狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）
[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品
李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）
（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）
（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）
【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法
【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02
Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)
1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 110179
2. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015
【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.
【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay
狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。
1.材料和方法
1.1 病毒及细胞病毒株
狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。
1.2 实验动物
昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.3 主要试剂
FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1.4 蚀斑法
1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。
1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。
PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量
1.5 免疫荧光法
1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。
1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。
1.6 小鼠LD50测定法
将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
杆状病毒滴度检测 实验概要 本实验介绍了检测病毒滴度的方法。 实验原理 根据噬菌斑数计算病毒滴度。 工具/原料 ? 1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高压灭菌 ?2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）0.07gNaHCO3 H2O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤 ?supplemented Grace：1×Grace添加 3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤 ? 4. 高温灭活FBS ?主要设备 1. 6孔板 2. 12ml离心管 3. 100ml无菌玻璃瓶 4. 无菌吸管 5. 70℃水浴锅 ?实验材料 杆状病毒，SF9：5×105cells/ml 方法/步骤 1. 1
无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度； 2. 2 将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热； 3. 3 将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。 4. 4 弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。 5. 5 配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）12.5ml 无菌水12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用； 6. 6 弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固； 7.7 将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
狂犬病暴露处置技术培训试题 姓名：单位：分数： 一.填空题（每空1.5分，共30分） 1. 狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2. 狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____ 和 ____ 狂犬病的病原体. 3. 人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受 伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。 彻底冲洗后用涂擦伤口。 4. 狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成 人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。 5. 注射动物源性抗血清前必须严格进行试验。若为阳性，可逐步加量注射，用完全量或改用注射。 二．单选题（每题3分，共30分） 1. 关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A. 狂犬病毒为弹状病毒科 B. 狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D. 在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(Negri Bodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2. Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（） A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3. 狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D. A＋B＋C E. B＋C. 4. 狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5. 发展中国家的狂犬病主要传染源是（） A.狼 B.猫 C.犬 D.患者 6. 狂犬病临床表现有：（）
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。 第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ； 第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL； 第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ； 依次类推… 第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ； 第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ； 换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。 稀释计数法 滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 第一天细胞准备 将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。 第二天加病毒 在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。 吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天追加培养液 在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。 第四天观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X 和Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。 定量PCR 法 病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞。每孔细胞为5×100 000 个。 接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。 弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200 倍，也就是取1 μL 病毒加入到199 μL 的培养基中。在3 个培养孔中分别加入0.5 μL，5 μL 和50 μL 的稀释病毒。 感染开始后20 小时，除去培养上清，换为500 μL 含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2 mL 正常的培养基，继续培养48 小时。 用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在37℃放置1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组DNA 。每个样品管中加入200 μL 洗脱液洗下DNA 。用DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA 可以稳定保存在-20℃至少两个月。 准备PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ： Forward primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Reverse primer （100 pmol/mL）：0.1μL ×n Probe （100 pmol/mL)：0.1μL ×n 水：19.7 μL ×n n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1 mL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix，4 μL forward
一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构
狂犬病防治手册 1．为何要停止生产含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗？ 研究发现，含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗较无佐剂狂犬病疫苗免疫人体后中和抗体的产生晚7天左右。狂犬病疫苗的暴露后免疫是一种应急使用，抗体的产生越早越好。因此，氢氧化铝佐剂对狂犬病的暴露后治疗十分不利。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。狂犬病疫苗中的的氢氧化铝佐剂同样可以导致不良反应增多。因此，2004年12月的人用狂犬病疫苗质量工作会议上，国家食品药品管理局已要求各生产企业在2005年6月30日前停止氢氧化铝佐剂人用狂犬病疫苗的生产。 2．为什么人用纯化狂犬病疫苗禁止臂部肌肉注射？ 因为臂部脂肪较多，疫苗注射后不易扩散，可能会影响免疫效果。因此，要求成人在上臂三角肌注射，儿童最好选择大腿前外侧区肌肉注射。 3．正在接种其它疫苗，是否可以注射狂犬病疫苗？ 正在接种其它疫苗，仍可注射狂犬病疫苗，但接种部位应远离前一种疫苗的接种部位。 4．使用疫苗的同时使用抗生素，会影响疫苗的效果？ 二者同时应用不会影响疫苗的效果。 5．年幼儿童注射疫苗为什么选择大腿前外侧？ 因为臂部肌肉脂肪较多，疫苗注射后不易扩散。上臂三角肌不发达，会影响疫苗的吸收。大腿前内侧因有大血管和神经经过，在此接种易发生危险。所以，年幼儿童应在大腿前外侧区肌肉注射，这里肌肉丰厚，易接种。
6．狂犬病病毒从感染至发病有哪些步骤？ 狂犬病病毒从感染到发病的步骤为：①病毒感染；②病毒在肌肉内复制；③病毒在神经肌肉结合处，与乙酰胆碱受体结合；④病毒通过快速轴突传递方式在周围神经的轴突内传播；⑤在脊髓的神经元与局部的周围感觉（背根）神经节内复制并快速上行到脑；⑥脑部神经元感染伴发神经功能障碍；⑦沿神经离心扩散到唾液腺、皮肤、角膜以及其他器官。 7．狂犬病病毒是如何与神经细胞相互作用的？ 狂犬病病毒与神经细胞的相互作用分四个阶段：①吸附：狂犬病病毒吸附于健康的神经细胞；②侵入：病毒被细胞吸入，进入细胞内；③复制：在细胞内，病毒迅速繁殖；④出芽：新的狂犬病病毒离开宿主细胞，吸附于其他神经细胞。然后，病毒从脑通过神经扩散到身体的其他器官。 8．狂犬病病毒的特性有哪些？ 狂犬病病毒是嗜神经性病毒，对神经组织有特殊亲和力。病毒不能穿透健康皮肤，主要通过损伤皮肤和粘膜入侵，少数由呼吸道吸入感染。病毒侵入后，沿传入神经到达中枢神经，侵害中枢神经细胞，然后再由中枢沿传出神经侵入各脏器组织，如唾液腺、眼、舌、皮肤、心脏等。因唾液腺最适狂犬病病毒繁殖，故唾液中含病毒最多，早在症状出现前14天即有病毒出现。因此唾液为主要传染源，既可通过舔咬感染人和畜，又可通过流涎污染环境，引起吸入性感染。 9．狂犬病的病原体是什么？ 狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。 10．曾经注射过狂犬疫苗的人又被犬咬伤还用再打针吗？ 全程接种符合效价标准的疫苗后1年内再次被动物致伤者，应于0和3天各接种一剂疫苗；在1-3年内再次被动物致伤，且已进行过上述处置者，应于0、3、7天各接种一剂疫苗；超过3年者应接种全程疫苗。此外，对暴露前后所用的疫苗效价无法证实者及免疫回忆应答无法确认者仍应进行全程免疫。
慢病毒滴度检测方法 空斑测定法 空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。 1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。 2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。 稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。 3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。 4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。 5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。 结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。 50%组织培养感染剂量法 此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。 细胞准备： 1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。 2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。 3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。 5.8.3.2 准备稀释病毒液 1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。 2．上下吸打5次混匀。 3．换用新枪头。 4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究 发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） [导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品 李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） （1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179） （2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015） 【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。 【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法 【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02 Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author) 1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 110179 2. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015 【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain. 【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay 狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。 1.材料和方法 1.1 病毒及细胞病毒株 狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。 1.2 实验动物 昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。 1.3 主要试剂 FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。 1.4 蚀斑法 1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。 1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。 PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量 1.5 免疫荧光法 1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。 1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。 1.6 小鼠LD50测定法 将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 一、包装 1.包装细胞 ?（P11）; ? (P16) 2.病毒载体及包装质粒 病毒载体：组构建及中量提取； 包装质粒：商品化产品（?（P12）; ? (P17)）或中量提取（目前唯一使用来源）； 3.细胞转染 方法一： ?（P12）; ? (P17)； 方法二： 按照? & (.15338)进行，简要中文说明如下： a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10培养皿中，加入完全培养基至终体积10，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%； b. 293T细胞转染前2小时换上9新鲜的完全培养基； c. 用之前充分混匀，在管中加入15的混合物( ：：：的摩 尔比为1：1：1：1)，15的，用定容到500，标记为 1，温和混匀，室温孵育5分钟； d. 充分混匀，在管中加入45的和455的，标记为 2，
温和混匀； e. 将 1的溶液加到 2中，温和混匀，室温孵育5分钟； 1 ( ) 2 () 15 ( ：：：1:1:1:1)455 μl 15 μl 45 μl 500μl 500 μl 500 μl f. 将1 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100皿中，边加边摇匀。 g. 将细胞放入置于37 ℃、5 2 培养箱中培养，12小时后换 上新鲜的培养基继续培养。 h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10或利用0.45 μm 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒； 方法三： C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒（目前唯一使用方法） 4.病毒上清收集 转染后12h, 48h,72h分别收集一次； 二、纯化 方法一： (i) 病毒上清（接一、包装 4.病毒收集）. () 51 a 50% 6000 . () 21.7 a 4 M .
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狂犬病暴露处置技术培训试题 姓名：单位：分数： 一.填空题（每题4分，共20分） 1.狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2.狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____和____狂犬病的病原体. 3.人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。彻底冲洗后用涂擦伤口。 4.狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。二．单选题（每题5分，共50分） 1.关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A.狂犬病毒为弹状病毒科 B.狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D.在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(NegriBodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2.Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（）
A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3.狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D.A＋B＋C E.B＋C. 4.狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5.暴露前的免疫程序是（） A. 0、7、21 天各 1 剂的程序 B. 0、3、7、14 和28天各接种 1 剂 C. 0天两剂，7、21 天各1剂的程序 D.直接注射免疫球蛋白 6.狂犬病临床表现有：（） A.有怕水、怕光、怕声的“三怕”症状
一、包装细胞293T细胞的培养 欧阳光明（2021.03.07） 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基 +20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个 /ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下 5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and
狂犬病诊治指南 疾病简介： 狂犬病(rabies)乃狂犬病病毒所致的急性传染病，人畜共患，多见于犬、狼，猫等肉食动物，人多因病兽咬伤而感染。临床表现为特有的恐水怕风，咽肌痉挛，进行性瘫痪等，恐水症状比较突出，故本病又名恐水症(hydrophobia)。 狂犬病病因 (一)发病原因 狂犬病病毒(rabies virus)属于弹状病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病毒属(lyssavirus)，病毒形态似子弹，直径75～80nm，长 175～200nm，内层为核壳，含40nm核心，外层为致密的包膜，表面有许多丝状突起，突起物远端为槌状，整个病毒表面呈蜂窝状的六角形结构，病毒的基因组为负链单股RNA，分子量为4.6×106，病毒基因组长11932个核苷酸，其中约91%的核苷酸参与编码五种已知的结构蛋白，即糖蛋白 (GP)，包膜基质蛋白(M2P)，壳体基质蛋白(M1P)，核蛋白(NP)和转录酶蛋白(LP)，基因组RNA与180个NP分子结合成核糖核蛋白(ribose nucleoprotein，RNP)，使RNA受到良好的保护而不被降解，同时也为基因组的复制和转录提供了一个适宜的结构基础，M2P是狂犬病毒最小的结构蛋白(分子量仅为25×103)，它可连接病毒外膜及膜上GP和核壳，GP是一种典型的跨膜糖蛋白，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，同时可诱发宿主体内产生中和抗体和刺激细胞免疫，对狂犬病病毒的攻击有保护作用，NP为狂犬病毒的群特异性抗原，可使机体产生补体结合抗体，NP诱生的抗狂犬病毒保护力是由各种细胞因子(如抗体，单核因子和淋巴细胞等)参与的相互作用产生的;还能对中和抗体有促进作用，狂犬病毒GP和NP还可能诱导机体产生干扰素。 用抗狂犬病毒核壳蛋白单克隆抗体可以将狂犬病毒及其相关病毒分为五个血清型：1型-典型的狂犬病攻击病毒标准株(challenge virus standard，CVS);2型-拉哥斯蝙蝠狂犬病毒(logosbat virus);3型-莫可拉原型株(Mokola virus);4型-杜文海原型株(duvenhage virus);5型-包括欧洲蝙蝠狂犬病毒：EBL1和EBL2，基因分型可分六型：即基因1，2，3，4型分别与血清1，2，3，4型相对应，基因5和 6型即为血清5型的EB1和EB2，血清2，3，4，5型和基因2，3，4，5，6型又称为狂犬相关病毒，其中野外分布主要为2，3，4型。 病毒可接种于鸡胚，鼠脑，也可在地鼠肾细胞及二倍体细胞中培养生长，从人与动物分离的病毒是存在于自然界中的野毒株，亦是人或动物发病的病原体，称为“街病毒(street virus)”，其特点是毒力强，潜伏期长(脑内接种15～30天以上)，能在涎腺中繁殖，各种途径感染后均可使动物发病，街病毒连续在动物脑内传代 (50代以上)后，毒力减低，潜伏期缩短，并固定在3～6天，对人
狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？ 狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。 （一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。 （二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。 （三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。
病毒滴度测定 有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。 1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位） 2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似） 3． PFU（空斑形成单位） 4． TCID50（50%组织培养感染剂量） 不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。 1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。 2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。 3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。 4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。 所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。 对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为： 106~107 第一代细胞经冻融后 108~109 100倍数量的细胞经过冻融后 1010~1011 用氯化铯方法纯化后 表6：各滴度测定方法特性 方法类型时间可重复性滴度* 评注 VP 物理学方法 2小时好 5×1012 GTU 生物学方法 2天可变 2×1011