细胞凋亡诱导剂
在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。
放线菌素D（Actinomycin D）
放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin
可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide
是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白
质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。
Dexamethasone
是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时）
Etoposide
是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine
Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
病毒感染与靶细胞凋亡 【摘要】病毒感染与靶细胞凋亡之间存在着密切的关系,细胞凋亡在维护机体正常功能中发挥着重要作用,宿主细胞的凋亡,导致被感染细胞的死亡和病毒的清除;病毒为了生存与扩散而抑制凋亡。在病毒感染引起细胞凋亡的过程中有许多基因和蛋白得到表达,并参与作用。另外，细胞因子和免疫细胞也直接或间接地参与了该过程。对细胞凋亡与病毒感染关系的进一步研究,为病毒感染性疾病的预防和诊治提供新的思路和手段。 【关键词】细胞凋亡病毒感染 细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）,是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程,是一种生理性细胞死亡。细胞凋亡既可自发产生,也可由特殊介导物在一定条件下诱导产生。 病毒（virus）是一种非细胞型的微生物,个体微小,结构简单,由蛋白质与核酸组成,缺乏产生能量的酶系统,只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖,为 严格细胞内寄生。病毒侵入机体并在易感细胞内复制增殖,与机体发生相互作用的过程称为病毒感染。病毒感染细胞后,宿主细胞对病毒感染表现出不同的反应:（1）细胞无明显变化；（2）因病毒的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE ）,引起细胞损伤、死亡；（3）引起细胞增生,继而使细胞死亡或使细胞继续生长失去生长控制,转化为癌细胞。
越来越多的资料表明,病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系。一方面,病毒感染诱导细胞凋亡。另一方面,病毒感染抑制细胞凋亡。本文就近年来有关病毒感染诱导和抑制细胞凋亡的研究进展做一简述。 1 病毒感染诱导细胞凋亡 病毒感染细胞的凋亡,大多数由病毒编码的蛋白产物直接诱导,其次是病毒感染机体后,刺激机体细胞产生细胞免疫反应间接诱导。其机制是病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡,或由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡，主要有以下几种方式。 1.1 病毒蛋白直接诱导病毒进入机体细胞后,表达一些蛋白将会引起细胞凋亡过程。如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）是获得性免疫缺陷综合征（acquire immune deficiency syndrome,AIDS）病因。当HIV侵入人体后,能选择性地侵犯CD4分子的细胞,CD4分子是HIV包膜蛋白gp120的受体,结合后可激活钙通道,使CD4+细胞胞内Ca2+浓度增高,导致CD4+细胞凋亡。最终引起以CD4分子细胞缺损和功能障碍为中心的严重免疫缺陷,从而导致机会性感染和肿瘤。再如VBV的HBx蛋白、EB病病毒的gp350、HPV病毒的E2和E7蛋白［1，2］。 1.2 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）间接诱导病毒感染机体后,刺激免疫系统,
细胞凋亡和细胞坏死的区别 高考频度：★★★☆☆ 难易程度：★★☆☆☆ 脑缺氧、心缺血、急性胰腺炎、动脉粥样硬化等疾病都是由细胞坏死引起的。近日，厦门大学生命科学学院韩家淮教授课题组的一项研究表明，存在于人体内的一种名为RIP3的蛋白激酶，能够将细胞凋亡转换成细胞坏死，通过调控这种酶的合成，就可以调控细胞的死亡方式。下列有关叙述错误的是 A．从以上分析可知细胞坏死过程中存在基因的选择性表达 B．一些细胞的坏死对人体也有益处，比如被病原体感染的细胞在免疫系统的作用下死亡C．抑制RIP3的活性，能在一定程度上对急性胰腺炎起治疗、防御的作用 D．在人体的癌细胞中，也可能存在控制RIP3合成的基因 【参考答案】B 1．有关细胞凋亡和细胞坏死的叙述正确的是 A．细胞凋亡的速率会因其功能不同而不同 B．被病毒侵染的细胞的清除属于细胞坏死 C．细胞凋亡和细胞坏死都有利于个体的生长发育 D．细胞凋亡和细胞坏死都受环境影响较大，机体难以控制 2．下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是 A．细胞凋亡是一种自然的生理过程 B．细胞坏死是一种病理性变化
C．被病原体感染的细胞的清除是通过细胞坏死完成的 D．蝌蚪尾的消失，是由基因决定的细胞自动结束生命的过程 3．下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的一项是 A．细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的 B．细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的 C．细胞凋亡是基因调控的，细胞坏死是外界因素引起的 D．细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的 4．细胞凋亡也称为细胞编程性死亡，其大致过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A．细胞皱缩、染色质固缩表明细胞处于衰老状态 B．图示过程只发生在胚胎发育过程中 C．吞噬细胞吞噬凋亡小体与细胞膜的流动性密切相关 D．细胞凋亡是由遗传物质控制的，与细胞坏死有明显区别 5．香烟中含有大量的有害物质，如尼古丁等会造成吸烟者肺部细胞的死亡。这种细胞的死亡过程属于 A．生理性死亡 B．正常衰亡 C．细胞坏死 D．细胞凋亡 1．【答案】A 【解析】功能不同的细胞凋亡速率不同，如神经细胞可能一生都不凋亡，口腔上皮细胞则在短时间内发生凋亡，A正确；被病毒侵染的细胞的清除属于细胞凋亡，B错误；细胞凋亡是指由基因控制的细胞自动结束生命的过程，有利于个体的生长发育；细胞坏死是
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
第五章病毒与宿主细胞的相互作用 第一节病毒与宿主细胞的相互作用 1.1病毒感染及病毒性疾病 １.病毒感染(viral infection)：病毒侵入体内并在靶器官细胞中增殖，与机体发生相互作用的过程为病毒感染，有时虽发生病毒感染，但并不形成损伤或疾病。 ２病毒性疾病(viral disease)：感染后常因病毒种类、宿主状态不同而发生轻重不一的具有临床表现的疾病，称为病毒性疾病 ３病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ４显性病毒感染：有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等进入机体，到达靶细胞后大量增殖，使细胞和组织损伤，机体出现明显的临床症状，这样的感染称为显性病毒感染或临床感染；按症状出现早晚、持续时间的长短以及病毒在体内持续存在状态等显性感染又分为急性病毒感染和持续性病毒感染两种。 ５病毒在宿主易感细胞内增殖造成细胞破坏与死亡，这种感染称杀细胞性感染。 ６病毒在细胞内增殖引起细胞变性、死亡裂解的作用称病毒的细胞病变效应（CPE）。 ７细胞凋亡：多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程，是形态上术语。细胞程序性死亡：细胞内特定基因的程序性表达介导的死亡，是功能性术语。 1.2病毒在机体内的散播 局部散播:病毒只在入侵部位感染细胞局部散播。 血行散播：病毒可在入侵局部增殖进入血液经血流或神经系统向全身或远离入侵部位的器官散播。 神经散播：HSV单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）、VZV水痘-带状疱疹病毒、狂犬病病毒。 1.3病毒感染的条件 ａ．病毒的感染性：病毒能够进入敏感细胞内，并能在其中生存的一种特性。取决于病毒的致病性、毒力及病毒的量。（具有种的特异性）。 ｂ．合适的感染途径。 c．宿主的易感染性细胞：跟细胞表面的病毒受体、宿主机体的免疫状态、其他物理分子（如体温、营养及年龄、病毒的致病机制）有关。 1.4病毒的致病机理 病毒对细胞的致病作用包括来自病毒的直接损伤和机体免疫病理应答两个方面。敏感的宿主细胞被病毒感染后，两者相互作用下可表现为：杀细胞性感染；稳定状态感染；细胞凋亡；包涵体的形成；细胞增殖和转化；病毒基因的整合。 1.病毒对细胞的直接致病作用 由于病毒在细胞内增殖，干扰和破坏了宿主细胞的正常代谢，造成细胞死亡即所谓杀细胞效应(cytocidal effect)。 2.机体的免疫应答引起的免疫病理作用 病毒感染细胞后，细胞表面可产生新的病毒抗原，可诱发宿主产生免疫应答，也能造成
细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2
病毒感染呼吸道时机体的固有免疫和适应 性免疫的参与机制 以呼吸道病毒感染为例，当病毒入侵机体时将会产生以下几个阶段的防御反应。 一、呼吸道粘膜以及细胞分泌物的机械和化学屏障 当病毒通过呼吸道入侵机体时，首先遇到由完整粘膜组成的免疫系统第一道防线，黏膜产生阻挡作用的同时还通过纤毛的不断同向摆动，清除粘膜表面的病原体。除机械性作用外，粘膜细胞分泌的多种物质亦可阻挡病毒的入侵。 二、固有免疫细胞和免疫分子的免疫应答作用 当病毒突破机体屏障结构进入体内时，固有免疫细胞和免疫分子启动免疫应答——第二道防线。 首先发挥作用的是游离在血液中小吞噬细胞中性粒细胞，感染发生初期在炎性细胞因子等的作用下，血管内皮细胞表达E-选择素，诱导吞噬细胞表达相应配体，并与血管内壁黏附，沿内皮细胞表面滚动，以致穿越血管内皮，接着在趋化因子作用下向感染灶募集和迁移，聚集在感染灶的吞噬细胞PRR与病毒PAMP识别结合启动吞噬与杀灭作用。 NK细胞通过识别受感染的靶细胞表面HLA-I类分子，激活杀伤
活化受体，与HLA-I类分子表达下降的感染细胞表面相应配体结合，从而产生杀细胞效应。同时通过NKG2D和自然细胞毒性受体识别受病毒感染细胞高表达的相应配体，选择性的杀伤靶细胞。 此外，NKT细胞、B1细胞、γδT细胞、树突状细胞(DC)等也起到了相当重要的免疫应答作用。以上均为固有免疫的参与机制，为感染发生后的96小时内反应，固有免疫将贯穿整个免疫应答过程。 三、T淋巴细胞介导的细胞免疫应答 1.T细胞识别抗原 病毒被DCs吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给初始CD4+ T细胞；而吞噬细胞通过对病毒的吞噬、加工、处理后，以抗原肽-MHC II类分子复合物的形式表达在细胞表面，再将抗原呈递给效应CD4+ T细胞和记忆CD4+ T细胞识别。由此激活由T细胞介导的细胞免疫应答。 被病毒感染的细胞通过表达病毒肽-MHC I类分子分子复合物，被初始CD8+ T细胞识别。 2.T淋巴细胞活化 CD4+ T细胞表面的TCR与ACPs表面的抗原肽-MHC II类分子复合物结合后，以及CD8+ T细胞表面的TCR与靶细胞表面病毒肽-MHC I类分子分子复合物结合后引发第一信号，促进免疫突触的形成，启动信号传导途径，导致T细胞基因表达改变，表达基因编码了介导T细胞生物学效应的蛋白质。同时，T细胞将第一信号整合，直至达
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规
律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定
凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
病毒与细胞凋亡
病毒与细胞凋亡 万文娟 2011302220031 摘要：细胞凋亡的概念、与细胞凋亡有关的病毒和基因、病毒调控细胞凋亡的机制 关键词：病毒细胞凋亡 1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应 生存环境而主动争取的一种死亡过程。根据形态学特征，细胞凋亡可分为三个阶段（1）：第 一阶段为核碎裂阶段，此阶段细胞要经过核固缩、染色质凝聚、胞浆浓缩等变化；第二阶段为凋亡小体形成阶段，包括细胞膜形成泡状突起、突起与胞体分离形成凋亡小体等过程；第三阶段为凋亡小体被临近细胞吞噬或凋亡小体自行降解阶段。 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程 （1）凋亡的启动阶段 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，目前比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。 2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途经：实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。 （2）．凋亡的执行 尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。
细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机
体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小体，抽取其中DNA进行电泳分离，呈现梯状图谱，该图谱做为鉴别细胞凋亡与否的主要指标。但DNA降解并不是细胞凋亡必不可少的改变，Bowen等在细胞凋亡过程中未发现有DNA降解现象，细胞凋亡的另一特征是有新的RNA和蛋白
细胞凋亡诱导剂 在凋亡研究中，成功的诱导细胞凋亡是最关键的前提条件。凋亡诱导试剂多种多样，每种诱导剂均有其敏感的细胞，而不同的细胞也有其最佳的诱导剂。因此，选择合适的、有效的、特异性的诱导剂也就成为至关重要的问题。Biovision公司作为世界主要的凋亡试剂供应商，提供各种不同的凋亡诱导剂供研究者选择。 放线菌素D（Actinomycin D） 放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂(1)。Camptothecin 可以结合并稳固拓普异构酶－DNA复合物，从而达到可逆性的抑制拓普异构酶I活性的目的，而诱导细胞凋亡。可抑制Tat介导的HIV-1的转录。常用于诱导Jurkat、骨肉瘤和肝细胞癌细胞的凋亡。Cycloheximide 是一种非常有效的抗多种酵母和真菌的抗生素，可抑制真核生物蛋白
质的合成，而多数原核生物则无效。在100ug/ml的浓度时可抑制多种霉菌，而对大部分的致病细菌则无抑制作用。通过作用于真核细胞60S核糖体而抑制蛋白质合成的起始和延长过程。常被作为抑制剂用于研究真核生物无细胞蛋白质合成，也被用于阻断体外核糖体依赖的多肽合成。可诱导多种细胞的凋亡。 Dexamethasone 是一种具有抗炎症作用的皮质类固醇，同时具有抗炎症和抗风湿的特性。可抑制血管内皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS），但对cNOS则无效。在主动脉平滑肌细胞通过刺激Na+-K+泵，可加速活化阳离子的转位。一般用于诱导人胸腺细胞凋亡（500-1000nM，37°C 6小时） Etoposide 是拓普异构酶II的抑制剂。是从鬼臼毒素来源的衍生物，主要可以抑制多种肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、小细胞肺癌、恶性淋巴瘤。可用于诱导人T细胞、小鼠胸腺细胞、HL-60细胞凋亡。Staurosporine Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激
细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念： 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法： 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa ）组成， 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
细胞凋亡与免疫 细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜包小泡的一种精确调节的细胞死亡过程，是目前生物界最热门的话题之一。细胞凋亡之所以引起学者们的广泛关注，在于它在保证许多生物的健康生存上起到了十分关键的作用。它在生物的发育过程中塑造了神经系统，并且保证了免疫系统行使正常功能。细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化过程是与免疫细胞的正常死亡相统一的，免疫应答的效应过程也是与靶细胞的死亡相伴随的。细胞凋亡的研究也是免疫学的重要课题。 1.概念 1972年，Kerr首先提出细胞凋亡是不同于坏死的一个主动的自我破坏过程。1980年，Wyllie等在糖皮质激素诱导胸腺T细胞死亡的过程中，观察到一系列形态学和生物化学的变化，与常规坏死不同，认为这是细胞内基因调控发生的有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡（PCD）的概念。作为生命过程中同一个过程的两个方面，凋亡和增生同样不可缺少，二者是辨证统一的。对免疫学来说，细胞凋亡有特殊的意义。免疫系统识别外来异物和自身组织的形成，必须依靠对自身起反应的淋巴细胞的删除，而这种删除主要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过靶细胞凋亡来实现的。细胞凋亡如果出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等）、免疫缺陷等。以下对细胞凋亡的基本机制、信号传导、分子事件及疾病治疗等方面的研究成果综述如下。 （1）基本机制 多细胞动物体内的细胞具有一套相似的酶系统，激活后可以启动细胞凋亡。线虫Caenorhabditis elegans是研究细胞死亡机制的一种很好的生物模型。C.elegans 的三种基因产物：CED-3，CED-4和CED-9对凋亡而言是十分重要的，CED-3和CED-4促使凋亡，CED-9抑制凋亡。CED-3是一种caspase,即一种半胱氨酸蛋白酶，它在天门冬氨酸存在的部位之后切断蛋白。CED-3是一种酶原，通过自身切割而活化。CED-4与CED-3结合并激活CED-3，CED-9与CED-4结合从而阻断CED-4激活CED-3。通常，CED-9与CED-4和CED-3形成复合物是CED-3保持无活性状态。当引起细胞凋亡的刺激发生时，CED-9会分解从而活化CED-3，继而导致细胞死亡。脊椎动物已进化出一整套基因族，类似于C.elegans的死亡基因。哺乳动物的caspase类似于CED-3。Apaf-1是目前唯一已知的哺乳动物体内CED-4类似物。哺乳动物Bcl-2基因族产物与CED-9有关，但包括两个蛋白亚群，一个亚群抑制凋亡，一个亚群促进凋亡。 （2）死亡受体直接介导凋亡机制 从细胞生存环境发出的生存信号和内部感受器对细胞完整性的感知使细胞的凋亡机制随时处于戒备状态。一旦细胞失去与外界的联系或内部发生难以修复的损伤则启