Mabselect Sure ——唯一耐强碱的蛋白A亲和层析介质
在生物药物的生产过程中，为避免细菌、内毒素或病毒的污染，需要对层析系统、介质等进行在位消毒 (SIP)，以保证产品的质量。另外，变性的蛋白、脂类和DNA等分子会不可逆的沉淀在层析柱的顶部而降低柱效和传质速度，从而影响收率和产品质量。
0.1~1N的氢氧化钠可以有效的除菌除热原以及灭活病毒，而且对于沉淀的
蛋白、脂类和核酸具有很好的溶解作用，可以有效的对层析介质进行在位清洗(CIP) 而延长使用寿命，因此使用氢氧化钠进行消毒和清洗成为生物制药生产中SIP/CIP的经典方法。这一点对于内毒素要求极为严格的抗体生产来说尤为重要。
但天然或重组的蛋白A配基对NaOH非常敏感，强碱性条件下易变性或脱落，因此只能选用高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，但清洗的效果远远不如NaOH，而且清洗成本非常高。
天然或重组的蛋白A 配基具有5 个不同的抗体Fc 结合结构域，每个域均可
以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。将其中的B domain 中对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸，得到新的四聚体配基SuRe Ligand，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上，成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质。
Mabselect SuRe 的优点：
a. Mabselect Sure 可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠：使用高达0.5N的氢氧化钠进行在位清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。Mabselect SuRe 介质可使用0.1N NaOH 15min/circle 进行“纯化-清洗”循环200次以上仍保持稳定的载量，对碱的耐受性远远好于其它的蛋白A 亲和层析
介质。
R.Hahn 的研究也表明：与其他蛋白A 亲和介质相比，Mabselect SuRe 具有无可比拟的稳定性，配基脱落最少，寿命最长，而且宿主蛋白HCP的残留比Prosep A低10倍以上。
b. 更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：新的SuRe 配基是一个同型四
聚体配基，避免了不同配基与抗体Fc 段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab 段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。相比以rProtein A 为配基的介质，Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效的避免抗体在低pH 下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低。
c. 不同抗体洗脱所需pH 差异小：由于消除了对抗体Fab 段的亲和作用，使
得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。
d. SuRe 配基稳定性更好：新型的SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定47，纯化
过程中脱落更少 (<10 ppm)，有利于后期泄漏配基的进一步去除。甚至只有1-3ppm的脱落，无需在后续步骤中增加专门去除Sure配基的步骤，即可达到FDA 的蛋白A 配基残留标准。
Mabslect SuRe 介质是市场上唯一耐碱的蛋白A 亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好，这一点已被文献所证实。纯化所得的抗体除蛋白A 泄漏更少、纯度更高之外，其它产品性质(如CHOP、电泳、IEF 等) 和Mabselect介质相当。目前，已有多家大规模抗体生产厂商，将其它蛋白A亲和胶转换为寿命更长、稳定性更好的MabSelect SuRe用于抗体生产。MabSelect SuRe 也成为市场上
销量最大的抗体生产亲和凝胶。
Mabselect Sure ——唯一耐强碱的蛋白A亲和层析介质 在生物药物的生产过程中，为避免细菌、内毒素或病毒的污染，需要对层析系统、介质等进行在位消毒 (SIP)，以保证产品的质量。另外，变性的蛋白、脂类和DNA等分子会不可逆的沉淀在层析柱的顶部而降低柱效和传质速度，从而影响收率和产品质量。 0.1~1N的氢氧化钠可以有效的除菌除热原以及灭活病毒，而且对于沉淀的 蛋白、脂类和核酸具有很好的溶解作用，可以有效的对层析介质进行在位清洗(CIP) 而延长使用寿命，因此使用氢氧化钠进行消毒和清洗成为生物制药生产中SIP/CIP的经典方法。这一点对于内毒素要求极为严格的抗体生产来说尤为重要。 但天然或重组的蛋白A配基对NaOH非常敏感，强碱性条件下易变性或脱落，因此只能选用高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，但清洗的效果远远不如NaOH，而且清洗成本非常高。 天然或重组的蛋白A 配基具有5 个不同的抗体Fc 结合结构域，每个域均可 以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。将其中的B domain 中对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸，得到新的四聚体配基SuRe Ligand，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上，成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质。 Mabselect SuRe 的优点： a. Mabselect Sure 可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠：使用高达0.5N的氢氧化钠进行在位清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。Mabselect SuRe 介质可使用0.1N NaOH 15min/circle 进行“纯化-清洗”循环200次以上仍保持稳定的载量，对碱的耐受性远远好于其它的蛋白A 亲和层析 介质。
2013版 苏微黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒 素M1, 从而对黄曲霉毒素M1样品起到特异性的纯化作用, 过柱净化后的样品液可直接用于高效液相色谱进行黄曲霉毒素M1含量的检测。 亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的, 以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。 【产品性能】 柱吸附能力：≥100ng/支； 回收率：75%~90%。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素M1（AFM1）单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFM1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFM1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFM1与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用乙腈洗脱AFM1，然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品（选配）； 20支/盒，3mL柱管/支 说明书1份； 【所需材料】（不提供） （1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、高速均质器（18000r/min~22000 r/min）；量筒、50mL 玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸（whatman934-AH，直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。 （2）试剂：乙腈（色谱级）、蒸馏水或去离子水。【样品制备及净化】 ----乳：将试样在水浴中加热至35℃~37℃。用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。至少收集20mL试样。----乳粉：称取10g样品（精确至0.01g）,置于250mL 的烧杯中。将50mL已预热到50℃的水加入乳粉中，搅拌溶解。若乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴中放置至少30min，仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20℃，移入100ml容量瓶中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。用中速定性滤纸过滤（根据情况，可使用多层滤纸进行过滤），或者在7000rpm离心15min。至少收集20mL试样。 ----取20mL上样检测。 * 根据需要可以增加样品量，但水溶液的量也应相应增加。 【亲和柱净化】 注意：整个纯化过程尽量不要让柱子干燥！ ----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上； (3ml的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与针筒固定后使用) ----将柱子与气控操作架上的针筒连接固定，20mL 处理后的溶液上样； ----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以 1d/2~3s的速度流出； ----待液体排干后，用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，流速1d/s； ----待液体排干后，上样3mL乙腈，用玻璃样品瓶接洗脱液，流速1d/2~3s； ----洗脱后洗脱液用氮气吹至仅含少量液体，并用流动相稀释，再用于HPLC。 * 使用前，免疫亲和柱恢复至室温（22~25℃）。* 每次上样前都要将上次液体完全排干。 * 洗脱液要用玻璃样品瓶装，且避光保存于-20℃，
生物医学亲和层析相互作用 1概述 亲和层析属于液相色谱,它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原,也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。很多亲和配体具有很高的选择性,将偶联了配体的介质装在柱子中,可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。亲和层析介质主要由三部分组成:配体、间隔壁、基质。配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。根据配体的类型,可以将亲和层析进行分类,如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。在设计和使用亲和层析柱时,偶联配体所使用的基质的类型也很重要。以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。这种基质易于修饰和活化,有利于基质和配体的偶联,并且具有较好的物理化学稳定性,非特异性吸附少。但是这种基质的机械性能较差,在使用时柱压不能太高,分辨率和效率相对于高压系统也较低。对于高压液相亲和层析,可以使用二氧化硅颗粒或者整体柱材料为基质。采用这种基质的亲和层析柱可以用于HPLC或与其他分析方法(如质谱)联合运用。 2亲和层析应用的常见方式 首先,要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。将处理好的样品上到亲和层析柱上,与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出;然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂,使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。根据目标分子的性质,可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。亲和层析的分离过程简单、快速,具有较高的选择性,广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。另外,除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外,同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。如在蛋白组学的研究中,可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白,再研究低丰度蛋白。 3凝集素亲和层析 凝集素是一种非免疫来源的蛋白质,能识别并结合特定类型的糖基,广泛分布于植物、动物和微生物中。凝集素亲和层析以偶联了凝集素的基质为固定相,常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、榴莲凝素等,它
蛋白纯化原则和技术概览 无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。因此，蛋白纯化非常重要。纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。 ?样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理； ?中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法； ?精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 蛋白纯化指导原则 1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够； 表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法； 可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。 3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况； 4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多； 5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质； 6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。 蛋白纯化方法 由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。 1 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
2013版 苏微黄曲霉毒素B1免疫亲和柱 使用说明书 【产品用途】 黄曲霉毒素B1（AFB1）免疫亲和柱适合于和AFB1酶免分析试剂盒、HPLC或液质结合使用，定量检测AFB1。用该免疫亲和柱净化样品，提高了样品的纯度。纯化后的样品可用不同的分析方法测定。 【适应范围及产品性能】 用于定性、定量检测谷物、粮油、饲料等样本中AFB1时的样本前处理。 柱吸附能力：≥100ng/支（可根据要求选择相应柱容量）； 回收率：75%~90%。 柱内凝胶：Protein A琼脂糖凝胶 特点：载量大，单抗定向偶联，易洗脱，回收率高。 【测定原理】 本产品测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素B1（AFB1）单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFB1经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFB1免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFB1与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用甲醇洗脱AFB1，然后进行相关分析。 【产品组成】 标准品（选配）。 25支/盒，1mL柱管/支；20支/盒，3mL柱管/支。 说明书1份。 【所需材料】（不提供） （1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、高速均质器（18000r/min~22000 r/min）；量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、定量滤纸、玻璃微纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。 （2）试剂：甲醇（色谱级）、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、pH7.0磷酸盐缓冲液（PBS）、吐温-20、蒸馏水或去离子水。【样品制备及净化】 （1）谷物、花生及其制品 ----准确称取25.0g粉碎的样品，加入5.0g氯化钠，----与125.0mL甲醇-水溶液（7+3）混合，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min， ----用定量滤纸过滤， ----准确移取15mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 （2）酱油 ----准确称取50.0g样品，加入2.5g氯化钠， ----加入甲醇-水溶液（8+2）至100mL，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min， ----用定量滤纸过滤， ----准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 （3）醋 ----准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠， ----用pH7.0的磷酸盐缓冲液稀释至25.0mL，混匀， ----用定量滤纸过滤， ----加10.0mL滤液加入10.0mL pH7.0的磷酸盐缓冲液，混匀，用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清，备用。 ----将滤液调至PH为中性。 ----准确移取10.0mL混合液进行过亲和柱。 （4）植物油脂 ----准确称取25.0g样品，加入5.0g氯化钠， ----加入甲醇-水（7+3）至125.0mL，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min， ----用定量滤纸过滤， ----准确移取15.0mL滤液加入30.0mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。 ----准确移取15.0mL混合液进行过亲和柱。 （5）草药、香料及茶叶 ----准确称取25.0g粉碎的样品，加入5.0g氯化钠， ----与125.0mL甲醇-水溶液（7+3）混合，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min， ----用定量滤纸过滤，
第九章亲和纯化技术 一、填空题 1、亲和层析洗脱方法有，，。 2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。 3、亲和层析中常用作分离酶的配基有，，和。 4、亲和层析中非专一性吸附有、、。 5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和 两大方法。 二、选择题 1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是（） A.载体必须能充分功能化。 B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。 C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。 2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是（） A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定 3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作（） A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 竞争洗脱 D. 非竞争洗脱 4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作（） A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 正洗脱 D. 负洗脱 三、名词解释 1、亲和反胶团萃取（Affinity-based resersed micellar extraction）： 2、亲和膜： 3、二次作用亲和沉淀（secondary-effect affinity precipitation）： 4、亲和萃取： 5、亲和吸附剂： 6、负洗脱： 四、问答题
1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？ 2、对亲和层析的公式 L K L V Ve ][100+= 进行说明。设 K L =10-7，求[L 0] （6分） 3、何谓“手臂”？其长短与亲和层析效果有何联系？为什么？ 4、从亲和沉淀的机理和分离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。 第九章 亲和纯化技术（答案） 一、填空题 1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。 2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和 吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、 配基结构 等。 3、亲和层析中常用作分离酶的配基有 酶抑制剂 ， 辅酶 ， 底物 和 底物结构类似物 。 4、亲和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水基团、复合亲和力。 5、亲和过滤指的是将 亲和层析 和 膜过滤技术 结合运用，它包括 亲和错流过滤 和 亲和膜分离 两大方法。 二、选择题 1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是 （ B ） A.载体必须能充分功能化。 B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。 C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。 2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是 （ A ） A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定
抗黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的制备 （黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江省大庆市 163319） （齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省齐齐哈尔市 161006） （北京华安麦科生物技术有限公司，北京市 102200） 摘要：【目的】制备黄曲霉毒素M1污染样品的净化前处理免疫亲和柱。【方法】利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B进行偶联、装柱后通过IC-ELSIA对免疫亲和柱的性能评价确立了最佳反应条件。【结果】免疫亲和柱的有效柱容量为500ng, 经添加回收试验测定的平均回收率为92.46%,变异系数2.3%～7.2%。【结论】利用高纯度抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B制备的免疫亲和柱可应用于乳制品等食品中黄曲霉毒素M1污染度测定的样品快速前处理。 关键词：黄曲霉毒素M1；免疫亲和柱；无血清培养基 Preparation of Immunoaffinity Column for Anti-AFM1 Sun Xing-Rong1，Pei Shi-Chun2，Liu Jia-Peng3，Wang Ying4 (1 Food Science College, HLJ August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China) (2 Food and Biological Engineering College, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China) (3，4Beijing Huaan Magnech Bio-Tech Co., Ltd.,Beijing 102200, China) Abstract:[objective] preparation of aflatoxin M1immunoaffinity column for clean-up contaminated samples. [Method] prepared high-purity anti-aflatoxin M1monoclonal antibody with serum-free medium and coupled with CNBr Activated Sepharose 4B, the column has been evaluated through IC-ELISA and established the optimum reaction conditions. [Results] the capacity of immunoaffinity column was 500 ng , the average recovery of aflatoxin M1was 92.46 %,the variation coefficients were 2.3% ~ 7.2%. [Conclusions] the immunoaffinity columns was prepared by coupling high-purity anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with CNBr Activated Sepharose 4B can be applied to detect contamination samples fast, such as aflatoxin M1 in dairy products. Keywords: aflatoxin M1, immunoaffinity column, serum-free medium 黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF）是食品中广泛存在的一种高致癌性真菌毒素，是Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus 的二次代谢产物, 黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1, AFM1）
亲和层析法纯化胰蛋白酶 一．实验目的 1.理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法； 2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。二．实验原理 亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。这种分子之间的结合能力做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（Ligand），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。 本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH=2-3时，又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10-20倍以上。三．实验方法步骤 1.鸡卵粘蛋白的制备 取蛋清60ml，加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮：三氯乙酸=40:60）后，出现大量白色沉淀，搅匀后室温静置4h以上，待清蛋白完全沉淀，3000rpm 离心10min，弃去沉淀，47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好，置于
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示：
亲和层析 亲和层析原理 生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的应用 点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园 来源：互联网 亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。 1.抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。 另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。 2.生物素和亲和素 生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如
免疫亲和层析技术 Prepared on 24 November 2020
免疫亲和层析技术 原理、目的、仪器、方法、步骤、结果、讨论、体会 一、实验背景 亲和层析技术是纯化各种生物大分子的有效方法。最初是将抗体作为一种结合剂用于免疫亲和层析，根据抗原抗体结合后形成大量多聚体和不溶性基质原理来收集抗原。随后，利用抗体与惰性微珠共价交联,虽然这种反应是一种简单的结合，但抗体的活性因交联缺乏定位作用或抗体的过量交联而丧失。通过研究发现，抗体与蛋白A或蛋白G微珠共价交联后更容易与抗原结合。将具有良好抗原结合特性，且来源广泛的各种单克隆抗体制成免疫亲和层析柱，已成为一种实用和有效的纯化方法。 免疫亲合层析具有以下特点：①抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性,能大量分离天然状态或近似天然状态的抗原；②不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析，但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠；③可按照不同规模进行，半天内即可完成，而且可以获得其他层析法不可比拟的纯化效果；④经过简单的改进，免疫亲和层析法也可用于纯化针对抗原的特异性抗体。 免疫亲和层析是一种既简单又非常有效的分离抗原的技术。即将抗体共价结合到一种惰性的微珠上，然后将微珠与含有待纯化抗原的溶液混合。当抗原被交联在微珠上的抗体捕获后，通过洗涤去除无关的抗原，然后用洗脱缓冲液处理微珠，结合的抗原被洗脱，从而得到纯化的抗原。如果洗脱条件掌握较好而且比较温和，纯化的抗原仍能保持其天然状态。虽然下述的所有实例都是以蛋白质抗原作为研究对象，但凡是能与抗体有效
结合的分子都能用这种方法进行纯化。 只需简单地改变操作程序，免疫亲和层析法同样也可以用来分离经过初步纯化的抗体。此时抗原和抗体所起的作用正好相反，抗原共价交联在微珠上，再与抗体结合，然后通过洗脱，得到纯化的抗体。 在条件合适的情况下，应用免疫亲和层析法通常只需一次就可以达到1000~10000倍的纯化效果。使用性能特别优良的抗体，并且掌握好洗脱条件，也可以达到10000倍以上的纯化效果。 二、实验原理 亲和层析是吸附层析技术的一种。它是近十多年来迅速发展并被广泛用于分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法，具有分离速度快、纯化效率高等优点；尤其适合于含量少、杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子。亲和层析的主要依据是生物分子与其特定的固相化的配基或者配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。生物分子的理化特性使其可以与某些分子发生可逆的特异性结合（如分子间通过氢键等次级键结合，但条件改变后即可分离）的特性。 本实验利用抗原/抗体和相应的抗体/抗原可以发生特异性的结合，而这种结合在一定的条件下可逆的性质将牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗体选择性地结合到固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分离，以此来达到分离纯化抗体的目的。实验所用载体为葡聚糖凝胶，所用交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油。其原理如图所示： 图1. 免疫亲和层析原理图 三、实验目的