现预定的医疗目的。 生物医学工程学科是一门高度综合的交叉学科，这是它最大的特点。所谓交叉学科是指由不同学科、领域、部门之间相互作用,彼此融合形成的一类学科群。从学科发展的历史长河来看，新学科的产生大都是传统或成熟学科相互交叉作用产生的结果。而且，生物医学工程所指的学科交叉，不是生物医学同哪一个工程学科分支的简单结合，而是多学科、广范围、高层次上的融合。近年来，高分子材料科学、电子学、计算机科学等自然科学的不断发展，极大地推动了生物医学工程学科的发展。 此外，生物医学工程学科所涉及的领域非常广泛。可以说，有多少理工科分支，就会产生多少生物医学工程领域，这种多学科的交叉融合涉及到所有的理、工学科和所有的生物学和医学分支。这样一来，当任何一个学科取得突破进展时都能影响到生物医学工程的发展，使其发展的速度异常迅速。 发达国家生物医学工程的现状 在美国以及欧洲等经济发达国家，早在上世纪50年代就指出生物医学工程的重要性，基于其强大的经济、科技实力，经过近半个世纪的努力均取得了各自的成果。如今，这些国家在生物医学工程方面处于世界前列。但是面对当今科技飞速发展的新形势，他们仍在想尽一切办法努力前进。在美国，许多著名大学根据自身条件和生物医学工程学科的特点以及社会需要采用各种方式积极推进“学科交叉计划”。这样一来，生物医学工程在这一有利条件下迅速发展，朝向以整合生物、医学、物理、化学及工程科学等高度交叉跨领域方向发展。这种发展方向既促进了传统性专业的提升，又为逐步形成新专业创造了条件。 另外，美国政府因认识到新的世纪生物医学工程对促进卫生保障事业发展所具有极大的重要性，急需扭转美国生物医学工程领域研发工作群龙无首的分散局面，美国第106届国会于2000年1月24日通过立法。在国立卫生研究院内设立了国家生物医学成像和生物工程研究所，规定由该所负责对美国生物医学工程领域的科研创新、开发应用、教育培训和信息传播等进行统一协调和管理，促进生物学、医学、物理学、工程学和计算机科学之间的基本了解、合作研究以及跨学科的创新。这也大大推动了美国的生物医学工程学科的发展。 国内生物医学工程的现状 我国的生物医学工程学科相对国外发达国家来说起步比较低。自上世纪70年代以来，经过40多年的发展，目前全国已有很多所高校内设有此专业，在一些理、工科实力较强的高校内均建有生物医学工程专业。由于这些学校的理、工等学科在全国都有重要的影响，且大都设有国家级重点学科，他们开展起来十分方便，这些院校均是以科研性学科设置的。此外，还有一些医学院校则是以医学作为基底学科，置入某些工程学科的
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
2014年全国硕士研究生入学统一考试 农学门类联考动物生理学与生物化学试题解析 动物生理学 一、单项选择题：1～15小题，每小题1分，共I5分。下列每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 1．骨骼肌细胞兴奋时细胞膜发生去极化的离子基础是 +内流+内流内流+内流 【参考答案】B 【考查知识点】考察骨骼肌细胞兴奋时，细胞膜钙离子内流的重要性。 2．下列物质中，能加速新鲜血液凝固的是 A.柠檬酸钠溶液 B.液体石蜡 C.肺组织浸出液 D.肝素溶液 【参考答案】C 【考查知识点】考察血液凝固和抑制的相关物质。 3．正常情况下，心肌不会发生强直收缩的原因是 A.心肌是功能合胞体 B.心肌肌浆网不发达 C.心肌有自动节律性 D.心肌有效不应期长 【参考答案】D 【考查知识点】考察心肌细胞的功能效应。 4．心室等容舒张过程中各部位压力相比较，正确的是 A.心房压>心室压>主动脉压 B. 心房压>心室压<主动脉压 C. 心房压<心室压<主动脉压 D. 心房压<心室压>主动脉压 【参考答案】 【考查知识点】考察血压的流动方向。 5．下列心肌细胞中，兴奋传导速度最慢的是 A.新房肌细胞 B.结区细胞 C.哺肯野细胞 D.心室肌细胞 【参考答案】 【考查知识点】考察兴奋在心肌细胞中传导速度。 6．缺氧可反射性地引起呼吸加强，该反射的感受器是：
A.肺牵张感受器 B.呼吸肌本体感受器 C.外周化学感受器 D.中枢化学感受器 【参考答案】C 【考查知识点】考察呼吸运动在不同的条件下不同的感受器。 7．下列条件中，均可使氧离曲线发生右移的是 升高、CO2分压升高、温度升高 B. pH降低、CO2分压升高、温度升高 C. pH升高、CO2分压降低、温度降低降低、CO2分压降低、温度降低 【参考答案】B 【考查知识点】考察氧离曲线左右移动的因素。 8．对食物中蛋白质消化作用最强的消化液是 A.唾液 B.胃液 C.胆汁 D.胰液 【参考答案】D 【考查知识点】考察影响蛋白质消化作用最强的消化液。 9．维持躯体姿势最基本的反射是 A.腱反射 B.肌紧张 C.屈肌反射 D.对侧伸肌反射 【参考答案】D 【考查知识点】考察肌紧张是指缓慢持续牵拉肌腱时，受牵拉肌肉发生紧张性收缩，阻止肌肉被拉长，它是维持躯体姿势的最基本反射，是姿势反射的基础。 10. 寒冷环境中能促使恒温的物产热，并具有起放慢、作用持续时间长特点的激素是 A.甲状腺激素 B.肾上腺素 C.去甲肾上腺素 D.生长激素 【参考答案】B 【考查知识点】考察寒冷环境：人体血管收缩，血流量减少，所以散热减少；肾上腺激素分泌增加，骨骼肌战栗所以产热量增加。肾上腺激素的功能。 11. 下列激素中，可直接促进肾远曲小管和集合管重吸收Na+的是 A.肾素 B.醛固酮 C.心房钠尿肽 D.抗利尿激素 【参考答案】D 【考查知识点】考察抗利尿激素的功能。 12. 在神经—肌肉接头处，分解乙酰胆碱的酶是 A.磷酸二酯酶 B.胆碱乙酰化酶 C.腺苷酸环化酶 D.乙酰胆碱酯酶 【参考答案】D
真核生物启动子预测相关数据库资源概述 刘玉瑛1,张江丽2(1.首都师范大学生命科学学院,北京100037;2.廊坊师范学院生命科学学院,河北廊坊065000) 摘要启动子是基因表达调控的重要元件,深入研究启动子的结构和功能,是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。随着生物技术和计算机技术的高速发展,应用生物信息学技术对启动子进行预测和分析的方法得到了很大发展。对目前常用的真核生物启动子预测相关数据库和软件资源作了简单介绍。 关键词真核生物;启动子;数据库;预测 中图分类号Q24文献标识码A文章编号0517-6611(2007)24-07418-02 The Databases o f Eukaryo tic Promoters and Related So ftw are Resources LIU Yu2ying et al(Co lleg e of Life Science,Capital N ormal U niv ersity,B eijin g100037) Abstract Eu kary o tic pro mo ters are i mp ortan t elemen ts in reg ulatio n o f the e xpres si on.T o stud y the structu re and functio n o f a p ro m oter deeply,i t is the key to kno w ho w the gene reg ulates its transcri pti on an d starts its exp ression.With the fast d evelo pmen t o f bio log ical and co m puter techno lo gy,sig nifican t ac hiev ements h av e been made in co mp utatio nal predictio n o n Eu kary o tic pro mo ters.In thi s paper mai nly in tro duces the pro g ress made in the datab ases o f predictin g E ukaryo tic p ro mo ters as w ell as the related so ftw are reso urces w as in tro duced. Key w ords Wikipedia;Pro m oter;D atab ase;Predicti on 作为基因表达所必需的重要序列信号和基因转录水平上一种重要的调控元件,真核生物的启动子一直是现代分子生物学的研究热点。用实验的方法分析和鉴定启动子是多年以来进行启动子研究的主要途径。近年来,随着人类基因组测序的完成和根据实验获得的对启动子的序列特征与结构功能的认识,利用生物信息学的方法,通过计算机模拟和计算来预测基因启动子的相关信息获得越来越多的应用。笔者对目前常用的几个启动子预测数据库和相关软件资源作一简单介绍。 1真核生物启动子的基本结构 真核生物的启动子有3种类型,分别由R NA聚合酶?、ò和ó进行转录。典型的真核生物启动子由核心启动子、上游元件和应答元件构成。 核心启动子包括起始子和基本启动子。其中起始子是DN A解链并起始转录的位点。基本启动子序列为中心在-25~-30的7bp保守区,其碱基频率为:T85A97T93A85A2 63A83A50,通常被称为T A T A框或Goldberg2Ho gne ss框,具有选择正确的起始位点,保证精确起始的功能。同时,T A T A框还能影响转录速率。如兔的珠蛋白基因中T A T A框的保守序列A T AAA A人工突变为A TG T AA时,转录效率会下降80%。 上游元件主要包括C AA T框和GC框两种,均具有增强转录活性的功能。其中,C AA T框的保守序列是GGC T2 C A A TC T,一般位于上游-75紧靠-80,与其相互作用的因子有C TF家族的成员C P1、C P2和核因子NF21等;GC框的保守序列是G TGGGC G GG GC AA T,常以多拷贝形式存在-90处,识别该序列的转录激活因子为Sp1。两种上游元件同时存在或者只存在其中之一,但并非所有真核基因的启动子都存在上游启动子元件,有些植物细胞中几乎不存在C AA T框。 应答元件通常位于基因上游,能被转录因子识别和结合,从而调控基因的专一性表达。如热激应答元件、激素应答元件、c A M P应答元件、金属应答元件、糖皮质激素应答元 作者简介刘玉瑛(1982-),女,北京人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学。 收稿日期2007204223件和血清应答元件等。应答元件含有短重复序列,不同基因中应答元件的拷贝数相近。 2真核生物启动子预测相关数据库资源 2.1EPD(Eukaryotic promote r database)[1]EP D数据库(http://w w w.e pd.isb2sib.ch/或者f tp://f tp.e pd.isb2sib.c h/ pub/da taba se s/epd)是一个针对真核R NA聚合酶II型启动子的非冗余数据库。现有启动子序列数据1500多个,按层次组织。关于启动子的描述信息直接摘自科学文献。该数据库中所有的启动子均经过一系列实验证实,如:是否为真核R NA聚合酶ò型启动子、是否在高等真核生物中有生物学活性、是否与数据库中的其他启动子有同源性等。同时,EPD 与其他的相关数据库如EM B L、S WI S S2P RO T、TRA NS FAC等,实现了数据的交叉链接。在其最新版本(第76版)中,EPD 将收集的启动子分为6大类:植物启动子、线虫启动子、拟南芥启动子、软体动物启动子、棘皮类动物启动子和脊椎动物启动子,共2997个条目,其中人类启动子有1871个,约占总数的62%。EPD数据库是目前唯一一个源自实验数据的真核生物启动子数据库,是常用的预测软件测评的手段之一。 2.2PLAC E(Plant cis2ac ting regulatory DNA elements)[2] P LAC E数据库(http://w ww.dna.af frc.go.jp/htdoc s/PL AC E/, F TP服务器为ftp://ftp.dna.a ff rc.go.jp/)是从已发表文献中搜集植物顺式作用元件资料而建立的模体数据库(mo tif data base),始于1991年。目前服务器位于日本农林渔业部。P LAC E数据库中只囊括维管植物的信息,其他与植物顺式作用元件同源的非植物模体也同时被收录。并且所收录信息根据实验最新进展随时得到更新。同时,PL AC E数据库中还包括了对每个模体的描述和在PubM ed中的相关文献编号,以及在DDB J/E MB L/GenB ank的核酸序列数据库的登录号,点击后可阅读相关文献摘要等信息。登陆PL AC E数据库界面,用户可通过关键词、S RS关键词或者同源序列查询顺式作用元件的信息。关键词可以是模体名称、涉及的诱导子或者植物激素、胁迫类型、该基因表达的组织或者器官、原始文献的作者、模体序列、植物种属等。查询结果显示位点(模体)名称、位置、序列和PL ACE登录号,同时,也可以用F AS T A 格式批量上传序列信息。 安徽农业科学,J ou rnal o f Anh ui Ag ri.Sci.2007,35(24):7418-7419责任编辑孙红忠责任校对李洪
生物医学工程(Biomedical Engineering，BME)，是用自然科学和工程技术的理论方法，研究解决医学防病治病，增进人民健康的一门理、工、医相结合的边缘科学。它综合运用工程学的理论和方法，深入研究、解释、定义和解决医学上的有关问题。 生物传感器应有以下几个条件：①高可靠；②少损伤或无损伤；③微型化； ④重复性好；⑤数字信号输出；⑥组织相容性好；⑦寿命长；⑧容易制造。 生物工程(bioengineering)亦称生物技术(biotechnology) , 它是通过工程技术手段，利用生物有机体或生物过程，生产有经济价值的产品的技术科学。它的实际应用包括对生物有机体及其亚细胞组分在制造业、服务性工业以及环境管理等方面的应用。细胞工程(cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学技术，按照预定的设计改变或创造细胞遗传物质，使之获得新的遗传性状，通过体外培养，提供细胞产品，或培育出新的品种，甚至新的物种。 细胞工程的三个发展阶段： 第一阶段：～70年代中期，确立了细胞培养技术、核型分析技术、细胞融合技术及其应用 第二阶段：70年代后期～80年代后期，基因工程与细胞工程结合，应用DNA 导入技术分析了人体基因的微细结构。 第三阶段：80年代后期～，基因打靶为基础，胚胎发生工程与基因工程结合作为新的研究发展趋势。即在培养细胞水平上同源基因重组的“基因打靶” “基因打靶”是指利用基因转移方法，将外源DNA序列导入靶细胞后通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组，将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变的技术 细胞融合(cell fusion)是指用自然或人工方法，使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。它包括质膜的连接与融合，胞质合并，细胞核、细胞器和酶等互成混合体系。 应用：淋巴细胞杂交瘤技术，其产物为单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)是由单一克隆(clone)的B淋巴细胞产生的抗单一抗原的高度特异性抗体。
农学门类联考 植物生理学与生物化学 植物生理学 一、单项选择题：l～15小题，每小题1分，共15分。下列每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 1. G-蛋白是一类具有重要生理调节功能的蛋白质，它在细胞信号转导中的作用是 A. 作为细胞质膜上的受体感受胞外信号 B. 经胞受体激活后完成信号的跨膜转换 C. 作为第二信号 D. 作为蛋白激酶磷酸化靶蛋白 2. 植物细胞进行无氧呼吸时 A. 总是有能量释放，但不一定有CO2释放 B. 总是有能量和CO2释放 C. 总是有能量释放，但不形成ATP D. 产生酒精或乳酸，但无能量释放 3. 以下关于植物细胞离子通道的描述，错误的是 A. 离子通道是由跨膜蛋白质构成的 B. 离子通道是由外在蛋白质构成的 C. 离子通道的运输具有一定的选择性 D. 离子通道的运输只能顺电化学势梯度进行
4. C3植物中，RuBp羧化酶催化的CO2固定反应发生的部位是 A. 叶肉细胞基质 B. 叶肉细胞叶绿体 C. 维管束鞘细胞机制 D. 维管束鞘细胞叶绿体 5. 细胞壁果胶质水解的产物主要是 A. 半乳糖醛酸 B. 葡萄糖 C. 核糖 D. 果糖 6. 叶片衰老过程中最先解体的细胞器是 A. 高尔基体 B. 内质网 C. 叶绿体 D. 线粒体 7. 某种长日植物生长在8h光期和16h暗期下，以下处理能促进其开花的是 A. 暗期中间用红光间断 B. 光期中间用黑暗间断 C. 暗期中间用逆红光间断 D. 按其中间用红光-远红光间断 8. 在其它环境条件适宜时，随环境温度升高，植物光和作用的光补偿点 A. 下降 B. 升高 C. 不变 D. 变化无规律 9. C4植物光和碳同化过程中，从叶肉细胞通过胞间连丝运输到维管束鞘细胞的C4-二羧酸是 A. 天冬氨酸或草酰乙酸 B. 草酰乙酸或苹果酸
作者：楼佳枫1223020057 信息与工程学院电气2班 学科导论作业:（部分参考于百度知道） -----生物医学工程对生活的影响和前景大学，我选择的专业是电气信息类：它未来将分为生物医学工程，计算机科学与技术，电子信息技术三个大类。现在，我很高兴和大家谈谈我对生物医学工程的认识及看法。 生物医学工程在国际上做为一个学科出现，始于20世纪50年代，特别是随着宇航技术的进步、人类实现了登月计划以来，生物医学工程有了快速的发展。就生物医学工程的发展渊源，还得追溯到显微镜的发明：17世纪Lee Wenhock发明了光学显微镜，推动了解剖学向微观层次发展，使人们不但可以了解人体大体解剖的变化，而且可以进一步观察研究其细胞形态结构的变化。随着光学显微镜的出现，医学领域相继诞生了细胞学、组织学、细胞病理学，从而将医学研究提高到细胞形态学水平。普通光学显微镜的分辨能力只能达到微米(μm)级水平，难以分辨病毒及细胞的超微细结构、核结构、DNA等大分子结构。而20世纪60年代出现的电子显微镜，使人们能观察到纳米(nm )级的微小个体，研究细胞的超微结构。光学显微镜和电子显微镜的发明都是医学工程研究的成果，它们对推动医学的发展起了重要作用。
生物医学的一个重要的领域，就是大家所熟知的生物影像技术。自从琴伦射线的发现和应用于医学诊断开始，影像学就开始了她的飞速发展，当之无愧得成为了20世纪医学诊断最重要、发展最快的领域之一。50年代X光透视和摄片是临床最常用的影像学诊断方法，而今天由于X线CT技术的出现和应用，使影像学诊断水平发生了飞跃，从而极大地提高了临床诊断水平。即计算机体断层摄影(computed tomography CT),即是利用计算机技术处理人体组织器官的切面显像。X线CT片提供给医生的信息量，远远大于普通X 线照片观察所得的信息。目前，螺旋CT(spiral CT 或helicalet CT)已经问世，能快速扫描和重建图像，在临床应用中取代了多数传统的CT，提高了诊断准确率。医学工程研究利用生物组织中氢、磷等原子的核磁共振(nu clear magnetic resonance)原理。研制成功了核磁共振计算机断层成像系统(MRI)，它不仅可分辨病理解剖结构形态的变化，还能做到早期识别组织生化功能变化的信息，显示某些疾病在早期价段的改变，有利于临床早期诊断。可以认为MRI 工程的进步，促进了医学诊断学向功能与形态相结合的方向发展，向超快速成像、准实时动态MRI、MRA、FMRI、MRS发展。根据核医学示踪，利用正电子发射核素(18F，11C，13N)的原理，创造的正电子发射体层摄影(PET)，是目前最先进的影像诊断技术。美国新闻媒体把PET列为十大医学生物技
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
2014年全国硕士研究生入学统一考试农学门类联考植物生理学与生物化学试题解析 植物生理学 一、单项选择题：1～15小题，每小题1分，共15分。下列每题给出的四个选项中，只有一个选项是符合题目要求的。 1．磷脂酶C作用于质膜上的磷脂酰肌醇二磷酸，产生的胞内第二信使是 A.肌醇二磷酸和三酰甘油 B.肌醇三磷酸和二酰甘油 C.肌醇二磷酸和二酰甘油 D.肌醇三磷酸和三酰甘油 【参考答案】B 【考查知识点】考察植物信号转导系统。 2．植物细胞壁中含量最高的矿质元素是 A.镁 B.锌 C.钙 D.铁 【参考答案】C 【考查知识点】考察细胞壁的成分。 3．植物细胞膜上通道蛋白运输离子的特点是 A.顺电化学势梯度进行，有饱和效应 B.顺电化学势梯度进行，无饱和效应 C.逆电化学势梯度进行，有饱和效应 D.逆电化学势梯度进行，无饱和效应 【参考答案】B 【考查知识点】离子通道的特性
4．当土壤中却钼时，植物通常也表现出 A.缺氮症状 B.缺磷症状 C.缺钙症状 D.缺镁症状 【参考答案】A 【考查知识点】钼是硝酸还原酶的组分，缺乏会导致确氮症状 5．筛管受伤时，能及时堵塞筛孔的蛋白质是 A.扩张蛋白 B.肌动蛋白 C.G蛋白 D.P蛋白 【参考答案】D 【考查知识点】P蛋白的功能 6．根的向重力性生长过程中，感受重力的部位是 A.静止中心 B.根冠 C.分生区 D.伸长区 【参考答案】B 【考查知识点】向重力性的感应部位 7．植物抗氰呼吸途径中的交替氧化酶位于 A.线粒体内膜上 B.线粒体基质中 C.细胞质基质中 D.过氧化物酶体膜上【参考答案】A 【考查知识点】末端氧化酶的位置 8．植物吐水现象说明 A.水分向上运输的动力是蒸腾拉力 B.根系水势高于土壤溶液水势 C.内聚力保持了导管水柱的连续性 D.根系中存在使水分向上运输的压力【参考答案】D 【考查知识点】水分向上运输的动力
感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysS BL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。 BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。 真核原核启动子 原核： 几个常用的启动子和诱导调控表达系统 1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。 https://www.doczj.com/doc/437116090.html,cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。 3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。 4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。 5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。 6.IPTG广泛用于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI 的温度敏感突变体，30℃下抑制转录，42℃开始发挥作用。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定。 7.以λ噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30℃下阻遏启动子转录，42℃下解除抑制开始转录。同样的，PL、PR表达载体需要以cI857(ts)作为表达菌株，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR 启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因
山东中医药大学 生物医学工程专业本科学分制培养方案 （四年制） 一、培养目标与基本要求 （一）总体培养目标 培养适应我国社会主义建设需要的、具有健全人格；具有良好的人文素养和团队合作精神；受到扎实的专业理论和专业技能训练，系统地掌握生物医学工程的基础理论、基本知识和基本技能；具有较强的知识更新能力和创新能力的医工复合型专业人才。毕业后可在医疗器械，医疗保障等相关行业的企事业单位从事工程技术开发、服务、管理和教育等工作，或攻读研究生。 生物医学工程学是理、工、医高度交叉的学科，本专业应以培养高层次，医、工复合型高级人才为目标，毕业生应对生物医学具有较深的理解，对工程技术具有较扎实的实践能力，以及在特定专业领域中具有系统深入的专业技能。 （二）基本培养要求 1、热爱社会主义祖国，拥护中国共产党的领导，掌握马列主义、毛泽东思想、邓小平理论、“三个代表”的重要思想和科学发展观的基本原理，愿为社会主义现代化建设服务，为人民服务，有为国家富强和民族昌盛而奋斗的志向和责任感，具有爱岗敬业、艰苦奋斗、热爱劳动、遵纪守法、团结协作的思想品质，具有良好的社会主义公德和职业道德。 2、比较系统地掌握本学科专业必需的基础理论、基本知识、基本技能与方法，具有独立获取知识、提出问题、分析问题、解决问题的基本能力及开拓创新精神，具有从事本专业实际业务工作和科学研究的初步能力，具有适应相邻专业业务工作的基本能力，具有一定的人文社会科学和自然科学基本理论知识。 3、掌握一定的体育和军事基本知识，掌握科学锻炼身体的基本技能，养成良好的体育锻炼和卫生习惯，接受必要的军事训练，达到国家规定的大学生体育健康和军事训练合格标准，具备健全的心理和健康的体魄，能够履行建设祖国和保卫祖国的神圣义务。 二、业务培养目标及要求 （一）业务培养目标
化学史与化学史教育从诺贝尔化学奖与生理学或医学奖看生物化学的发展 濮 江 王洪凌 （宜宾学院化学与化工学院 四川宜宾 ６４４００７） 摘要 生物化学从诞生那天起就一直是科学研究者追逐的焦点，本文通过生物化学的不同阶段来探索生物化学的发展史，并且通过对诺贝尔化学奖和诺贝尔生理学或医学奖的授奖情况来分析生物化学的发展状况和未来的发展趋势。 关键词 诺贝尔生理学或医学奖 诺贝尔化学奖 生物化学 发展史 化学生物学 生物化学是研究生命现象的化学本质的科学。２０世纪以来发展尤为迅速，展现出一幅美好的前景，越来越多地吸引着来自生物、化学及物理领域的科学研究者们的注意力，成为一门十分活跃的、人们感兴趣的、有发展前途的交叉学科。 从１９０１年第一届诺贝尔奖颁发至今，有许多诺贝尔生理学或医学奖和诺贝尔化学奖得主都是在生物化学领域有突出贡献的科学家。尤其是２０世纪５０年代以后，生物领域的所有获奖成果中，有一半以上与生物化学有关。在诺贝尔化学奖中，也有近三分之一的获奖成果属于生物化学领域。事实足以说明生物化学在生命科学中的重要地位和作用，从总体上来看，生物化学的发展大致可分为４个阶段（见表１）。 表１ 生物化学的发展 时期公元前２２世纪－１８世纪末１８世纪末－１９世纪末１８９７年１９世纪末－２０世纪以来阶段早期的知识积累生理化学生物化学诞生生物化学蓬勃发展 １ 生物化学的萌芽 早在史前，人们就已经在生产、生活和医疗等方面积累了许多与生物化学有关的实践经验。我们的祖先在公元前２２世纪就用谷物酿酒；公元前１２世纪就会制酱、制饴［１］；公元前４至３世纪的柏拉图和亚里士多德对生理学、化学等都非常重视；人们用酸碱中和一类的化学反应解释人体的机能；晋朝的葛洪已经用海藻治疗瘿病（甲状腺肿胀）。公元６世纪，北魏贾思勰记载了在制曲中利用曲的滤液进行酿造，表明对酶的作用已有初步认识；公元７世纪，孙思邈就用车前子、杏仁等中草药治疗脚气病、用猪肝治疗夜盲症［１］；公元１１世纪，北宋沈括有“秋石阴练法”的记载，是一种人尿中提取性激素的古老的生物化学方法；公元１６—１７世纪的海尔蒙特深信酵素参与维持生命的反应过程，认为酵素是一种潜在的形成能力，它能够使种子和生命得以产生。人们对生物化学的认识，仅仅局限于生产和医学实践中的观察和应用，尚未对该领域进行深入的、本质的研究分析，仅是化学家或医疗化学家以化学的观点解释生命现象，这一时期成为生物化学早期的知识积累阶段。 直到１８世纪中叶，法国拉瓦锡首次证实了动物身体的发热是由于体内物质氧化所致，阐明了机体呼吸的化学本质，这是生命科学史上的一个重大发现，也是生物化学发展的一个里程碑。 ２ 生物化学的初期：生理化学阶段 １８世纪后期到１９世纪，生物学已发展为独立的学科，化学也已经形成比较完整的体系。在这期间，一些有创意的科学工作者把生理问题与化学结合起来，用化学的基本原理解释生理现象，尤其注重从化学观点研究植物生理、动物和人体的生理现象，为生物化学的形成做了准备，也使生物化学得以形成成为可能和必然。 １９世纪，科学研究者对生命现象开展了比较广泛的研究，对生命的化学本质的认识有了许多重大进展，为生物化学的形成奠定了基础。如１８１０年盖·吕萨克推导出了酒精发酵的反应式：淀粉→麦芽糖→葡萄糖→酒精。李比希于１８４２年出版了《生物化学》，他用化学理论阐述了动物生理和人体生理的问题。科学家们先后发现了一些生物体中的重要化学物质。１９世纪５０年代巴斯德证明了酒精发酵是微生物引起的，排除了发酵自生论。１９世纪６０年代，德国生理化学家候普·赛勒得到了蛋白质的结晶———血红蛋白，１８７７年第一次提出了“生物化学”一词［１，２］，将其定义为所有与生物分子有关的一切内容。１８９４年，费歇尔首先提出酶的专一性及酶作用的“锁－钥”学说。由于费歇尔是使生物化学成为独立学科的最有功劳的人物，因此，费歇尔被人们誉之为“生物化学之父”。这个阶段的生物化学，实际是用化学的观点研究生物的生理问题，取得了不少成果，如对酶的了解、蛋白质和糖元的发现、胃酸的发现、人体与氧气的关系、维生素的发现、对腺体的初步认识、从激素到胰岛素的发现以及抗生素的发现，等等。 这一时期无论是生物学家还是化学家都还没有从化学的本质上给予生物化学系统的解释，仅仅是对生物体中的一些重要化学物质及其作用有了一定的认识和研究，仅仅属于生理化学阶段，为１９世纪末期形成生物化学这门独立的学科奠定了坚实的