基因工程与分子生物学重点
1．限制性核酸内切酶：凡是识别切割双链的DNA分子内特定核苷酸序列的酶称为限制性核酸内切酶，简称为限制性酶。
2．限制性核酸内切酶的一般性质：37℃，pH为7.2~7.6，用Tris—HCl，Gly—NaOH两种缓冲液，Mg2+Buffer，5mM，盐浓度，巯基试剂：β-ME，DTT，BSA（牛血清白蛋白，稳定酶的作用）；决定生产的特定的DNA片段的大小，识别顺序具有180°的旋转对称，识别顺序一般是4~6个碱基，也有6个以上的，但是没有4个以下的，产生三种不同的切口:形成平头末端（SmalⅠ）：连接困难，效率较低；形成5’粘性末端（EcoRⅠ）：相对而言，5’突出尾，3’凹末端；形成3’粘性末端（PstⅠ）相对而言，3’突出尾，5’凹末端。
3．星活性：在非标准条件下（低盐和高pH，高甘油浓度>5%），限制酶识别顺序与切割顺序发生改变的现象。
4．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：将Pol1切下一个小片段失去5’到3’外切酶活性。补平限制酶切割DNA产生3’凹槽（5’到3’合成），用[32p]dNTP补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记，对带3’突出端的DNA进行末端标记（利用置换活性），在cDNA 克隆中，用对和陈那个cDNA的第二条链，在体外诱变中用于从单链模版合成双链DNA，应用Sanger双脱氧末端终止法进行DNA测序，消化限制酶产生的3’突出端，应用于PCR 技术。
5．基因工程的工具酶：T7噬菌体DNA聚合酶，修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，TaqDNA 聚合酶（没有校正功能），大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段，T4噬菌体DNA聚合酶。
6．末端转移酶：将相同的核苷酸依次连接到3’末端，然后两条DNA通过同源多聚尾巴连接在一起，在表达前将ploy(G)切除，否则影响蛋白质的生物活性。
7．T4噬菌体多核苷酸激酶：使DNA的5’端磷酸化，也可以使DNA的5’端去磷酸化。可以发生正向反应，也可发生交换反应。正向反应：5’CTGCAG在酶和ATP（ATP具有α，β，γ磷酸基团，其中γ可给出）的作用下，生成5’pCTGCAG；交换反应：5’pCTGACG在酶和ADP的共同作用下，去磷酸化，将DNA链上的磷酸基团给出，生成5’CTGCAG和ATP，在酶和被标记的A TP作用下使得DNA再次被磷酸化同时被标记，生成ADP和5’*pCTGCAG。
8．基因工程载体种类：质粒，噬菌体的衍生物，科斯质粒或粘粒，噬菌体质粒，单链DNA 噬菌体M13，真核病毒载体，酵母质粒载体，杆状病毒。
9．质粒：在细菌细胞内作为与宿主染色体有别的复制子而进行复制，并且在细胞分裂时能恒定传递给子代细胞的独立遗传因子。
10．质粒作为基因工程载体所必备的条件：1）具有较小的分子量和松弛的复制子，2）基因组上有1~2个筛选标记，便于在平板中区分重组体和非重组体，3）DNA链上有1到几个限制酶的单一识别与切割位点，便于外源DNA的插入，4）具有插入失活（或是插入表达）的筛选标记，便于从平板中直接筛选阳性重组体。
11．Ti质粒：引起植物形成肿瘤—冠瘿瘤的质粒称为诱导肿瘤的质粒。
12．Ti质粒的优点：宿主范围广泛，Ti质粒能过转化所有的双子叶植物，并将外源基因导入植物细胞；整合到宿主细胞ch—DNA上的T—DNA成了染色体的正常遗传成分，永远居留，代代相传；T—DNA上的Opine合成酶基因有一个强大的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。
13．分子杂交（杂交，hybrdization）：核酸研究中一项最基本的实验技术，它是指在一定条件下互补核酸链复性形成双链的过程。
14．分子杂交的原理：(一)DNA的变性：指分子有稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结
构的现象，确切的说是维持双螺旋结果稳定的氢键和疏水键的断裂，DNA变性不涉及到其一级结构的改变；（二）DNA的复性：指变性的两条互补DNA链在适当条件下，全部或部分恢复到天然双螺旋结果的现象，它是变形的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后便可复性，此过程称之为“退火”（annealing）。
15．Southernblot操作技术：将获取得DNA样品进行琼脂凝胶电泳，将琼脂糖凝胶上的DNA 片段按原有的顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA 探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。16．Northernblot操作技术：将获取得RNA样品进行琼脂糖凝胶变性电泳，将琼脂糖凝胶上的RNA按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或RNA 探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。17．Westernblot操作技术：将获取得蛋白质样品进行聚丙烯凝胶电泳，将聚丙酰胺凝胶上的蛋白质带按原有顺序转移到一张硝酸纤维素薄膜上并固定下来，用32P标记的DNA或酶标记的蛋白质探针与之杂交，用发射自显影技术确定任何能与探针DNA或RNA杂交的带。18．原位杂交：转为鉴别阳性重组体而设计的DNA杂交法，若受体DNA是从转化的菌落释放，则原位杂交又称菌落杂交，若受体DNA从转染的空斑释放，则称空斑杂交。基本程序：在硝酸纤维素薄膜上接种转化细胞长出菌落（或空斑）并溶解释放DNA通过变性和干燥，使DNA在原有位置固定，作为杂交的受体DNA，以后的杂交和放射自显影与前两种方法基本相同，原位杂交是鉴别阳性重组体的精确和快速方法，一张硝酸纤维薄膜上筛选的菌落可达到上百个。
19．探针标记：放射性标记：大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段标记合成的寡核苷酸，达成杆菌DNA聚合酶I标记寡核苷酸探针，T4DNA聚合酶标记寡核苷酸探针，末端转移酶标记寡核苷酸探针，T4噬菌体多核苷酸激酶标记寡核苷酸探针；体内标记：生物体的新陈代谢，食物、营养来源标记探针，非放射性标记（成本高，污染小）:地高辛，化学发光素。20．分子克隆：讲一个基因片段插入到另一个载体DNA中，组成重组DNA分子，将它转入到受体细胞中复制扩增，即进行无性生殖，由于这类克隆在分子水平上操作，故称为分子克隆。
21．外源基因导入宿主细胞的方法：1）逆转录病毒感染法：产物用于食品，医药一般不采用该方法，但在科研上效果好；2）DNA显微注射法：在显微镜下，用显微镜将目的基因注射入宿主细胞内，但对宿主细胞的机械损伤较大；3）磷酸钙转染技术：磷酸钙反复转染，是的DNA沉淀下来，易接受外源DNA；DEAE葡聚糖转染技术：DEAE葡聚糖与目的基因共沉淀，易于细胞结合；5）聚阳离子—DMSO转染技术：DMSO较强的去污剂，对宿主细胞有机械损伤，转入宿主细胞内时间过长，机械损伤过大；6）电穿孔技术：电击，产生微小孔洞使得目的基因转入，强度时间的控制很重要，防止致死细胞；7）原生质体融合技术：充足DNA分子包裹在人工膜（脂质体转染）内，然后直至体育宿主细胞融合导入目的基因；8）精子载体介导法：局限性，与卵子结合，受精卵受精成熟的后，鉴定再哪个组织细胞中；9）胚胎干细胞法：胚胎干细胞培养困难，增长传代系数。
22．遗传选择标记：1）胸腺核苷酸基因（tk）：验证生物活性，用HAT培养基（H次黄嘌呤，A氨基嘌呤，T胸腺嘧啶核苷）；2）二氢叶酸还原酶基因（dhfr）：二氢叶酸在二氢叶酸还原酶作用下还原成四氢叶酸，dhfr—不能还原成四氢叶酸，使得细胞死亡；3）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）：氯霉素乙酰转移酶将氯霉素乙酰化，是氯霉素失效，cat—则不能是氯霉素乙酰化，细胞死亡；4）细胞的黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因（ecogpt）；5）细菌的新霉素磷酸转移酶基因（econeo）。
1．哺乳动物基因转移中常用的报告基因：1）人生长激素基因（hGH，humangowthhormone）；2）碱酶基因（alkalinephosphatase）；3）半乳糖甘酶基因（Lacz）；4）荧光素酶基因（luciferas）；
5）绿荧光蛋白基因（GFP，Greenfluorescentprotein）；6）邻苯二酚—2，3—双加氧标志基因（CatO2aseCatechol:Oxygen2,3—oxidoreductase）
2．植物基因工程常用的基因：（一）抗植物病虫病基因：1）Bt基因（苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因）；2）昆虫的蛋白酶抑制剂基因：丝氨酸蛋白酶抑制剂，巯基蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂；3）植物凝集素基因（lectingene）；4）淀粉酶抑制剂基因；（二）抗植物病毒基因：1）cp基因（外援的病毒外壳蛋白基因）；2）病毒复制酶基因；3）病毒卫星RNA 的利用：卫星RNA是多核苷酸，他们有时在其相伴的病毒中被发现，它们按照相伴病毒的复制和传播机制，从一个植株传到另一个植株，它们不与其相伴病毒序列同源，对病毒的复制也不起作用，但卫星RNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力；4）核糖体失活蛋白基因：产物是核糖体失活，影响病毒蛋白质合成；5）干扰素基因；6）缺陷干扰颗粒（defectiveinterfering，DI）指那些序列与亲本病毒相关的，但必须依赖于病毒才能复制的DNA分子，这种分子多存在于动植物病毒中；（三）抗植物真菌病毒基因：1）几丁质酶与β—1，3—葡聚糖酶，几丁质酶降解几丁质（聚N—乙酰胺基葡萄糖），几丁质是构成真菌细胞壁的成分，β—1，3—葡聚糖酶降解β—1，3—葡聚糖，后者也是构成真菌细胞壁的成分；2）植物抗毒素基因；3）RIP基因：核糖体蛋白失活基因，使真菌蛋白不能合成；4）过氧化物基因：木质素由苯基类丙烷醇缩合而成，它可增强细胞壁的强度，增加抗真菌的穿透的压力，而且抗原菌酶的降解，从而限制了真菌酶和毒素向宿主扩散以及水和营养物质从寄主向真菌扩散，过氧化物酶催化苯基类丙烷醇脱氢酶聚合成木质素；（四）抗植物细菌病毒基因：病原菌本身的抗性基因（类似于抗生素）；杀菌肽基因（杀菌性的特异性不强，广谱杀菌）；溶菌酶基因（破坏细菌的细胞壁）。
3．高等植物基因转化方法：根瘤农杆菌—Ti质粒系统；化学刺激法；电脉冲法；基因枪法；电击注入法；脂质体法；直接注射法；激光微束发；超声波法；花粉发。
4．植物基因工程常用遗传选择标记：Npt—II基因（新霉素磷酸转移酶基因或氨基糖苷磷酸转移酶基因，Aph—II），DHFP基因（二氢叶酸还原酶基因）；HPT基因（潮霉素磷酸转移酶基因）；Gent基因（庆大霉素抗性基因）；抗除锈迹的标记基因；争光霉素（博来霉素）抗性基因；Blas（杀稻瘟菌素）；磺胺类药物。
5．PCR技术原理：DNA双螺旋结构的生物功能主要是在与复制和转染，以加热或碱变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双联竭力，形成单链DNA，这称为DNA变性，解除变性条件后，变形的单链可以重新结合起来，形成双链，其原有的活性复原，称为DNA复性，又称退火，变形和复性在一定条件下是完全可逆的。PCR扩增是一种特定区段DNA的复制，遵循DNA生物合成的基本规律，其复制方法是一般保留形式进行的，但PCR中的DNA复制必须有DNA模版，DNA聚合酶，DNA引物和四种dNTP，要扩增模板DNA中的某一片段，需设计一对寡核苷酸引物，它们分别与两条DNA模板链3’末端互补，PCR扩增系统中模板DNA经过高温变性后，分解为两条单链，通过低温退火，引物与模板DNA 结合，形成局部双链，这是DNA复制的固定起点，由此DNA聚合酶可以进行链的延伸，合成与模板互补的链，模板DNA经过高温变性，低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程，每循环一次，模板DNA的拷贝数就增加一倍。
6．PCR反应体系：引物（自行设计），模板（DNA来源），Taq酶（5’到3’聚合酶活性，但没有3’到5’外切酶活性），dNTPs（底物），缓冲液（Buffer，含有一定的离子浓度、pH值），BSA（牛血清白蛋白），Mg2+（Taq酶的辅助性因子）。
7．引物的设计原则：1）引物的长度应在15~30bp（一般为18~25左右，太小或太长均可能致使非特异性配对）；2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免一连串单个碱基或其他不常见的结构；3）GC碱基的含量在45~55%左右；4）两个引物在3’端均必须与模板互补，5’可以不互补；5）引物自身连续互补碱基小于4个（若过长，引物自身回旋，形成二级结构）；
6）引物之间连续互补碱基亦应小于4~5个（防止引物互补配对，形成二聚体）。
8．其他PCR技术：锚式PCR，热巢式PCR，不对称PCR，原位PCR，散体重序列PCR，等位特异性PCR，免疫PCR，AFLP，3’RACE，巢式PCR,反向PCR，RT—PCR，竞争性PCR，高变性引物PCR，竞争引物PCR，RAPD，RFLP，5’RACE。
9．免疫PCR：基因产物在固相中固定，一抗与结合了生物素的二抗结合，结合生物素，在于结合了生物素的DNA模板，进行PCR，得到的产物进行电泳检测。
10．反向PCR：限制性内切酶将DNA片段进行酶切，然后环化，变形并加入根据已知序列合成的引物PCR扩增
11．RT—PCR：将目的基因进行逆转录得到cDNA，合成cDNA的互补链并进行退火，得到双链DNA，一起为模板进行PCR扩增。
12．竞争性PCR：mRNA逆转录成为cDNA，与存在突变位点人工合成的竞争模板cDNA 进行PCR，得到PCR产物通过限制性酶消化，然后酶切产物进行电泳检测。
13．分子生物学：从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核算和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息遗传中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。
14．分子生物学的主要研究内容：核算的分子生物学，蛋白质的分子生物学，细胞信号转到的分子生物学。
15．DNA的结构：在真核生物DNA一级结构中：1）高度重复序列：重复频率高，次数从几十万到几百万次，重复序列较短5~300bp，多数为5~15bp，其中有些是反向重复序列，也称回文序列（palindrome），即该片段的碱基顺序在互补链之间正反读都相同，还有一些反向重复序列、中间被一些不相关的序列隔开，反向重复序列都能形成十字架（交叉）和发卡结构；2）卫星DNA：重复序列的重复单位一般由2~10bp组成，伴随DNA分子存在，重复序列长度不同，可分为小卫星DNA（minisatelletiteeDNA）和微卫星DNA(microsateDNA),相近种属的高度重复序列存在相似性；3）中度重复序列：重复频率和重复序列长度有很大差异，平均长度6*105bp,平均重复350次；4）低度重复序列：又称单拷贝序列，即序列不重复或只重复几次，十几次，重复序列长度大于1000bp，此类序列携带大量能编码各种功能不同蛋白质的遗传信息，也有一些是基因间隔序列。二级结构（B—DNA）：1）两条反相平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋；2）糖与磷酸在外侧形成螺旋的轨迹，彼此通过3’，5’磷酸二酯键相连；3）碱基延伸向内部，其平面与螺旋轴垂直；4)两条核算连依靠彼此碱基之间形成的氢键相连继而结合在一起，且总是A与T，G与C相配对；5）双螺旋的平均直径为2nm，每个螺旋圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nm；6）沿螺旋中心轴方向看去，双螺旋结构上有两个凹槽，一个较深，宽，称为大沟，（majorgroove）,另一个较浅小，称小沟（minorgroove）。
16．类病毒：是高等植物产生疾病的有传染性的因子，由很小的环状DNA分子构成与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染因子，类病毒只由RNA组成，其中广泛存在不完全的碱基配对，形成一种特有的棒状结构，类病毒的基因组不能编码蛋白质。
17．同源重组：一般有成一般性重组，同源重组发生在DNA的同源序列之间，真核生物非姊妹染色单体的变换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转到，结合等都属于这一类。
1．Holliay模型：分支移动，弯曲，旋转导致两种不同的切割：1）两个不同源染色体DNA 排列整齐，2）一个DNA的一条链断裂并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子称为Holliday中间体，3）通过分支移动（branchmignation）产生异源双链（heteroduplex）DNA，4）Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA；切开方式不同，所得到的重组产物也不同，如果切开的链与原来的链断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其
两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体（patchrecombinant），但如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同的亲本DNA，称为拼接重组体（splicerecombinant）。两个DNA分子必须具有75bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率，复制、重组和重组修复是三个密切相关的生物学过程。2．细菌的基因转移主要有四种机制：1）细菌的接合（conjngation）作用：细菌的细胞相互接触是遗传信息可以有一个细胞转移到另一个细胞，称为接合作用。F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100bp，复制起始点为oriV，F质粒可以在细胞内游离存在，也可以整合到宿主染色体内，因此属于附加体（episome）；2）细菌的遗传转化：遗传转化（genetictransformation）是指细菌品系由于吸收了外缘DNA（转化因子）而发生遗传形状的改变现象；3）细菌的转导：转导（trasdution）是通过噬菌体将细菌基因从工体转移到受体细胞的过程。转导的种类有两种：普遍性转导（generalizedtransduction）：宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导（specializedtranstution）：某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA 切割下来代替病毒DNA：4）细菌的细胞融合（cellfusion）：在有些细菌的种属中可以发生有细胞质膜导致的基因转移和重组。
3．转座子（transposableelement）：是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子，也就是一段可以发生转座（trarsposition）的DNA，又称为转座子（trarsposion）。4．大肠杆菌DNA聚合酶I（polI）：（一）生物活性（在Mg2+作用下）：1）5’到3’DNA聚合酶活性；2）5’到3’外切酶活性：从5’切下几个核苷酸是无法修复的；3）3’到5’外切酶活性：从3’切下几个核苷酸可以利用其5’到3’DNA聚合酶活性按互补模版生成；4）RNA酶H活性：可以降解RNA，形成RNA片段；5）置换活性：基1和3结合起来不断切不断合成（可利用放射性同位素标记来检测连接上的碱基）；（二）用途：1）用切口平移法标记DNA （缺刻转移法制备DNA探针、目的、标记DNA用T*）；2）用于cDNA克隆中合成地二条链（往往会缺一段5’，因为有5’到3’外切活性）；3）用于对DNA分子的3’突出尾进行末端标记（用置换活性）。
5．T4噬菌体DNA聚合酶：（一）生物活性：1）5’到3’D NA聚合酶活性；2）3’到5’核苷酸外切酶活性；（二）用途：1）补平或标记限制酶消化DNA后产生3’凹槽；2）对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记；3）标记用作探针的DNA片段；4）将双链DNA的末端转化成平端；5）使结合单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸。
6．分子克隆程序：1基因的分离与合成：1）DNA的提取；2）从原核生物分离纯化目的基因：目的基因的直接分离，鸟枪法克隆目的基因（基因组DNA文库）；3）从真核生物分离纯化目的基因（cDNA文库）：随即引物合成cDNA，从总RNA中提取出mRNA，用digel （t）；消化成线性且齐性，加入人工接头（人工接头包括多种酶切位点）；4）基因的化学合成：磷酸二酯法合成寡核苷酸，磷酸三酯法合成寡核甘酸，固相亚磷酸三酯法合成寡核甘酸，固相合成法；2目的基因片段与载体DNA的连接：1）同源多聚尾巴连接：oligodG—dC尾部连接：末端转移酶能够催化dNTP加到ss或dsDNA在cDNA克隆中加oligodG到载体3’末端，加OligodC到cDNA尾部，使载体和cDNA连接并克隆，大约20个dG：dC所居尾巴就可以连接起来，oligodA—dT尾部连接；2）人工接头连接；3）合成连接一步法；3重组DNA分子导入原核细胞：1）感受态细胞制备（保证低温操作）：确定细胞的生长状态、活化状态（划平板、培养反复）以达到活化菌种，扩培至OD到0.3时（对数生长期），CaCl2反复处理细胞（20mL,10ml,2ml）CaCl2悬浮细胞，离心去除CaCl2，CaCl2使细胞膜上某些通道打开，是的基因进入且CaCl2是冷却的；4阳性重组体的选择：1）平板选择；2）电泳法选择；3）同源重组法筛选；4）免疫学法筛选；5）原位杂交法筛选；6）Southern转印筛选；7）PCR技术；5阳性重组子的鉴定：1）酶切图谱；2）PCR技术；3）分子杂交；4）
测序。
7．分子克隆的方法：（一）直接克隆法：提取、酶切、克隆；（二）构建基因文库法：1）构建基因组文库：从供体生物制备基因组DNA，并用限制酶消化法产生待克隆的DNA片段，在体外将这些DNA片段同适当的λDNA或plasmidDNA连接成重组体DNA分子，导入大肠杆菌所有阳性克隆即构建成基因组DNA文库；2）构建cDNA纹路：通过一系列的酶催化反应使总ploy(A)mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子中，然后在转化到大肠杆菌寄主菌株的细胞内，如此便构建了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库；（三）分子杂交法；（四）化学合成法；（五）差异显示技术：分析物种间差异以及物种间的亲缘关系及进化论；（六）扣除杂交；（七）PCR技术。
8．外源基因在原核细胞中的表达：（一）真核基因在原核中表达的困难：1）细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子；2）从真核基因转录的mRNA缺乏ShineDalgarno序列，不能结合到核糖核蛋白体上；3）真核基因一般含有内含子，而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统，mRNA中的内含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，不能表达真和蛋白质；4）表达的真核蛋白质在原核细胞中不稳定，容易被细菌蛋白酶破环；（二）解决方法：1）讲真和基因克隆到一个强大的原核启动子和Shine—Dalgarno（SD）序列的下游，是真核基因处于原核启动子的控制之下，有真核基因转录的mRNA并转录成cDNA，cDNA有完整的编码序列，但无内含子，在克隆时，讲真和基因插在几个原核密码之后，通过翻译，得到原核多肽和真核基因产物连在一起的融合蛋白；（三）在原核细胞中高效表达外源真核基因的措施：1）调整SD和起始密码之间的距离：Ion—营养缺陷性：Ion次黄嘌呤的缺陷性，次黄嘌呤为蛋白酶合成的原料，蛋白酶不能合成，不能降解非融合蛋白；Pink基因克隆：Pink与目的基因一同表达（在T4噬菌体内）；促进表达的真核蛋白分泌到细胞外面；2）克隆一段原核序列，表达融合蛋白；3）减轻宿主细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平：基因产物的诱导表达（在体内积累诱导物），表达载体的诱导复制，表达蛋白分泌（在细胞内不断表达增大了细胞自身负荷，转移细胞外减少负担）。
9．DNA二级结构的多态性：除B—DNA外，还有一些结构参数有一定差异的双螺旋DNA，如A—DNA，Z—DNA等，这一现象称为DNA结构的多态性，产生的原因在于多核苷酸的骨架含有许可转动的单链，从而使糖环科采取不同的构象：（一）Watson—Crick右手双螺旋结构；（二）A—DNA：当DNA钠盐纤维相对湿度为75%时所处的状态就叫做A—DNA；当DNA钠盐纤维相对湿度为92%是所处的状态就叫做B—DNA；a—dna所形成的右手螺旋比b—dna较大且较平，每旋转一圈的螺旋为2.8nm，每圈包含11个碱基对，直径为2.55nm，每对碱基转角为33°，碱基平面与轴夹角为20°，这样使DNA的大沟窄而极深，而小沟浅，造成这些差异的原因是A—DNA中脱氧核糖残基折叠方式为C3’内折，而B—DNA为C2’内折；（三）Z—DNA：左手双螺旋结构的形式存在于晶体中其中碳与磷原子相连呈锯齿形（Zig—Zag）；（四）三链DNA；（五）四链DNA。
分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
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【课 题】专题一——基因工程——第 1．3 基因工程的应用第 1。4 蛋白质工程的崛起
【教学目标】1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。 3.认
同基因工程的应用促进生产力的提高。 4.举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 5.简述蛋白质
工程的原理。 6.尝试运用逆向思维分析和解决问题。
【教学流程】
一、知识预习：
1、植物基因工程技术主要用于提高农作物的
（如
、
、
、
和
等），以及
和
利用植物生产
等方面。
2、目前防治作物虫害的发展趋势是从某些生物中分离出
，将其导
入
中，使其具有
。用于杀虫的基因主要是
、
、
、
等。
3、引起植物生病的微生物称为
，主要有
、
和
等。抗病转基因植物所采用的基因，使用最多的是
和
；抗真菌转基因植物中可使用的基因有
和
。
4、目前科学家利用一些可以调节
的基因，来提高农作物的抗盐碱和
能力；将鱼的
导入烟草和番茄，提高其耐寒能力；将
导入
作物，使作物抗除草剂。
5、利用转基因技术可以提高生物中的
的含量、延长贮存时间、改变花色等，
从而提高作物品质。
6、动物基因工程可用于
，
，
，
。
7、基因工程药物包括
、
、
、
、
等。
8、治疗遗传病的最有效手段是
，这种方法是把
导入病人体
内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到
的目的，可分为
和
两条途径。
9、基因工程的实质是将一种生物的
转移到另一种生物体内，使后者产生本不能
产生的
，进而表现出
。其缺点是在原则上只能生产
，而天然蛋白质的
符合
的需要，
却不一定完全符合
的需要。
10、蛋白质工程是指以蛋白质分子的
及其与
的关系作为基
础，通过
或
，对
进行改造，或制造
，以满足
的需求。
11、蛋白质工程的途径是：预测蛋白质功能→设计预期的
→推测应有的
→找到相对应的
。
12、蛋白质工程具有
的前景，但
。
-1
现代分子生物学与基因工程作业 姓名________________班级_____________学号________________ 1、绝大多数的真核生物染色体中均含有HI、H2A、H2B、H3和H4五种组蛋白，在不同物种之间它们的保守性表现在（） A．H3和H4具有较高的保守性，而H2A和H2B的保守性比较低 B. H2A和H2B具有较高的保守性，而H3和H4的保守性比较低 C. H1和H4具有较高的保守性，而H3和H2B的保守性比较低 D. H1和H3具有较高的保守性，而H4和H2B的保守性比较低 2、下列叙述哪个是正确的（） A. C值与生物体的形态学复杂性成正相关 B. C值与生物体的形态学复杂性成负相关 C. 每个门的最小C值与生物体的形态学复杂性是大致相关的 C值指一种生物单倍体基因组DNA的总量。不同物种的C值差异很大，随着生物体的进化 3、真核DNA存在于（） A. 线粒体与微粒体内 B. 线粒体与高尔基体内 C. 线粒体与细胞核内 D.细胞核与高尔基体内 E. 细胞核与溶酶体内 4、在核酸分子中核苷酸之间的连接方式是（） A. 2‵-3‵磷酸二酯键 B. 2‵-5‵磷酸二酯键 C. 3‵-5‵磷酸二酯键 D.糖苷键 5、所有生物基因组DNA复制的相同之处是（） A. 半保留复制 B. 全保留复制 C. 嵌合型复制 D. 偶联型复制 6、复制子是（） A. 细胞分离期间复制产物被分离之后的DNA片段 B. 复制的DNA片段和在此过程中所需的酶和蛋白 C. 任何自发复制的DNA序列（它与复制起始点相连） D. 复制起点和复制叉之间的DNA片段 7、在原核生物复制子中，下列哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核酸（） A.DNA聚合酶I B.DNA聚合酶II C.DNA聚合酶III D. 连接酶
基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释 5’Cap 5’-末端帽：有时简称帽，是在许多真核生物mRNA5`-末端发现的一种由7-甲基-鸟嘌呤核苷-5`-ppp –末端核苷构成的特殊构成的特殊结构。它是在转录后不久经酶催反应加入到TATA （Hogness）序列的附近，具有保护mRNA稳定性的功能。在原核生物的mRNA分子中不存在 5`-末端帽结构。 A protein A蛋白：他参与λDNA插入噬菌体头部和在粘性末端（cos）位点上裂解多联体DNA 的过程。 abortive lysgeny 流产溶原性：温和噬菌体感染敏感的宿主菌后，既不整合进宿主染色体中，也不进行复制，从而使每一个带有噬菌体的宿主菌分裂产生的两个细胞中，只有一个是溶原性的。abortive transduction 流产转导：这是得到不稳定转导子的一类转导，区别于得到稳定转导子的完全转导。在流产转导中，转导子分裂产生两个细胞时，只有其中的一个获得供体基因，另一 个细胞则仍属受体基因型。 Abundance of an mRNA mRNA丰度：是指每个细胞平均拥有的某一种特定mRNA的分子数,跟据丰度的差异可将分为两种不同的等级：其一是富裕型的，每个细胞拥有的平均考贝数为1000——10000，属于此型的mRNA约有100种；其二是稀少型的，每个细胞拥有平均考贝数仅有1——10个上下，属于这一类行的mRNA达10000多种。 Abzymes 抗体酶: 应用单克隆抗体技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。 Acceptor splicing site 受体拼接位点: 间隔子的右端和与其相连的表达子的左端之间的接合点。Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS 获得性免疫缺损综合征: 由人类免疫缺损病毒（HIV）引起的一种疾病，他最早于1980年在美国洛杉叽发现。HIV病毒通过血液和精液在人群中传播，感染了这种病毒之后，会使人体出现严重的免疫抑制和淋巴结病（lymphadenopathy）,并增加对机会病原体（opportunistic pathogen）的敏感性。这种综合征是由于HIV病毒的感染以及cd4类T细胞功能破坏所致。T细胞表面CD抗原CDS4是HIV病毒的受体。HIV病毒的感染使T细胞发生融合形成大的合胞体(syncytia)并最终裂解。AIDS是致命的，目前尚无法有效治 疗也无有效疫苗可用。 activator 活化物：1，在分子生物学中，活化物是一种蛋质，结合在某个基因上游DNA的一个位置上，激活从该基因开始的转录。2，在酶学中，活化物是一种小分子，与酶相结合从 而提高酶的催化活性。 Activator 激活物: 能够通过与结合在启动子上的RNA聚合酶发生相互作用，从而促使RNA聚合酶起动操纵子进行转录反应的一种正调节蛋白质。 Adaptor 接头：即DNA接头，是一类人工合成的非自我互补单链寡核苷酸短片段，当其同街接物(linker)自行退火时，就会形成具有一个平末端和一个粘性末端的双链的接头/衔接物结构。因此，同平端DNA分子连接之后，无需用核酸内切限制酶切割，就会提供符合预先设计要求的 粘性末端。 Adenovirus 腺病毒：一种具双链DNA的动物病毒，大小约为36kb。次种病毒在分子生物学研究中占有突出的位置，许多重要的分子生物学事件，诸如RNA剪辑，DNA复制及转录等，，都是腺病毒研究中发现的。现在腺病毒以被改造用作分离哺乳动物基因的克隆载体。Affinity chromatography 亲和层析：一种根据配体与特异蛋白质结合作用原理建立的层析技 术，该法主要应用于分离与纯化特异的蛋白质。 Agarose 琼脂糖：是从红色海藻的琼脂中提取的一种线性多糖聚合物，可用于配置核酸电泳凝胶。当琼脂糖溶液加热至沸点后冷确凝固，便会形成一种基质，其密度石油琼脂糖浓度决定的。可以被琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段的大小范围为0.2——50kb。经过化学上修饰的低熔点
一、名词解释 1、分子生物学 2、基因工程 3、DNA的变性与复性 4、细胞学说 5、遗传密码的简并性 6、DNA半保留复制、半不连续复制 7、SD序列 8、开放阅读框（ORF） 9、多顺反子 10、蓝白斑筛选 11、中心法则 12、限制修饰系统 13、断裂基因 14、单链结合蛋白 15、核酶 16、密码子家族 17、TA克隆 18、PCR 19、SNP 20、操纵子学说 21、DNA重组技术 22、减色效应-增色效应 23、可变剪接 24、反转录 25、同尾酶 26、加帽反应 27、蓝白斑筛选 28、表观基因组学 29、DNA的溶解温度 30、DNA的大C值 31、重叠基因 32、引物酶 33、逆转录 34、限制性内切酶 35、载体的选择标记 36、DNA甲基化
37、端粒 38、端粒酶 39、前导链 40、启动子 41、反式作用因子 42、同义密码子 43、多克隆位点（MCS） 44、基因组计划 45、C值悖论 46、顺式作用元件 47、胸腺嘧啶二聚体 48、寄主的限制修饰现象 49、拓扑异构酶 50、DNA的溶解 51、拓扑异构体 52、间隔基因 53、假基因 54、同源异型蛋白 55、翻译 56、多重PCR 57、抗终止作用 58、SD序列 59、空载tRNA 60、cDNA RACE 61、分子杂交 62、cDNA文库 63、载体 64、RT-PCR 65、反义RNA 66、延伸tRNA 67、起始tRNA 68、探针 69、反式剪接 70、增强子 71、动物基因工程 72、基因组 73、限制性内切酶 74、单顺反子
75、密码子 76、转录 77、RNA干扰 78、中心法则 79、回环模型 80、TATA box 81、前导链 82、目的基因 83、RFLP 84、RACE 二、判断 1、大肠杆菌DNA生物合成中，DNA聚合酶I主要起聚合作用。( ) 2、DNA半保留复制时，后随链的总体延伸方向与先导链的延伸方向相反。( ) 3、原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。（） 4、以一条亲代DNA(3’→ 5’)为模板时，子代链合成方向5’→ 3’，以另一条亲代DNA链 5’→ 3’为模板时，子代链合成方向3’→ 5’。（） 5、RNA的生物合成不需要引物。（） 6、大肠杆菌RNA聚合酶全酶由4个亚基（α2ββ’）组成。( ) 7、大肠杆菌在多种碳源同时存在的条件下，优先利用乳糖。 ( ) 8、在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。（） 9、逆转录同转录类似，二者均不需要引物。（） 10、真核生物染色体核心组蛋白的乙酰化、组蛋白H1的磷酸化，都会使基因得以失活。（） 11、在原核细胞中，起始密码子AUG可以在mRNA上的任何位置，但一个mRNA上只有一个起 始位点。( ) 12、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别mRNA上的密码子。( ) 13、表观遗传效应是不可遗传的。( ) 14、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在有葡萄糖及cAMP较高时。( ) 15、DNA甲基化永久关闭了某些基因的活性，这些基因在去甲基化后，仍不能表达。 （） 16、RNA聚合酶催化的反应无需引物，也无校对功能。( ) 17、基因是存在于所有生命体中的最小遗传单位 18、人类基因组中大部分DNA不编码蛋白质 19、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别 mRNA上的密码子。 ( )
“基因工程与蛋白质工程”知识归纳及试题例析 一、知识归纳 1．与DNA分子相关的酶 名称作用参与的生理过程应用限制性核酸内切 酶 切割某种特定的脱氧核苷酸序列基因工程DNA连接酶连接两个DNA片段基因工程 DNA聚合酶在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧 酸 DNA复制 RNA聚合酶在核苷酸链上添加单个核糖核苷 酸 转录 解旋酶使碱基间氢键断裂DNA复制及转录 逆转录酶以RNA为模板合成DNA逆转录及基因工程 特别注意： （1）限制性核酸内切酶的来源：多数来自原核生物；作用特点：主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用从而达到保护自身的目的；作用结果：形成DNA片断末端。 （2）各种酶都具有专一性，特别是限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开。 2．基因工程的基本操作程序 （1）获取目的基因 ①基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过 克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②基因组文库：基因文库中含有一种生物所有的基因就叫做基因组文库。 ③部分基因文库：含有一种生物的部分基因，就叫做部分基因文库，如cDNA文库。 PCR技术与DNA复制的比较 比较项目PCR技术DNA复制 相 同 点 原理DNA双链复制（（碱基互补配对） 原料四种游离的脱氧核苷酸 条件模板、ATP、酶等 不 同 解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化 场所体外复制主要在细胞核内
点 酶 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶） 细胞内含有的DNA聚合酶结果 在短时间内形成大量的DNA 片段 形成整个DNA分子 （2）基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目 的基因能够表达和发挥作用。 ②一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 ③构建方法 生物 种类 植物细胞动物细胞微生物细胞常用 方法 农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体 细胞 体细胞受精卵原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒 的TDNA上→农杆菌→导 入植物细胞→整合到受体细 胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达 载体提纯→取卵（受精卵） →显微注射→受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态 细胞→重组表达载体与感受 态细胞混合→感受态细胞吸 收DNA分子特别注意：受体细胞中常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物──大肠杆菌、酵母菌等，但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必 需用真核生物酵母菌──需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体，原因是它营 寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟红细胞，原因是它无细胞核和众多的细胞器，不能合成 蛋白质。
《分子生物学与基因工程》 结课论文 Real-Time PCR在分子生物学中的应用 姓名： 学号： 院系： 班级： 任课教师： 二零一二年十二月
Real-Time PCR在分子生物学中的应用 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 摘要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。 关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学 1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR ，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。 自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
分子生物学与基因工程 绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA 的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由上个世纪50 年 代，Watson 和Crick 提出了的DNA 双螺旋模型； 60 年代，法国科学家Jacob 和Monod 提出了的乳糖操纵子模型； 70 年代，Berg 首先发现了DNA 连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA 分子； 80 年代，Mullis 发明了聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction , PCR)技术； 90 年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代” 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用。 核酸概述 1、核酸的化学组成 2、核酸的种类与特点：DNA 和RNA 的区别 1) DNA 含的糖分子是脱氧核糖，RNA 含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）, RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代
替； （3）DNA 通常是双链，而RNA 主要为单链； （4）DNA 的分子链一般较长，而RNA 分子链较短。 3、DNA 作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA 含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA 含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA 含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA 在代谢上较稳定。 （3）DNA 是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。 （4）DNA 通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA 。 （5）在各类生物中能引起DNA 结构改变的化学物质都可引起基因突变。直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA 的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100OC）时，它就失去生理活性。这时DNA 双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。 简而言之，就是DNA 从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA 的变性过程中，它在260 nm 的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA 如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复
高中生物选修3基因工程的应用和蛋白质工程知识点 1.基因工程培育转基因生物的优点： （1）打破了常规育种难以突破的物种之间的界限（生殖隔离） （2）定向改变了生物的遗传性状。 2.基因工程的应用： （1）用于提高动植物生长速度。 （2）用于改善畜产品的品质。 （3）用转基因动物生产药物。 （4）用转基因动物作器官移植的供体。 3.膀胱生物反应器：将外源基因导入到受精卵膀胱上皮细胞进行表达。优点： 雌雄个体都能生产。 4.乳腺生物反应器或乳房生物反应器缺点：只有雌性个体才能生产药物。 5.干扰素：干扰素是动物或人体细胞受到病毒侵染后产生的一种糖蛋白，干扰 素几乎能够抵抗所有病毒引起的感染。 6.基因治疗：是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从 而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 7.基因治疗不能替代原有基因，它替代的是缺陷基因的功能。 8.大肠杆菌是原核生物，生产出来的干扰素没有活性，原核细胞内没有内质网 和高尔基体，只有核糖体，只能合成相应的蛋白质，无法添加糖基，要使干扰素具有活性，还必须经过人工处理，加上糖基。 9.基因诊断：也称DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基 因，从而对特定的疾病进行诊断。 10.基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 11.蛋白质工程的目标：根据人们对蛋白质的特定需求，对蛋白质进行分子设计。 12.天然蛋白质的合成过程：按照中心法则进行的，基因→表达（转录和翻译） →形成氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能。 13.蛋白质工程合成蛋白质的过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白 质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 14.蛋白质工程中进行基因操作的原因： （1）改造过的蛋白质可以遗传。 （2）对基因的改造比对蛋白质直接改造容易操作，难度少的多。 15.蛋白质工程：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关 系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。原理是改造基因，实质是对编码蛋白质的基因进行改造。
分子生物学与基因工程原理复习资料 一、名词解释 1. 分子生物学:是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。 2. 染色体：是细胞在有丝分裂时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。 3. DNA 多态性：是指DNA 序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包 括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism , SNP)和串联重复序列多态性 ( tandem repeats polymorphism )两类。 4. DNA 的半保留复制：DNA 复制过程中，由亲代DNA 生成子代DNA 时，每个新形成的子代DNA 中，一条链来自亲代DNA ，另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 5. 冈崎片段：在DNA 复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成5 3 的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。 6.SNP：single nucleotide polymorphism ，单核苷酸多样性，是基因组DNA 序列中单个核苷酸的突变引起的多态性。 7. “基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核甘酸序列。 8. 获得性遗传：是有机体在生长发育过程中由于环境的影响而不是基因突变所形成的新的遗传性状。 9. DNA 甲基化：是基因的表观修饰方式之一，指生物体在(DNA methyltransferase ，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。 10. CDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，体外合成cDNA，与适当的载体 (常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖 扩增。这样包含着细胞全部mRNA 信息的cDNA 克隆集合称为该组织细胞cDNA 文库。11. 基因组：是指一个细胞或者生物体所携带的全部遗传信息。生物个体的所有细胞的基因组是固定的。 12. 蛋白质组学：指在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 13. 转录组：广义上指某一生理条件或环境下，一个细胞、组织或生物体内所有转录产 物的总和，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA ;狭义上指细胞中转录出来的所有mRNA 的总和。 14. 基因定点突变技术：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列的一
“基因工程与蛋白质工程”知识归纳及试题例析一、知识归纳 名称作用参与的生理过程应用 限制性核酸内切酶切割某种特定的脱氧核苷酸序列基因工程 DNA连接酶连接两个DNA片段基因工程 DNA聚合酶在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧酸DNA复制 RNA聚合酶在核苷酸链上添加单个核糖核苷酸转录 解旋酶使碱基间氢键断裂DNA复制及转录 逆转录酶以RNA为模板合成DNA 逆转录及基因工程特别注意： （1）限制性核酸内切酶的来源：多数来自原核生物；作用特点：主要切割外源DNA，对自身的DNA不起作用从而达到保护自身的目的；作用结果：形成DNA片断末端。 （2）各种酶都具有专一性，特别是限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的碱基之间切开。 2．基因工程的基本操作程序 （1）获取目的基因 ①基因文库：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过克 隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。 ②基因组文库：基因文库中含有一种生物所有的基因就叫做基因组文库。 ③部分基因文库：含有一种生物的部分基因，就叫做部分基因文库，如cDNA文库。 比较项目PCR技术DNA复制 相 同 点 原理DNA双链复制（（碱基互补配对） 原料四种游离的脱氧核苷酸 条件模板、ATP、酶等 不 同 点 解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化 场所体外复制主要在细胞核内 酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内含有的DNA聚合酶 结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子 （2）基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目 的基因能够表达和发挥作用。 ②一个基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 ③构建方法
分子生物学与基因工程试题库（19） 一、选择题（单选或多选）（每题2分，共计20分） 1.核糖体肽链的合成因( )终止 (a)可读框内编码C末端氨基酸的密码子 (b)可读框内存在不对应氨酰tRNA的密码子 (c)浓度太低或缺少特定的氨酰tRNA (d)释放因子(RF)的GTP依赖性作用，防止A位点中终止密码子与氨酰tRNA的错配结合 (e)末端氨酰转移酶的活性，这个酶蛋白通过将一个赖氨酸或精氨酸残基加到新生多肽 C 末端将肽酰tRNA脱乙酰化 2. 因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) (a)J．Lederberg (b)W.Arber (c)H．Smith (d)F.Sanger 3. EDTA是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的 影响 (a)外切酶Ⅲ (b)EcoRI (c)Bal31核酸酶 (d)Pstl 4. 关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( ) (a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞 (b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群 (c)如果a、b两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同 (d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，而且拷贝数和分子量也相同 5. 用SDS-酚来抽提DNA时，SDS的浓度是十分重要的，当SDS的浓度为0．1％时，( ) (a)只能将DNA抽提到水相 (b)只能将RNA抽提到水相 (c)可将DNA、RNA一起抽提到水相 (d)DNA和RNA都不能进入水相 6. 在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型 (a)r+m+rec’ (b)r-m-rec- (C)r-m-rec+ (d)r+m+rec- 7. 微细胞是一种大肠杆菌突变体，( ) (a)它不带任何DNA (b)它的体积为正常细胞的1／10 (c)它带有染色体DNA，但不能表达 (d)它带有质粒DNA，可以表达 8. DNA在中期染色体中压缩多少倍?( ) (a)6倍 (b)10倍 (c)40倍 (d)240倍 (e)1000倍 10000倍 9. 在原核生物复制子中以下哪种酶除去RNA引发体并加入脱氧核糖核苷酸?( ) (a)DNA聚合酶Ⅲ (b)DNA聚合酶Ⅱ (c)DNA聚合酶I (d)外切核酸酶MFl (e)DNA连接酶
分子生物学与基因工程复习提纲 第一章绪论 1、分子生物学简史 理论上的三大发现 生物的遗传物质是DNA DNA双螺旋模型遗传信息 的传递方式 技术上的三大发现 基因操作的工具酶的发现 载体的应用 逆转录酶的发现 2、证明遗传物质是DNA的三大经典实验 肺炎双球菌转化实验 噬菌体感染实验病毒 重建实验 3、1953年，Watson/Crick提出了DNA双螺旋结构模型。 4、遗传信息的传递方式的发现 1961年Monod和Jacob提出Z操纵子学说； 1964年Nirenberg等提出了“三联体密码说”； Crick提出了遗传信息流向和表达的屮心法则。 5、限制性核酸内切酶的定义、特点以及在基因工程中的意义；DNA连接酶 6、克隆载体和表达载体 第二章染色体与DNA 1、核酸、核苷酸、核苷、碱基、嘌呤、嘧啶、DNA、RNA、磷酸二酯键 2、染色体、核小体、组蛋白、非组蛋白 3、基因组大小与C值矛盾、重复序列 4、真核基因组结构的特点；与原核基因组的差异 5、D NA双螺旋结构的要点、氢键、碱基堆集力、A、B、Z型结构 6、超螺旋结构、正/负超螺旋 7、D NA复制、半保留复制、半不连续复制、冈崎片段、拓扑异构酶、Klenmv片段 8、真核生物DNA复制的特点 9、转座、转座子、转座子的分类和共同特点、转座的遗传效应 第三章RNA合成 1、转录、转录泡、有义链、反义链、RNA聚合酶 2、启动子、终止子、增强子、依赖p因子的终止、不依赖p因子的终止 3、原核生物转录的过程 4、真核生物mRNA转录后的加工 5、真核生物成熟mRNA的结构特点
第叫章蛋白质的合成 1、遗传密码、密码子、反密码子、密码子偏好性、简并性 2、起始密码子：AUG终止密码子：UAA、UAG、UGA 3、错义突变、无义突变、同义突变、移码突变 4、t RNA的结构：两个关键部位 3 '端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA; 与mRNA的结合部位一反密码子。 5、S D序列、反SD呼列 6、蛋白质合成过程（翻译的过程） 7、蛋白质转运的机制、信号肽 第五章基因表达调控 1、基因组、管家基因、组成性表达、可诱导基因（奢侈基因）、诱导、阻遏 2、操纵子、顺势作用元件、反式作用因子 3、原核生物基因调控模型 乳糖操纵子调控的机制：阻遏蛋白负调控以及CAP正调控色氨酸操纵子调控的机制：反馈抑制和袞减子调控 4、R NA 干扰、小干扰RNA （siRNA）、微小RNA（miRNA） 第六章基因工程的酶学基础 1、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和反转录酶、DNA修饰酶、外切核酸酶、单链内切核酸酶、RNA酶 2、回文序列、II型限制性内切酶、粘性末端、同工酶、同尾酶、同裂酶 3、T aqDNA聚合酶的特点以及在PCR中的应用 第七章基因工程载体 1、载体、克隆载体、表达载体 2、质粒、噬菌体、柯斯质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体 3、标记基因（报告基因）、插入失活、（X-互补、蓝白斑筛选 4、质粒作为基因工程载体的优点 5、碱变性抽提法提取质粒的原理 6、穿梭载体 第八章基因操作的主要技术原理 1、提取核酸的一般程序 2、碱变性法提取质粒DNA的步骤 3、核酸浓度与纯度测定的方法：紫外吸收 4、核酸电泳：琼脂糖电泳、脉冲场凝胶电泳 第九章0的基因的获収 1、P CR的原理和步骤 2、基因组文库、cDNA文库、鸟枪法、DNA化学合成
基因工程与蛋白质工程 1.利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。 基因工程的四个基本操作步骤是_______________________________、基因表达载体的构建、__________________________和_______________________________。若要获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：人干扰素基因及其启动子、_________________、_________________等。将该基因表达载体导入受体细胞所采用的方法是_________________，为获得能大量产生人干扰素的转基因牛，该基因表达载体应导入的受体细胞是_________________（受精卵、乳腺细胞）。 2．下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答： (1)在基因工程中，A表示_________________，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是______________________________________________________________________ _______________，B表示_________________。 B→D的过程中，若使用的棉花受体细胞为体细胞，⑤表示的生物技术是要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 3.农业科技工作者在烟草中找到了一抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育抗病棉花品系。请回答下列问题： （1）要获得该抗病基因，采用_________________、_________________ 等方法。为了能把该抗病基因转入棉花细胞中，常用的载体是_________________ 。 （2）假如载体切割后，得到的分子末端序列为： 请写出能与该载体连接的抗病基因分子末端是 _________________。 （3）再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去_______棉花细胞，从培养出的植株中____________出抗病的棉花。 （4）该抗病基因在棉花细胞中表达的产物是（） A.淀粉 B.脂类 C.蛋白质 D.核酸 （5）转基因棉花获得的_________________是由该表达产物来体现的。 4．目的基因的分离是基因工程研究中的主要方面和操作关键。下面甲、乙图表示
分子生物学问答题 1、请定义DNA重组技术和基因工程技术 答：DNA重组技术：目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，然后在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。基因工程技术：是除了包含DNA 重组技术外还包括其他可能是生物细胞基因结构得到改造的体系，基因工程是指技术重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2、什么是核小体？简述其形成过程。 答：核小体是染色质的基本结构单位，由~200bpDNA和组蛋白八聚体组成。形成过程：核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bp的DNA组成的。形成核小体时八聚体在中间，DNA分子盘绕在外组成真核细胞染色体的一种重复珠状结构。 3、简述DNA的一、二、三级结构特征。 答：1，DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及排列顺序，表示了该DNA分子的化学成分；2，DNA的二级结构是指两条多核苷酸连反向平行盘绕所形成的双螺旋结构；3，DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。 4、原核生物DNA与真核生物有哪些不同的特征？ 答：原核生物的DNA通常没有重复序列，真核生物却有大量的重复序列；原核生物的大部分序列是编码序列，真核生物却又大量的非编码序列；真核生物DNA末端有端粒结构；真核生物DNA 有核蛋白包裹；真核生物DNA有内含子序列；原核生物DNA转录翻译可同时进行，真核必须运送到细胞核外。 5、DNA复制通常采取哪些方式。 答：一，线性DNA双链的复制：1，将线性复制子转变为环状或者多聚分子；2，在DNA末端形成发卡式结构，使分子没有游离末端；3，在某种蛋白质的介入下（如末端蛋白，terminal protein），在真正的末端上启动复制。二，环状DNA
选修 3 现代生物科技专题出题人：刘秀平审核：高二生物组时间：2013 年12 月28 日班级姓名学号 获取目的基因, 其原因是。 (2) 在乙图中,c 过程在遗传学上称为, d 过程称为,d 过程需以mRNA为模板, 以为原料, 还需要的条件是 ATP、、DNA聚合酶等。第17 周生物作业——基因工程与蛋白质工程 (3) 除了上述两种方法可以获取目的基因外, 请你再写出一种方法： 1. （2010 海南）利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。基因工程的四个基本操作步骤是、基因表达载体的构建、5. 下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。 。 和。若要获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表 达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、、 、和复制原点等。将该基因表达载体导入受体细胞所采用的方法是 （显微注射法、农杆菌转化法），为获得能大量产生人干扰素的转基因牛，该基因表达载体应导入 的受体细胞是（受精卵、乳腺细胞）。 2．下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答： (1) 在基因工程中， A 表示 （1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？，为什么？ ________ ，如果直接从苏云 （2）过程②必需的酶是酶，过程③必需的酶是酶。 金杆菌中获得抗虫基因，①过程使 （3）在利用AB获得C的过程中，必须用切割A 和B，使它们产 用的酶区别于其他酶的特点是 生，再加入，才可形成C。 ________ ，B 表示_______ 。 （4）为使过程⑧更易进行，可用（药剂）处理D。 （2）B→D的过程中，若使用的棉花受体细胞为体细胞，⑤表示的生物技术是植物组织培养技术。 （5）由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率，所以在导入后通常需要进行操作。要确定目的基因( 抗虫基因) 导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作， （6）将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和序 请写出在个体水平上的鉴定过程：。 列上是相同的。 3. 农业科技工作者在烟草中找到了一抗病基因，现拟采用基因工程技术将该基因转入棉花，培育 6. 豇豆对多种害虫具有抗虫能力，根本原因是豇豆体内具有胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI 基因）。 抗病棉花品系。请回答下列问题： 科学家将其转移到水稻体内后，却发现效果不理想，主 （1）要获得该抗病基因，采用、等方法。为了能把该抗 “信号肽”“内质网滞留 要原因是CpTI 蛋白质的积累量不足。经过在体外对CpTI 序列ＣpTI基因信号”序列 病基因转入棉花细胞中，常用的载体是。 基因进行了修饰后，CpTI 蛋白质在水稻中的积累量就得 ① （2）假如载体切割后，得到的分子末端序列为： 到了提高。修饰和表达过程如下图所示： 修饰后的CpTI基因 请写出能与该载体连接的抗病基因分子末端是。 （3）再将连接得到的DNA分子导入农杆菌，然后用该农杆菌去棉花细胞，利用植物请根据以上材料，回答下列问题： （1）CpTI 基因是该基因工程中的____________基因，“信 A ②号肽”序列及“内质网滞留信号”序列的基本组成单位 细胞具有的性进行组织培养，从培养出的植株中出抗病的棉花。 CpTＩ蛋白质 是___________________，在①过程中，首先要用 （4）该抗病基因在棉花细胞中表达的产物是（）A. 淀粉 B. 脂类 C.蛋白质 D. 核酸 _____________酶切开，暴露出_______________再用______________酶连接。 （5）转基因棉花获得的是由该表达产物来体现的。