SARS冠状病毒研究概述
[摘要]：本文分为两个部分，第一部分是对SARS冠状病毒在分类学、形态学以分子遗传机制进行一个总体的介绍，第二部分是针对SARS的治疗以及抗SARS病毒新药的研究思路来进行阐述的。
关键词：SARS 冠状病毒治疗新药研究思路
自2002的11月中旬以来，严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome，SARS）首先出现在中国的广东省，接着在中国香港、台湾、加拿大、新加坡、美国和欧洲相继出现，以至演变为一场席卷全球的风暴。这场风暴给整个社会带来了巨大的冲击力，同时给全球经济带来了严重的损失。人们和SARS打起了一场看不到硝烟的战争。在1980年，科学家用了两年的时间发现AIDS的病原是HIV，在2003年，WHO成立了一个由全球10个国家和地区13个实验室组成的合作研究网络，在两个星期后正式宣布一种以前未知的冠状病毒，为引起严重急性呼吸综合症的病原体，并命名为SARS冠状病毒。继SARS病毒分离成功和病毒全基因组测序成功之后，科学家们对SARS的研究主要围绕以下几个方面：用生物信息学方法对SARS 冠状病毒的基因组进行诠释，SARS的诊断和SARS病毒疫苗的研制，寻找抗SARS的药物。下面对研究情况进行概述。
1．SARS病毒概述
1.1SARS病毒的分类学地位
SARS 冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order：Nidovirales),冠病毒科(Family：Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA 病毒，病毒基因组约为30Kb，是所有RNA病毒中最大的基因组。
在SARS病毒以前，人类共发现了大约15种不同的冠状病毒。这些已知的冠状病毒，根据血清学证据和种属发生学规律，分为3 个Group。其中Group1来自牛等动物，Group2包括猪、老鼠等哺乳动物冠状病毒，Group3仅有鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)。2003年5月，《The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronvirus》和《Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory》发表在《Science》上，两篇文章的共同点都是通过对SARS冠状病毒的全基因组的完整测序，来对SARS病毒的基因组注释。文章的作者都认为它的基因组结构和其他3个种群的冠状病毒有一
定相关性，但是，通过比较遗传史和序列比对表明SARS－cov的特征和已知的三类冠状病毒的特征并不完全相似，包括两种人类病毒HCoV-OC43和HCoV-229E在内的几种冠状病毒中的任何一种，它不仅表现有其他冠状病毒共有的特征，还有SARS－CoV本身特有的特征，因此认为新病毒构成了冠状病毒的第4个株系（第4组），是一种新的冠状病毒，从而形成一个独特的group(Paul& Marco,2003)。
同样，发表在New England Medicine的两篇文章也支持了这个观点，在已知的基因片段中，它和已知的冠状病毒核酸水平的同源性不超过50％，而氨基酸水平的同源性在75％左右；在进化树的分析中，与已知的冠状病毒的距离很远(Drosten & Ksiazek,2003)，因此认为这是一个全新的冠状病毒。下图为SARS冠状病毒与其他冠状病毒的种系进化关系图：
图1：种系发生关系图（from Microbiology & Immunology）
1.2SARS冠状病毒的形态与结构
病人样本和培养细胞上清的负染透射电镜扫描显示了多晶体的、密封的冠状病毒颗粒，其直径在60-130nm之间。大部分但并非所有的病毒颗粒显示出这种特征性表面喷射状，酷似中世纪欧洲帝王王冠(crown)的结构，由此而产生了该病毒的名字，正是其“名字” Coronavirus 的来源（corona在拉丁语中=冠状）。下面是冠状病毒的结构图。
图2：冠状病毒结构图(from Kathryn V.,Holmes, 2003)
如上图所示，已知的冠状病毒粒子的包膜上主要有三种糖蛋白：S蛋白、E蛋白和M蛋白。
纤突为Ｓ蛋白（Spike protein）,呈“棒棒糖”状的膜蛋白，由两个domain组成，靠近N 端的部分形成一个球状的domain，靠近C端的部分形成一个穿膜的棒状结构。对已知的冠状病毒的研究已经证明，Spike protein和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关。
M蛋白(Membrane protein)是一种跨膜糖蛋白,其大部分位于包膜内,仅有糖基化的小部分暴露在双层脂质外面,在病毒的包膜形成与出芽（budding）过程中起重要作用。
E蛋白（Envelope protein）是一种相对较小的蛋白，散布在包膜上。
部分的冠状病毒有HE蛋白（Haemagglutinin－esterase），但是SARS冠状病毒是没有HE 蛋白的。
N蛋白（Nucleocapsid phosphoprotein）是冠状病毒中一种重要的结构蛋白，它与病毒的正股RNA紧密结合,构成病毒的核心,核心呈螺旋式结构。它含有其它冠状病毒N蛋白中不存在的核转移的信号序列，研究推测SARS病毒在侵入宿主细胞以后是通过这个核转移信号序列进入到细胞核中，并与宿主DNA发挥其生物学作用（Marco et al，2003）。
下面分别是用Vero E6分离出来的SARS冠状病毒的电鏡照片和它的模式图。
图3：SARS病毒电鏡照片（from Thomas et al，2003）图4：模式图（from Oxford et al，2003）1.3SARS冠状病毒的分子遗传机制
冠状病毒的宿主只限于脊椎动物，包括哺乳动物和鸟类，它与人类和家禽的一系列疾病相关，包括呼吸道、胃肠道、中枢神经系统和肝方面的疾病。然而，动物的冠状病毒可能在动物引起严重的疾病，例如鸟传染性支气管炎病毒（IBV），鼠肝炎病毒（MHV），猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus）等等（Luis，2001），人冠状病毒以前只与轻度疾病相关。在第1组（HcoV-229E）和第2组（HcoV-OC43）中都能找到人冠状病毒（HCoVs），它是轻度的呼吸疾病的一个主要原因（Makela，1998）。它们能偶尔地引起小孩和成人的严重下呼吸道感染及新生儿坏死性小肠结肠炎，SARS冠状病毒似乎是能够引起人类严重疾病的第一个冠状病毒。
冠状病毒是在宿主细胞的细胞质中进行复制的。正股单链RNA基因组的5'端有帽子结构，3'端有PolyA尾巴，具有mRNA的功能和传染性。感染宿主细胞后，其基因组RNA既可作为mRNA翻译出病毒特异性蛋白质，又可作为模板转录互补的负链RNA。
首先，病毒基因组5'端的开放读码框会翻译成一条多肽链，然后被病毒编码的蛋白酶切割为几条非结构蛋白，包括RNA-dependent RNA polymerase （Rep）和ATPase helicase（Hel），通过这些蛋白来完成病毒基因组的复制、亚基因组mRNA的合成。
接着，合成的负链作为模板转录出具有mRNA功能的基因组RNA，同时也可作为其他几种大小不同的亚基因组的模板。这些亚基因组mRNA可以指导合成不同的结构蛋白和非结构多肽。
冠状病毒合成亚基因组mRNA的一个突出的特点是非连续性，从而省略了转录后的修饰剪切过程，这种基因定位的机制到现在还没有完全搞清楚，然而，最近的一些证据表明在它是通过识别基因组5'端的转录调节信号（transcription regulation signal ，TRS），来指导这
种非连续性的亚基因组mRNA的合成的（Marco，2003）。TRS除了在SARS冠状病毒基因组的开头出现一次之外，在基因组的其他位置还出现了六次。根据TRS的背景，再结合计算机分析，计算出SARS冠状病毒粒子将会出现8.3,4.5,3.4,2.5,2.0和1.7kb的mRNA，在对SARS 冠状病毒RNA进行Northern杂交实验中，Paul等用3˙端非翻译区作为探针，分别检测到了8.3kb（对应S蛋白）,1.7kb(N蛋白)，4.5kb(包括x1，x2和E蛋白)，3.4kb(M蛋白和x3),2.5(x4和x5)，实实在在说明了SARS冠状病毒中S、N、E和M等结构蛋白的存在（Paul，2003）。
结构蛋白和基因组RNA复制完成之后，将在宿主细胞内质网处装配，形成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完成其生命周期。下图为冠状病毒细胞内复制模式
图：
图5：冠状病毒细胞内复制模式图（from Microbiology & Immunology）
1.4SARS冠状病毒基因组测序和分析
从香港大学微生物系实验室在世界上第1个报道了SARS可能是由一种新型的冠状病毒所致，至今为止，全世界完成全基因组测序并提交到Genebank 的病毒株已达到11 株（分别为：BJ01、CUHK-W1、CUHK-Su10、HKU-39849、Tor2、Urbani、SIN 系列5 条）。5 月1 日至2 日，加拿大、美国和中国三个研究组分别发表了各自完成测序的病毒株的基因组
分析论文(Paul, Marco& QIN,2003)。
比较美国（CDC,USA）和加拿大（BCCA Genome Centre）已经公开的病毒全基因组序列，发现有很小的差异。美国Urbani株长度为29，727 nt，其5ˊ端多出一段TTATTAGGTTTTTAC（15nt）；加拿大Tor株长度为29，736nt，通过计算机预测，有14个Orf，其3ˊ端多出24个A，中国BJ01病毒株长度为29，725nt。相对于Urbani株，加拿大Tor株其他位置的差别依次为：7919（T→C），16622（T→G），19064（G→A），19183（C→T），20596（A→G），20910（G→T），23220（T→G），24872（C→T），26857（C→T）。
SARS病毒基因组与其他冠状病毒的基因组结构相似，基因组的前三分之二中有2个开放阅读框（ORF）1a和1b，编码RNA聚合酶，ORF 1b的下游是一些编码结构和几种非结构蛋白的基因。以Urbani株为例，它的基因组序列，包含了除RNA聚合酶(Rep)以外的编码信息，自5端到3端共有10个开放性阅读框（如图），其中E和X2有交叉重叠，其余ORF 之间由内含子隔开，S、E、M、NORF为病毒结构蛋白编码基因，分别对应S蛋白（Spike protein），E蛋白（Envelope protein），M蛋白（Membrane protein），N蛋白（Nucleocapsid phosphoprotein），其余为非结构蛋白编码基因。
图6：SARS冠状病毒urbani株基因组结构图（from Paul et al，2003）
通过和其他冠状病毒的S蛋白、E蛋白的序列比较，SARS冠状病毒和其他冠状病毒蛋白之间的相似性都不高，通过冠状病毒之间的蛋白进行种系发育分析，SARS病毒的蛋白都处于一个独立的分支上。可以看出，SARS病毒明显不同于同其他三个冠状病毒群，可能归属于新的冠状病毒群。SARS冠状病毒蛋白与其他类冠状病毒的蛋白的相似性如下表：
图7：冠状病毒蛋白同源性比较（from Paul et al，2003）
对SARS冠状病毒基因组测序所得到的数据，都支持了这样一个观点：SARS病毒并没有和其他的病毒（包括已知的三种冠状病毒）发生过重组或交换事件，据此我们可以推测SARS冠状病毒原来寄生于某一种动物上，通过突变而获得了侵染人类致病的能力，也有可能SARS病毒是从原来一种对人无害的人冠状病毒进化而来。但是最初的实验证明了没有接触过SARS冠状病毒的人血清里面不含针对它的抗体，这个暗示在人体里没有一种与SARS 冠状病毒很相近的但是没有致病性的病毒。要阐明SARS病毒的来源和动物宿主还必须通过进一步的调查、实验和数据分析来获得（Marco，2003）。
而在中国研究组发表的病毒基因组分析论文中，除了对BJ01这病毒株进行注释外，还将其与加拿大、美国和香港科学家完成的4株冠状病毒全基因组测序进行了对比分析。在同其他四株已测定病毒的比较中发现，SARS病毒的S蛋白质（Spike protein）和M蛋白质（membrane protein）具有极强的变异性，在5株病毒中，S蛋白质和M蛋白质的变异点位达到31个，其中有9个点位的变异都能在2株或3株病毒的基因组序列中获得印证。这说明SARS病毒具有极强的变异能力，意味着研究SARS疫苗可能会同研究流感疫苗一样困难重重。
2．SARS病毒引起的非典型性肺炎的治疗方案
目前SARS还缺乏特效的治疗，目前的治疗包括抗病毒治疗如利巴伟林（病毒唑），奥司他伟，血清疗法等；用激素降低免疫系统对肺的损伤；用抗生素治疗潜在的细菌感染；辨证的中西医结合治疗；呼吸机的应用以及应激和ARDS(Acute respiratory distress syndrome)的对症支持治疗等。
我国钟南山院士提出四条有效的临床治疗经验：（1）在起病初期病人出现类似流感症状
科学家确定SARS病毒 Scientists Identify SARS Virus Scientists say they have identified the virus which causes the mysterious, flu-like illness Severe Acute Respiratory Syndrome. Scientists say the corona virus, now identified as the cause of SARS, is part of the same family of viruses that causes the common cold. But they say it is part of a distinct sub-group of corona viruses that do not have the same properties as the ordinary cold. World Health Organization virologist Klaus Stohr said that with the identification of this corona virus, it could now be possible to develop more specific diagnostic tests for the disease. “Now the research can be focused on this virus. The research will help us to develop new drugs,” he said. “Now we can foc us on one pathogen which has been sequenced, which provides additional information for
SARS冠状病毒研究概述 [摘要]：本文分为两个部分，第一部分是对SARS冠状病毒在分类学、形态学以分子遗传机制进行一个总体的介绍，第二部分是针对SARS的治疗以及抗SARS病毒新药的研究思路来进行阐述的。 关键词：SARS 冠状病毒治疗新药研究思路 自2002的11月中旬以来，严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome，SARS）首先出现在中国的广东省，接着在中国香港、台湾、加拿大、新加坡、美国和欧洲相继出现，以至演变为一场席卷全球的风暴。这场风暴给整个社会带来了巨大的冲击力，同时给全球经济带来了严重的损失。人们和SARS打起了一场看不到硝烟的战争。在1980年，科学家用了两年的时间发现AIDS的病原是HIV，在2003年，WHO成立了一个由全球10个国家和地区13个实验室组成的合作研究网络，在两个星期后正式宣布一种以前未知的冠状病毒，为引起严重急性呼吸综合症的病原体，并命名为SARS冠状病毒。继SARS病毒分离成功和病毒全基因组测序成功之后，科学家们对SARS的研究主要围绕以下几个方面：用生物信息学方法对SARS 冠状病毒的基因组进行诠释，SARS的诊断和SARS病毒疫苗的研制，寻找抗SARS的药物。下面对研究情况进行概述。 1．SARS病毒概述 1.1SARS病毒的分类学地位 SARS 冠状病毒(SARS-Cov)，属于巢状病毒目(Order：Nidovirales),冠病毒科(Family：Coronaviridae)，冠状病毒属(Genus：Coronavirus)。根据其基因组结构分类，它属于单链正义RNA 病毒，病毒基因组约为30Kb，是所有RNA病毒中最大的基因组。 在SARS病毒以前，人类共发现了大约15种不同的冠状病毒。这些已知的冠状病毒，根据血清学证据和种属发生学规律，分为3 个Group。其中Group1来自牛等动物，Group2包括猪、老鼠等哺乳动物冠状病毒，Group3仅有鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)。2003年5月，《The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronvirus》和《Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory》发表在《Science》上，两篇文章的共同点都是通过对SARS冠状病毒的全基因组的完整测序，来对SARS病毒的基因组注释。文章的作者都认为它的基因组结构和其他3个种群的冠状病毒有一