目录
摘要 (2)
Abstract (2)
引言.......................... . (3)
1 有机磷农药及其检测方法 (3)
1.1 有机磷农药的基本概况 (3)
1.2 有机磷农药残留的检测方法 (5)
1.3四种有机磷农药简介 (7)
2 样品采集与预处理 (9)
2.1 实验仪器和材料 (9)
2.2 样品的来源与采集 (10)
2.3 样品预处理 (10)
3 四种有机磷农药标准样品的色谱分离 (11)
3.1 流动相比例、流动相pH和流速的选择 (11)
3.2 四种有机磷农药标准样品的色谱图 (11)
3.3 方法学考察 (13)
4 西瓜样品中有机磷农药残留的测定与分析 (15)
4.1 色谱条件 (16)
4.2 测试样品 (16)
4.3 计算四种有机磷农药残留的方法 (17)
4.4 两种西瓜样品的检测结果分析 (17)
5 结论 (17)
致谢 (18)
参考文献 (18)
高效液相色谱法检测西瓜中四种有机磷农药残留
摘要：本文结合高效液相色谱法对青岛市城阳区大润发中销售的西瓜中有机磷农药残留是否超标进行了检测，并结合有机磷农药的结构特点以及性质建立了一种在高效液相色谱法的基础上能够检测四种有机磷农药残留的方法。
关键词：西瓜；检测；农药
Checking out the Four Kinds Of Organic Phosphorus Pesticide Residues In Watermelon By HPLC
Abstract ：In this paper，combined with HPLC method，researched the watermelon of RT-mart supermarket in Chengyang District of Qingdao City. And it established a method combined with the structure characteristics and properties of organophosphorus pesticide to check out four kinds of pesticides.
Key words：Watermelon ;Detection; Pesticide
引言青岛市最近发生了毒西瓜事件，以青岛市胶州市和即墨市为主要城市，共有12个人吃了西瓜后，出现头晕、呕吐等症状，经有关部门鉴定该种西瓜名叫“黑美人”，其中含有农药残留涕灭威，涕灭威是一种有机磷农药。如果食用含有涕灭威超标的食物会使人产生恶心等症状，重者会使人昏迷，甚至死亡。尽管城阳地区还没发生西瓜中有机磷农药超标的事件，但已经引起该地区的人恐慌了，所以研究出一种能够检测西瓜中有机磷农药的现实可行的方法是十分重要的。这是本论文的出发点，所以文对青岛市城阳区大润发所售西瓜中有机磷农药残留进行分析，结合HPLC的原理研究出了能够检测西瓜四种有机磷农药残留的方法。另外，现在基本上没有对青岛市城阳区大润发所售西瓜中有机磷农药残留的研究。所以在有机磷残留方面，本论文对青岛市城阳区大润发所售西瓜的质量评价有很重要的作用。
在我国，检测和分析食品中的有机磷农药残留的方法一般都采用气相色谱法。当用气相色谱法检测物质的含量时，尽管在灵敏度方面要优于液相色谱
法，但是检测部分对热不稳定的农药时，气相色谱法就远远不如液相色谱法容易操作。因为液相色谱法具有对那些热不稳定性物质有较好的检测效果，同时还具有不会浪费过多实验用品和所用时间短的优点。
1 有机磷农药及其检测方法
1.1 有机磷农药的基本概况
1.1.1 有机磷农药的定义和分类
有机磷农药是含磷有机化合物，英文简写为OPPs，大多是磷酸酯或酰胺类的化合物，对动物和人体具有危害作用，在自然条件下可以自行分解。。
现在在我国所有卖农药的地方，有机磷农药品种有很多，大约占我国所有杀虫剂品种总量的百分之三十七，但产量却高的让人难以想象，大约占农药的百分之七十四。有机磷农药可以用在农业上，例如消灭害虫，保护庄稼，但残留在庄稼上的农药会在食物链中的富集，人们吃了含有农药残留的食物便会中毒，这使得人们的身体健康受到影响。有机磷农药的种类非常多，相对应的性能也就很多了。比如化学性质不稳定、杀虫效率高、易氧化、遇热易分解等等。
1.1.2 有机磷农药的基本性质及其残留危害
有机磷农药纯品的颜色大多是白色，呈晶体状态，有机磷农药在工业上也会有很重要的用途，但与农业上用的稍有不同，一般为黄色油状液体，有跟大蒜或韭菜相似的臭味。密度大多比1要大，溶于有机溶剂,在水中基本上没有溶解性，具有较高的沸点，在自然条件下能保存较长时间，但在碱性条件下比较容易分解。在人和动物体内容易蓄积，从而使人和动物中毒。
农药残留（pesticide residues）指的是农药在被人们使用之后在环境中、生物体和农副产品中残存的降解物农药原体、有毒代谢物、农药原体和杂质的总称。
现在人们大多都使用非持久性的有机磷农药，这种有机磷农药有几周至几个月的降解半衰期。有相关数据说明在某种生态环境下有机磷农药的残留期可以很长时间，残留在在植物体内的有机磷农药被人和动物食用后，会在其体内发生蓄积作用。人们如果在很长一段时期内食用农残超标的食物，不仅会危及到自身的身体健康，而且有的甚至会遗传给影响下一代。
1.2 有机磷农药残留的检测方法
现在，有百分之七十九的农药残留是用气相色谱法(英文简写为GC)来检测和分析的，现在许多国家都会用气相色谱法检测和分析食品中的农药残留。当用气相色谱法检测食品中的有机磷农药残留时，具有不会浪费过多实验用品和所用时间短的优点，上文中还提到尽管在灵敏度和精确度方面要优于液相色谱法，但是检测部分对热不稳定的农药时，气相色谱法就远远不如液相色谱法容易操作，另外这是在有熟悉和掌握有关气相色谱法的实验仪器的人来操作的前提下才能保证其较高的精确度，精密度高的仪器会比较贵，而水果蔬菜的保存期又相对较短，这使得在检测农药残留时，人们一般不会选择气相色谱法，所以说气相色谱法一般在实验室才会用得到。
色谱法(Chromatography)是根据分析物质在固定相和流动相之间分配系数的不同而达到分离的目的，由于电信号可以在仪器上显示出来，所以色谱仪是一种采用电信号来代替所测物质的浓度，电信号包括电压和电流等，最后把所测得的电信号接到记录仪上记录下来的分离分析方法。现在，气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法及串联色谱技术是检测有机磷农药残留的主要和首选方法。
高效液相色谱法（HPLC），又称高压液相色谱，它来源于色谱法，与色谱法有着密不可分的联系，高效液相色谱法作的流动相为液体，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入到装有固定相的色谱柱内，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析，是一种非常重要的分离分析技术。
另外HPLC的色谱柱具有重复使用多次而几乎不影响分离效果的特点，经高效液相色谱分析后的样品比较容易回收，同时对样品的破坏坏程度较小。HPLC的缺点是有“柱外效应”。从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头和检测池等）中，如果流动相流型发生变化，从而导致柱效率降低，所以在用高效液相色谱法分析物质时，一定要尽最大可能保证流动相的流型。
1.3 四种有机磷农药简介
1.3.1 马拉硫磷
马拉硫磷又称马拉松，英文名称为malathion ，实验式为C10H19O6PS2，相对分子质量为330.358，化学名称为O，O-二甲基-S-1，2-二(乙氧基羰基)乙基硫代磷酸酯，是一种高效杀虫剂。
马拉硫磷的熔点为2.9-3.7摄氏度，沸点为156-159摄氏度，在15摄氏度时，每升水可以溶解145 mg。在PH值高于7.0时就会失去功效，原因是发生了水解反应，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧所以在运输过程中要注意控制温度。
当人体发生马拉硫磷中毒时，会表现出头痛、恶心和多汗等症状，如果误食的话应立即送往医院，首先对病人进行催吐。如不慎进入到眼睛里，用温水冲洗即可。
1.3.2 敌敌畏
敌敌畏又称二氯松，英文名称为dichlorvos，实验式为C4H7C12O4P ，相对分子质量为221.98，化学名称为O，O-二甲基-O-(2，2-二氯乙烯基)磷酸酯，是一种广泛的高效杀虫剂。
敌敌畏的熔点为-60摄氏度，沸点为74摄氏度，在室温下，每升水可以溶解10g左右，能与大多数有机溶剂混溶。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧所以在运输过程中要注意控制温度。
当人体发生敌敌畏中毒时，会表现出头痛、腹泻和流口水等症状，严重者会动作不自主、瞳孔缩小、脉搏和呼吸减慢，甚至停止。人如果误食，应立即送往医院，首先对病人进行催吐，如果不进行救治，可在数十分钟内死亡。如果皮肤接触到敌敌畏，应最快速用肥皂水反复冲洗。
1.3.3 乐果
乐果又称乐戈，英文名称为dimethoate实验式为C5H12NO3PS2，相对分子质量为229.12 ，化学名称为O，O-二甲基S-(N-甲基氨基甲酰甲基)二硫代磷酸酯，是一类光谱杀虫剂。
乐果的熔点为52-52.5摄氏度，沸点为86摄氏度，微溶于水，溶于大多数有机溶剂。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧，与强氧接触会发生反应。
当人体发生乐果中毒时，会出现中间期肌无力综合症的症状，严重者会呼吸困难，甚至死亡。人如果口服中毒，应立即送往医院，首先对病人用生理盐水反复洗胃。如果皮肤接触到乐果，尽快用流动着的肥皂水及清水反复冲洗。如不慎入眼，提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗，并及时赶往医院就医。1.3.4 对硫磷
对硫磷又称乙基对硫磷，英文名称为Parathion，实验式为C10H14NO5PS，相对分子质量为291.27，化学名称为O，O-二乙基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯，是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂和杀螨剂。
对硫磷的熔点为6.1摄氏度，沸点为157-162摄氏度（在压强为80Pa的条件下），相对密度为1.2656，难溶于水，溶于大多数有机溶剂。在碱性条件下水解很快，在光照条件下相对稳定，但不耐高温，温度过高会发生分解，甚至燃烧，与强氧接触会发生反应。
当人体发生对硫磷中毒时，会出现呕吐、头痛和全身软弱无力等症状，严重者会呼吸困难，甚至死亡。人如果口服中毒，应立即送往医院，首先对病人用
生理盐水反复洗胃。如果皮肤接触到对硫磷，尽快用流动着的肥皂水及清水反复冲。
2 样品采集及预处理
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 实验仪器
配有紫外检测器的HPLC(1100型)，孔径为150×4.6mmi.d 的色谱柱（Zorbax elipse XDB C18），滤膜的厚度为0.45微米，高速组织捣碎机，氮吹浓缩仪，旋转蒸发仪。
2.1.2 实验材料和试剂
甲醇，超纯水，二氯甲烷，无水硫酸钠、氯化钠；马拉硫磷标准样品、敌敌畏标准样品、对硫磷标准样品、乐果标准样品。采用每毫升100微克作为四种有机磷农药的标准浓度。
配制有机磷农药标准实验液步骤：
先用微量进样器量取1mL四种有机磷农药的标准品，然后用甲醇分别定容为每毫升10微克的标准储备液，并放在冰箱里保存备用。(1)从冰箱里取出储备液，用微量进样器量取每毫升10微克的标准储备液1毫升于100毫升容量瓶中，然后用甲醇定容为每毫升0.1微克的混合标准实验液备用； (2) 用微量进样器量取每毫升10微克的混合标准储备液1毫升于20毫升容量瓶中，用甲醇定容为每毫升0.5微克的标准实验液备用； (3) 用微量进样器量取每毫升10微克标准实验液1毫升于10毫升容量瓶中，然后用甲醇定容为每毫升1.0微克的标准实验液备用；(4) 用微量进样器量取每毫升10微克的标准实验液1毫升于10毫升容量瓶中，然后用微量进样器量取1毫升甲醇加到容量瓶中定容为每毫升5.0微克的标准实验液备用；(5) 用微量进样器量取标准储备液1毫升制成每毫升10.0微克的标准实验液备用。
2.2 样品的来源与采集
2.2.1 样品来源
样品取自青岛市城阳区大润发中销售的京欣西瓜和浙江平湖西瓜。
2.2.2 样品的采集
从青岛市城阳区大润发中挑选个头大、品质好的两种西瓜样品各五个，带回实验室。
2.3 样品的预处理
用清水对采集的两种西瓜样品进行清洗，然后用去离子水清洗，用纱布轻轻擦干。取一个京欣西瓜样本其中可以食用的部分用高速组织捣碎机捣碎混匀。取1升匀浆于分液漏斗中进行萃取，剩下的匀浆放入-20摄氏度冰箱长期保存备用，将溶液的PH值调节为中性，加入约40克氯化钠，待氯化钠完全溶解，然后加入二氯甲烷50 毫升于水样中，振荡萃取5 分钟，静置分层后，收集有机相，共萃取 3 次，合并3次萃取液，用无水硫酸钠干燥。将干燥后的萃取液转移到旋转蒸发仪中浓缩至 5毫升，然后在氮吹浓缩仪上继续浓缩至1毫升。浙江平湖西瓜样本的处理过程如京欣西瓜。
3 四种有机磷农药标准样品的色谱分离
3.1 流动相比例、流动相pH和流速的选择
实验选择甲醇:水= 68.5:31.5（体积比），选择中性或微酸性条件下来对流动相pH进行选择，选择 pH 为 6 作为流动相的最优pH;一般的实验流速分为每分钟0.6毫升，每分钟0.8毫升和每分钟1.0毫升，流速对本实验结果影响可以忽略不计，所以用每分钟1.0毫升的流速来进行试验，在此条件下可以对四种农药残留分离和分析。
3.2 四种有机磷农药标准样品的色谱图
在色谱条件下：紫外检测器，流速为每分钟1毫升，流动相pH为6，甲醇:水 = 68.5:31.5（体积比），进样量均为20μL，对不同的浓度下四种有机磷农药标准样品做色谱图。
图3.2-1
1 乐果、
2 敌敌畏、
3 马拉硫磷、
4 对硫磷图3.2-2
1乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷
图3.2-3
1乐果、2 敌敌畏、3 马拉硫磷、4 对硫磷图3.2-4
1 乐果、
2 敌敌畏、
3 马拉硫磷、
4 对硫磷图3.2-5
1 乐果、
2 敌敌畏、
3 马拉硫磷、
4 对硫磷
3.3 方法学考察
3.3.1 工作曲线
从上图的分析结果中可以得出，四种标准有机磷农药的的峰面积与质量浓度的有很好的线性关系，可以满足定量分析的要求。由高效液相色谱仪得出的色谱图，可以观察到四种农药的峰面积，做出峰面积与有机磷农药在不同浓度下时的线性回归，如下图
根据美国EPA，方法检出限为 MDL=S×t(n，1-a)，若对本实验做七次重复试验，置信水平就会达到百分之99，查t 值为3. 14。
T表示自由度为n-1时的Student’s t 值；1-a表示置信水平；S表示n次加标测定浓度的标准偏差；N表示重复测定的加标样品数。
四种农药的线性回归方程、相关系数、最低检出限如下表所示。
表3.3.1-1 四种有机磷农药组分的线性关系和最低检出限
精密度用以表示测量方法的重现性，一般测定 5到10 次，用来说明所测的数据之间相互的接近程度。相对标准偏差（RSD）指的是：标准偏差与计算结果算术平均值的比值，即：相对标准偏差（RSD）=标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）×100%。分析测试结果的精密度一般用相对标准偏差来表示。用微量进样器量取浓度为每毫升9微克的超纯水1毫升，加入浓度为每毫升10微克的标准浓度混合液中，按照3.2的实验方法来分析，进行7次重复试验后得下表。
表3.3.2-1 样品回收率（n=7）
表3.3.2-2 四种有机磷农药的相对标准偏差(RSD) （n=7）
间，说明用高效液相色谱法对样品进行试验的回收率较高；相对标准偏差在百分之三点六至百分之五点七之间,说明用高效液相色谱法对样品进行试验的精密度也很高。
4西瓜样品中有机磷农药残留的测定与分析
4.1 色谱条件
检测器使用紫外检测器；流动相为甲醇和超纯水，使用甲醇：超纯水=67:33作为体积比；流速为每分钟1毫升，进样的体积为20μL；流动相的pH 为7。
4.2 测试样品
对青岛市城阳区大润发所售西瓜进行有机磷农药残留的检测与分析，检测结果如下图。
京欣西瓜液相色谱图
图4.2-2
浙江平湖西瓜液相色谱图
4.3 计算四种有机磷农药残留的方法
测定西瓜样品中有机磷农药残留的浓度，用 c2/c1 =a2/a1进行计算：a1表示标准样品的色谱图上的峰面积；
a2表示被测定样品的色谱图上的峰面积；
c1表示标准样品中有机磷农药浓度，单位为μg/m L；
c2表示被测定样品中有机磷农药浓度，单位为μg/m L。
4.4 两种西瓜样品的检测结果分析
两种西瓜样品检测结果汇总如下
国家标准关于蔬菜和水果农药残留最高限量规定中乐果1.00mg／kg、敌敌畏0.20mg／kg、对硫磷0.00 mg／kg、马拉硫磷0.00 mg／kg。所以两种西瓜四种有机磷农药残留都符合国家标准。
5 结论
使用高效液相色谱法同时检测西瓜中四种有机磷农药的方法是本研究首次采用的。四种有机磷农药可以同时被HPLC分离和制备，pH 为7时的流动相、每分钟流动相的进入量为1.0毫升以及20微升作为进样量时，高效液相色谱法能够分离对硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、乐果这四种有机磷农药。在该条件下，每升1.5微克、每升1.1微克、每升1.0微克、每升1.1微克分别为马拉硫磷、乐果、对硫磷、敌敌畏的最小检出限；回收率在百分之八十四至百分之九十五之间，相对标准偏差为百分之三点七至百分之五点六3.，具有较高的精密度。另外，HPLC测定西瓜中的有机磷农药残留，主要有以下四点优点： (1)相对于流动相来说，以甲醇与水的比为67:33（体积比）为流动相，比用甲醇与水的比为70∶30（体积比）做流动相，有很乐观的分离效果，并且在操作上也更容易。 (2)相对于流动相的 pH 来说，在pH 为6时的流动相下，有机磷农药中的的对硫磷、马拉硫磷、敌敌畏、乐果这四种成分能够分离出来，出来的峰的对称性和峰的个数具有良好的效果。 (3)对于精密度来说，此次实验中，四种有机磷农药残留的相对标准偏差在百分之三点七至百分之五点六之间，所以在精密度上也很高。(4)相对于检出限来说，乐果和对硫磷的检出限每升1.0微
克和每升1.1微克分别为对硫磷和乐果的检出限，检出限降低之后，检测的灵敏度自然就会得到提高。
经过上述实验，说明在检测西瓜中敌敌畏、对硫磷、乐果和马拉硫磷这四种有机磷农药残留时，此种方具有比较乐观的法分离效果，通过四种农药残留的检出限来看，该方法也具有较高的灵敏度。
致谢
现在，本论文基本完成，首先我要深深地感谢我的导师孙萍老师！为了我能顺利完成此篇论文，孙老师花费了很多宝贵的时间，给予了我颇多的耐心，精心指导我完成了本篇论文。在此，我十分感谢孙老师对我的关怀和帮助，感谢导师两年来对我的培育之恩。
本文的研究，大多数工作是在海润农大第三方检测机构和青岛农业大学图书馆完成的，期间多亏了孙萍等老师和好友陈浩东同学、马圣听同学的无私的付出和悉心关怀，我对他们表示深深地感谢。另外，我的父母在我大学期间给于我无私的关怀与照料，无微不至的支持和帮助，这样才使我的学业能够顺利完成。还要感谢在本论文评议、评阅过程中提出宝贵建议的老师、专家，在此献上我真诚的敬意。
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[33] Chen J；Pawliszyn J Solid phase micro-extraction coupled high-performance liquid chromatography [外文期刊]1995（15）.
目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：
2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，
湖南农业大学课程考核试卷 课程号：B473L02900 2016年6月8日 试卷号： A 一、请简述农药残留的定义，以及农产品中农药残留的来源和可能 的危害（10分）。 答：农药残留， 是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒 代谢物、 降解物和杂质的总称。 缺乏正确使用农药的基本知识绝大多数农户仅用农药进行防治，一旦认为防治效果不佳，就加大用药量，结果 使病虫害产生了抗药性。当有了抗药性的病虫害又在危害田间的蔬菜时，就施用更大的药量来防治。如此恶性循环，蔬菜的农药残留就会大大增加。更严重的是有的农户还违章在蔬菜上使用禁、限农药。对使用无公害农药的认识还不够 影响蔬菜质量的农药主要为杀虫剂类农药， 在此类农药中又以有机磷类杀虫剂为主，即三个70%：使用 农药中70%的为杀虫剂；杀虫剂中70%的为有机磷类杀虫剂；有机磷类杀虫剂中70%的为髙毒、剧毒、高残留农药。部分农户认为使药后马上见效的农药就是好农药，而低度的、无公害的生物农药价格高、效果慢 二、请简介农药残留量分析与检测的一般程序，以及农药残留量分析与检测的特点（10分）。 答：一般包括样品采集、样品预处理、样品制备以及分析测定等程序 残留分析需分离和测定的物质是在ng(10-9g)、pg(10-12g)甚至fg(10-15g)水平，一次成功的分析需要有对许多参数的正确理解。例如提取和净化方法的成功与否取决于残留分析人员对操作条件的正确选择和结合。②样品使用农药历史的知 性和样品种类的多样性，造成了分析过程的复杂性。③农药品种的不断增多，对农药多残留分析提出了越来越高的技术适应性要求
高效液相色谱法在水质检测中的应用 摘要：液相色谱仪已广泛应用于水环境监测中，逐步成为常规检测方法，其适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析，具有准确、快速等特点。 关键词：液相色谱仪；水环境监测；有机污染物 1、引言 高效液相色谱法 ( high performance liquid chro-matography，简称 HPLC)，具有下列主要优点：固定相颗粒细且规则均匀，传质阻抗小，组分间分离效率高；利用高压泵输送流动相，大大缩短分析时间；使用高灵敏检测器，提高了检测灵敏度，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，达到了和气相色谱法相媲美的程度，气相色谱法仅适于分析蒸汽压低、挥发性高、沸点低、热稳定性好的样品。在全部已知的有机化合物中仅有20%的样品符合这些条件，近80%的有机化合物属于挥发性低、易受热分解或者大分子化合物，适合于高效液相色谱分析，因此，HPLC 应用前景更为广阔。 在环境监测中，高翔液相色谱法已逐步上升为常用的监测方法，如检测多环芳烃类、酚类、多氯联苯、苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药除草剂等。随着经济的快速发展，人们在获取大量化学物质以满足经济、生产和生活需要的同时，也将一些典型的有毒有害的有机污染物带入环境，其中部分有机污染物已经直接或间接被证明具有致癌、致畸和致突变的作用，给人类健康和自然生态环境带来了严重、持久、潜在的危害。根据发达国家的经验和我国经济发展
伴随的污染现状，有毒有机污染物也必将成为我国环境监测的重要目标。 2、实验部分 2.1主要仪器 岛津公司生产的高效液相色谱仪（LC-20A），包括： (1)CBM-20A—系统控制器； (2)CTO-20A—色谱柱柱温箱； (3)LC-20A—溶液传输单元； (4)SPD-20A—紫外可见光检测器； (5)RF-20A—荧光检测器； (6)SIL-20A—自动进样器； (7)DGU-20A3R—在线脱气机 (8)数据处理：LC-LabSolutions工作站软件。 (9)色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS。 2.2液相色谱原理简介 液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的 一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 2.3建立实验方法 研究液相色谱测定苯系物的实验方法，结合查找的资料及实验验证，确定检测苯系物的实验方法如下： (1) 进样量：10微升；色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS 柱。
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
农药残留对食品安全的影响以及农药残留 检测技术的文献综述 摘要：介绍了农药残留的现状及其对食品安全的影响，同时对农药残留检测技术进行系统的综述，并对今后农药残留检测及控制进行了展望。 关键词：农药残留食品安全检测技术 农药残留是指在农业生产中施用农药后一定时期内残留于生物体、农副产品及环境中微量的农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。残留的数量叫农药残留量，以每千克样本中有多少毫克（或微克、纳克等）表示。农药残留是使用农药后的必然现象，是不可避免的。农副产品上的残留量超过限量，人畜长期食用后会引起慢性中毒或病变，直接或间接影响人们的身体健康。因此，控制降低农药残留，发展农药残留检测技术已成为当前亟待解决的问题。 1农药残留现状及种类 1.1 农药残留的现状 “民以食为天，食以安为先”，农产品的质量安全直接关系到人们的健康和安全。在农业生产中，由于农药、化肥等农业化学投入品的使用，导致农作物严重污染，人们食用农药残留超标的农产品，引起食物中毒的事件经常发生。2010年1 月25 日至2 月5 日，武汉市农业局在抽检中发现来自海南省英洲镇和崖城镇的5个豇豆样品水胺硫磷农药残留超标，消息一出，立即引起社会各方关注，豇豆产地收购价与销售批发价均出现大幅下滑。 农药残留已经成为我国农产品出口的最大障碍，常常被进口国当作借口阻挡在门外，不仅给农户造成经济损失，而且还导致农产品出口竞争力减弱或下降，引起国家之间的经济贸易纠纷。国际市场对出口农产品安全要求很高，从2000 年起，欧盟等国家对农药残留颁布了更严格的标准，从2006 年5 月29 日开始，在日本市场流通的生鲜食品就适用肯定列表制度，一棵白菜要检测20个项目，最多的一种农产品要检测50个项目，合格后才能通关[1]。 农药喷洒在作物上经过一定时间后，由于日晒、雨淋、风吹、高温挥发和植物代谢等的作用，药剂逐渐分解、减少，但不能全部消失，收获的农副产品上仍
乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法 三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三 聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标 准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。本文参考了 以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重 现性以及回收率均符合国家标准。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LC1620高效液相色谱仪（含UV1620紫外-可见检测器1台，P1620高压恒流泵1台，上海 舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）； 三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙 腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。 1.2 标准品溶液配制 精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。 1.3 样品前处理 称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀 后超声提取15min。取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心 5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC测定溶液。 1.4 色谱条件： 色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm) 流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸） 流速：1.0ml/min 波长：240nm 温度：40℃ 进样量：20μl 2 实验结果 2.1 精密度实验 取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰 面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面 积RSD为0.57％。 表1 精密度实验 time（min）Peak High Peak Area NO. Retention 1 11.933 289 4216.8 2 11.990 290 4264.2 3 11.928 287 4246.0 4 11.927 287 4242.8 5 11.923 284 4218.6 RSD(%) 0.23 0.82 0.57
高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
蔬菜中农药残留检测方法研究 【摘要】随着栽培技术的不断进步，农药残留的问题越来越严重，对消费者的身体健康构成了严重威胁。开展蔬菜中农药残留检测方法的研究是控制农药残留保证食品安全的基础，具有重大的意义。本文介绍了蔬菜中农药残留检测的各种方法并对前景进行了展望。 【关键词】蔬菜、农药残留、检测、研究进展 随着栽培技术的不断进步，蔬菜的生长期已越来越短，而随着环境污染的加剧，蔬菜的病虫害也越来越重，绝大部分蔬菜需要连续多次放药后才能成熟上市。农药污染较重的有叶类蔬菜，其中韭菜、油菜受到的污染比例最大。茄果类蔬菜如青椒、番茄等，嫩荚类蔬菜如豆角等，鳞茎类蔬菜如葱、蒜、洋葱等，农药的污染相对较小。农药残留监测体系的建立，对农药残留的监测手段和检测水平提出了更高要求，并促进了农药残留快速检测方法的研究和应用进展，使农药残留检测技术朝着更加快速方便、灵敏可靠的方向发展，逐渐以农药残留专业检测机构的少量检测为中心，向现场检测及实验室的大量检测辐射翻。 1 仪器分析法 由于农药的活性成分大多是小分子有机化合物，故多使用气相色(GC，)~41、高效液相色谱(HPLC，)~、气相色谱一质谱联用(GC-MS)嘲和高效液相色谱一质谱联用(HPLC—Ms)同等技术。其中研究最多的是色质联用技术。因为色质联用特别适合于多种标样残留分析，所以国外把它也划为农药残留快速检测技术之列。大部分农药(如有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等)残留可使用GC—MS检测昀，检出限一般为1～10 b~g／kg，但对分子量较大、极性或热不稳定性太强的农药及其化合物，GC-MS不适用，需采用高效液相色谱一质谱联用(HPLC-MS)和其他的方法来检测。 1．1 固相萃取技术 固相萃取法是1种基于液相色谱分离机制的样品制备方法，已广泛应用于农药残留检测工作。它根据液相分离、解析、浓缩等原理，使样品溶液混合物通过柱子后，样品中某一组分保留在柱中，选择合适的溶剂把保留在柱中的组分洗脱下来，从而达到分离、净化的目的。SPE克服了液一液萃取技术及一般柱层析的缺点，具有高效、简便、快速、安全、重复性好、便于前处理自动化等特点。根据柱中填料大体可分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等)、分配型(c。，c 、苯基柱等)和离子交换型。1L．R_odriguez等人采用固相萃取法通过改变移动相中缓冲液的浓度、pH值、表面活性剂的浓度和类型对蔬菜中的木精、笨基苯酚、锑比灵和有机磷残留量进行分析，结果表明：pH9．2，缓冲液中含有4mmoUL硼酸和75mmol／L胆酸钠能够得到最好的结果。 1．2 固相微萃取 加拿大Waterloo大学Pawliszyn 1990年首创的一种无需溶剂的萃取技术，它是在固相萃取的基础上发展起来的一种新型的预处理技术。SPME技术由固相萃取技术(SPE)发展而来，对目标化合物有较好的选择性，并且有较高的灵敏度，
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
农产品农药残留检测技术 首先，无公害农产品生产过程中控制的重点是农药使用。一是品种控制，二是安全间隔期的控制。其次，无公害农产品标准中检测的重点是农药残留（种植业产品）。 一、农药残留检测技术类别 1.农药残留的生物测定技术 利用指示生物的生理生化反应来判断农药残留及其污染情况。 例如，可以用实验室养的敏感性家蝇为测定材料，以其接触待测样品后的中毒程度来表示该样品中的杀虫剂残留；以病菌生长受抑制的程度来检测杀菌剂的残留，以玉米或其它指示植物根长受抑制的程度来检测土壤中磺酰脲类除草剂残留等。该方法无需对样品前处理比较简单快速或无需进行前处理，但对指示生物要求较高，测定结果不能确定农药品种，并且可能出现假阳性或假阴性的情况，该方法可作为快速检验方法用于农产品引起中毒或在现场使用。 2.农药残留的理化检测 用于农药残留的化学检测方法有分光光度法、极谱法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、色质联用法等。自二十世纪九十年代以来，现代化学分析技术日新月异，许多新技术已进入实用阶段，如毛细管电脉仪技术（CZE，色质联用技术（GC-MS HPLC-MS超临界流体色谱技术（SFC，直接光谱分析技术等。这些新技术的应用，大大提高农药残留分析的灵敏度，简化分析步骤，提高了分析效率。但是，这些分析方法有的灵敏度不高，如分光光度法、薄层层析法等。有的需要昂贵的仪器，如色质联用法、核磁共振波谱法等。还有的需 - 1 - 要特殊的设备，如同位素标记法等。因此，目前，普遍采用的还是气相色谱法和液相色谱法，它们具有简便、快速、灵敏以及稳定性和重现性好，线性范围宽、耗资低等优点。（1 气相色谱法（GC 采用气体作流动相的色谱法，用于挥发性农药的检测，具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速和特点，是农药残留量检测最常用的方法之一，目前用于农药残留
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
农药残留最新检测技术 1.农药残留的生物测定技术 利用指示生物的生理生化反应来判断农药残留及其污染情况。例如，可以用实验室养的敏感性家蝇为测定材料，以其接触待测样品后的中毒程度来表示该样品中的杀虫剂残留；以病菌生长受抑制的程度来检测杀菌剂的残留，以玉米或其它指示植物根长受抑制的程度来检测土壤中磺酰脲类除草剂残留等。该方法无需对样品前处理比较简单快速或无需进行前处理，但对指示生物要求较高，测定结果不能确定农药品种，并且可能出现假阳性或假阴性的情况，该方法可作为快速检验方法用于农产品引起中毒或在现场使用。 2.农药残留的理化检测 用于农药残留的化学检测方法有分光光度法、极谱法、原子吸收光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、色质联用法等。自二十世纪九十年代以来，现代化学分析技术日新月异，许多新技术已进入实用阶段，如毛细管电脉仪技术（CZE），色质联用技术（GC-MS、HPLC-MS）超临界流体色谱技术（SFC），直接光谱分析技术等。这些新技术的应用，大大提高农药残留分析的灵敏度，简化分析步骤，提高了分析效率。但是，这些分析方法有的灵敏度不高，如分光光度法、薄层层析法等。有的需要昂贵的仪器，如色质联用法、核磁共振波谱法等。还有的需要特殊的设备，如同位素标记法等。因此，目前，普遍采用的还是气相色谱法和液相色谱法，它们具有简便、快速、灵敏以及稳定性和重现性好，线性范围宽、耗资低等优点。 （1）气相色谱法（GC） 采用气体作流动相的色谱法，用于挥发性农药的检测，具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速和特点，是农药残留量检测最常用的方法之一，目前用于农药残留检测的检测器主要有电子捕获检测器（ECD）、微池电子捕获检测器（u-ECD）、火焰光度检测器（FPD）、脉冲火焰光度检测器（P-FPD）、氮磷检测器（NPD）等。 （2）液相色谱法（HPLC） 采用液体作流动相的一种色谱法，它可以分离检测极性强、分子量大及离子型农药，可用于不易气化或受热易分解的农药的检测。近年来，采用新型高效固定相、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前和柱后衍生技术、以及计算机联用等，大大提高了检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度。目前用于农药残留检测最多是紫外吸收检测器（UV）、两极管阵列检测器（DAD）和荧光检测器（FLD） （3）色质联用法（GC-MS,HPLC-MS）
八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样
农产品农药残留检测技术 第一，无公害农产品生产过程中操纵的重点是农药使用。一是品种操纵，二是安全间隔期的操纵。其次，无公害农产品标准中检测的重点是农药残留（种植业产品）。 一、农药残留检测技术类不 1.农药残留的生物测定技术 利用指示生物的生理生化反应来判定农药残留及其污染情形。例如，能够用实验室养的敏锐性家蝇为测定材料，以其接触待测样品后的中毒程度来表示该样品中的杀虫剂残留；以病菌生长受抑制的程度来检测杀菌剂的残留，以玉米或其它指示植物根长受抑制的程度来检测土壤中磺酰脲类除草剂残留等。该方法无需对样品前处理比较简单快速或无需进行前处理，但对指示生物要求较高，测定结果不能确定农药品种，同时可能显现假阳性或假阴性的情形，该方法可作为快速检验方法用于农产品引起中毒或在现场使用。 2.农药残留的理化检测 用于农药残留的化学检测方法有分光光度法、极谱法、原子吸取光谱法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、同位素标记法、核磁共振波谱法、色质联用法等。自二十世纪九十年代以来，现代化学分析技术日新月异，许多新技术已进入有用时期，如毛细管电脉仪技术（CZE），色质联用技术（GC-MS、HPLC-MS）超临界流体色谱技术（SFC），直截了当光谱分析技术等。这些新技术的应用，大大提升农药残留分析的灵敏度，简化分析步骤，提升了分析效率。然而，这些分析方法有的灵
敏度不高，如分光光度法、薄层层析法等。有的需要昂贵的仪器，如色质联用法、核磁共振波谱法等。还有的需要专门的设备，如同位素标记法等。因此，目前，普遍采纳的依旧气相色谱法和液相色谱法，它们具有简便、快速、灵敏以及稳固性和重现性好，线性范畴宽、耗资低等优点。 （1）气相色谱法（GC） 采纳气体作流淌相的色谱法，用于挥发性农药的检测，具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速和特点，是农药残留量检测最常用的方法之一，目前用于农药残留检测的检测器要紧有电子捕捉检测器（ECD）、微池电子捕捉检测器（u-ECD）、火焰光度检测器（FPD）、脉冲火焰光度检测器（P-FPD）、氮磷检测器（NPD）等。 （2）液相色谱法（HPLC） 采纳液体作流淌相的一种色谱法，它能够分离检测极性强、分子量大及离子型农药，可用于不易气化或受热易分解的农药的检测。近年来，采纳新型高效固定相、高压泵和高灵敏度的检测器，柱前和柱后衍生技术、以及运算机联用等，大大提升了检测效率、灵敏度、速度和操作自动化程度。目前用于农药残留检测最多是紫外吸取检测器（UV）、两极管阵列检测器（D AD）和荧光检测器（FLD） （3）色质联用法（GC-MS,HPLC-MS） 气相或液相与质谱联用，它既具备了色谱的高分离效能优点，而且具备了质谱准确鉴定化合物结构的特点，可同时达到定性、定量的检测目的，专门适合于农药代谢物、降解物的检