非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理
一、大肠埃希菌
1.菌体特性
大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞
两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为
1.1～1.5×2～6.0 μm。
周身鞭毛、运动或不运动。能形成荚膜和微荚膜。
最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。最适pH
为7.4～7.6。在营养肉汤培养基中，37℃培养24
小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭
味。
在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落
呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光
滑湿润。也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的
菌落。
在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。呈桃红色、微红色或菌落中
心桃红色。
2. 生化实验原理
（1）MUG试验
97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4
—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形
酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
（2）靛基质试验（I实验)
有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛
基质（吲哚）。靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试
液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。
色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。
（3）甲基红试验（M）
肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。
2CH3COCOOH→2CO2+CH3CO〃CHOHCH3
丙酮酸乙酰甲基甲醇
（4）乙酰甲基甲醇生成试验(V－P)
此项实验主要用于鉴别大肠埃希菌和产气杆菌这两种细菌在分解葡萄糖后的进一步反应。大肠埃希菌于产生丙酮酸后，丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二
酮），丁二酮与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入的α—萘酚试液起到催化剂的作用，使反应的颜色增强。
（5）枸櫞酸盐利用试验（C）
枸椽酸盐培养基中仅含有无机盐和唯一的有机物—枸椽酸。一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源。因此，根据能否利用枸椽酸盐，能鉴别某些菌种。
产气杆菌可以分解枸椽酸盐而
取得碳源，能在含有枸椽酸盐的培养
基上生长形成菌落, 并分解枸椽酸
盐生成碳酸钠，使原来在pH7.0以
下的培养基转为碱性，用溴麝香草酚
兰作指示剂，接菌后的枸櫞酸盐培养
基经过培养，培养基颜色由最初的绿
色变为深兰色。大肠埃希菌不能分解枸椽酸，所以得不到碳源不能生长，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基中的溴麝香草酚兰指示剂也不会变色，培养基保持原来的绿色。
二、大肠菌群
大肠菌群为水质粪便污染的指示菌。是指37℃
生长时能发酵乳糖，24小时内产酸产气的革兰阴性
无芽孢杆菌。大肠菌群不是分类学上的名称，符合
此定义的细菌包括埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌
属和枸櫞酸菌属等菌属的细菌。涵盖了正常人畜肠道内全部需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。
乳糖发酵实验原理：各种细菌含有发酵不同糖的酶，能分解不同的糖而产酸、产气，有的仅产酸，而不产气。大肠菌群分解胆盐乳糖发酵培养基中的乳糖产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示液由紫色变为黄色；产气可使液体培养基中的倒臵小管内出现气泡。
三、沙门菌
1.沙门菌特性
沙门菌为肠杆菌科沙门菌属细菌，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒。可通过人、畜、禽的粪便或带菌者接触，直接或间接地污染药品原、辅料及生产的各个环节，以动物来源的药物，如脏器、粪便、全虫体等污染机率更高。因此，药品微生物限度标准规定，以动物来源的药物、生物脏器制品（不包括蜂蜜、王浆、动物角、阿胶）等的口服给药制剂不得检出沙门菌。
沙门菌为革兰阴性无芽孢短杆菌，菌体大小在0.4～0.9μm×1～3μm，两端钝圆,具周身鞭毛，能运动，一般无荚膜，少数有包膜。沙门菌属营养条件要求不高，在营养琼脂平板上为无色半透明、表面光滑、湿润、隆起的菌落；直径在2～3mm。生长温度10～42℃,最适温度37℃, pH范围4.5～9, 最适pH为6.8～7.8。需氧或兼性需氧。有时有粗糙型菌落，干燥、无光泽、边缘不整齐、中心和边缘不一致。
胆盐硫乳琼脂（DHL）、沙门、志贺菌属琼脂（SS）、麦康凯琼脂（Macc）及曙红亚甲兰琼脂（EMB）培养基中，都含有乳糖。埃希菌属能发酵乳糖产酸产气，沙门菌则不能。另外，埃希菌属不能分解含硫氨基酸生成硫化氢，而沙门菌属90%以上的菌H2S为阳性反应。产生的H2S遇培养基中的铁盐生成FeS沉淀物（黑色沉淀物）。因此，沙门菌在含有糖指示剂的EMB 和Macc培养基平板上，菌落为无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润。在DHL和SS琼脂平板上，因培养基中含有糖和H2S指示系统，菌落中心带黑色或几乎全黑色。
2. 三糖铁琼脂培养基上的特征及其生化反应原理
三糖铁琼脂培养基高层斜面：沙门菌在TSI斜面的反应为：(1)斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），H2S阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。(2)斜面及底层均为黄色，底层黑色。
实验原理：三糖铁琼脂培养基含二套指示系统，可检查糖类发酵情况和硫化氢产生。培养基中含乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10:10:1)；硫酸亚铁和还原剂硫代硫酸钠；酸碱指示剂为0.2%酚磺酞指示液[pH6.8～8.4（黄→红）]。培养基灭菌后的pH值约为7.3。
若待检菌能够发酵乳糖或蔗糖，则产酸量较多，使整个培养基（斜面及底层）均呈黄色：如
仅发酵葡萄糖，产酸量少，斜面部分由于细菌生长分解蛋白胨而产生氨，使培养基pH上升，酚磺酞指示剂显示碱性色（红色）。而底层部分由于氧压较低，仍保持酸性反应呈酸性色（黄色）。产生H2S的细菌使硫代硫酸钠分解，产生的H2S与Fe2+形成FeS不溶性黑色沉淀。反应需在较为厌氧的条件下进行，故观察到的黑色反应在培养基底层。
三糖铁琼脂斜面系半固体培养基，细菌发酵糖
产生气体，可使琼脂层出现气泡甚至断裂，绝大多
数沙门菌的细菌均产生气体。另外，穿刺接种部分
还可观察细菌有无动力。有动力的细菌生长后，可
由穿刺线扩展到整个底层，使培养基变浊，无动力
的细菌仅沿穿刺线生长，形成一条清晰的生长线。
沙门菌仅发酵葡萄糖，不发酵乳糖及蔗糖，产生H2S (90％以上）。大肠埃希菌能发酵葡萄糖、乳糖，部分能发酵蔗糖而产酸、产气，不产生H2S。它可使TSI斜面和底层整个变为酸性色（黄色），琼脂层出现气泡甚至断裂。
Na2S203 + 2H＋→H2S↑+ Na2S03
H2S + Fe2＋→FeS↓+ 2H+
细菌还原硫代硫酸钠产生硫化氢，须在酸性环境和厌氧条件下，培养基中糖的成分可提供酸性环境，培养基底层需要一定高度，以保持较为厌氧的环境，故在三糖铁高层培养基斜面的底层可有黑色FeS沉淀物产生。
如出现疑似沙门菌的三糖铁琼脂管应继续分别作革兰染色、镜检，生化反应及血清学凝集试验。
3.靛基质试验
用接种环沾取少许培养物接种至蛋白胨水培养
基管，照大肠埃希菌靛基质试验操作，判断结果。沙门菌应为阴性反应。
4. 脲酶试验
变形杆菌属的细菌具有尿素酶，能分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，酚磺酞指示剂显红色。沙门菌属和志贺菌属的细菌无此反应。其他肠道细菌的尿素酶试验多数为
阴性反应。
试验以培养基产碱为判断依据，某些细菌能利用培养基中的蛋白陈水解后，也可使培养基pH升高，造成假阳性。因此，须用无尿素的相同培养基作为对照管。
4.赖氨酸脱羧酶试验
细菌分解氨基酸使其脱羧，生成胺和CO2，此反应由细菌产生的脱羧酶来完成。各种细菌产生不同的氨基酸脱羧酶，均可使培养基变碱，由培养基中的指示剂显示出来。
沙门菌属除伤寒沙门菌和鸡沙门菌外，此反应均呈阳性。志贺菌属除宋氏和鲍氏志贺菌外均为阴性。
注意事项：
(1)沙门菌经培养1-2天，大多数出现阳性结果，亦有3-4天出现的。
(2)经培养后，阴性对照管必须为黄色，否则试验无效。
(3)判断结果时，必须与未接种的培养基进行比较，试验管只要有紫色痕迹出现都可判为阳性结果。培养时间最长不得超过4天。否则，可因蛋白胨中的氨基酸分解产碱而出现假阳性。
6. 氰化钾试验
氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶
的辅基为铁卟啉，氰化钾能与铁卟啉结合，使这些酶失活，从而抑制细菌生长。但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在下仍能生长。借此特性可以鉴别不同种属的细菌。
当培养基中氰化钾的含量在1:104或1:1.33 ×104时，肠杆菌科的沙门菌属，志贺菌属和大肠埃希菌属的细菌生长受到抑制，其他细菌仍可生长。
注意事项：
(1) 氰化钾为剧毒品，操作时须特别慎重，勿用口吸溶液，用后的培养管加少量硫酸亚铁和0.5ml的20%氢氧化钠去毒，再高压灭菌、洗涤。
(2) 氰化钾培养基试管灭菌后换橡胶塞封口，以防止氰化钾分解成氰氢酸气体，使氰化钾浓度下降，抑制作用减弱，造成假阳性。
(3) 接种1环肉汤培养基培养物即可，过量接种在未培养前就产生混浊，造成假阳性。
7. 血清凝集试验
沙门菌的抗原有三种：菌体抗原
（O抗原）、表面抗原（K抗原）和
鞭毛抗原（H抗原）。
表面抗原是菌体抗原的一种，是荚
膜或鞘物质。存在于细胞壁之外。荚膜
是疏松透明的多糖类胶状物，能耐受
100℃或更高的温度。鞘物质存在于少
数沙门菌中，又称Vi抗原，经60℃加热或石碳酸处理即被破坏。Vi抗原能阻止O抗原与O抗体凝集，加热破坏Vi抗原后，O抗原与相应的O抗体能发生凝集。
鞭毛抗原（H抗原）存在于细菌鞭毛中，不耐热，经60～70℃15分钟或者经乙醇或酸处理后即失去抗原性。另在培养基中加入0.1％的石碳酸即可暂时抑制鞭毛的形成。H抗原与H 抗体形成疏松状易摇散的絮状凝集。
菌体抗原也称为O抗原，能耐受100℃2.5小时，并能抵抗乙醇与0.1％石碳酸的破坏，与特异性血清形成颗粒状凝集。形成慢，不易摇散。现已知有50多种O抗原成份，分别以阿拉伯数字1, 2, 3……表示。有的沙门菌有一种O抗原，多数沙门菌为两种以上O抗原；有的O抗原为一种菌独有，有的为几种菌共有。凡含有相同的特异性抗原成分的血清型沙门菌归为一个群。如此可将沙门菌属的菌划分为42个群，以英文字母A, B, C……排列，Z以后的顺序以027, 028
等表示。引起疾病的95％以上的沙门菌都在A-F六个菌群内，常见菌型不过20个左右。因此，药品沙门菌检验，主要是对A-F群沙门菌做出初步鉴定。按常规方法选用A-F群多价O抗体血清。
四、金黄色葡萄球菌
为微球菌科葡萄球菌属的细菌。本属细菌是最常见的化脓性球菌。因其排列不规则，常堆聚成葡萄串状而得名。在自然界中分布广，空气、土壤、水、日常用具、人的皮肤、皮肤腺、鼻腔和其他器官的粘膜上都可发现。能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。
菌体细胞为球形，单生、成对、四联和成不规则菌群排列。革兰阳性无芽孢，不能运动，不形成荚膜，能产生多种毒素及酶。为需氧或兼性厌氧菌。
本属有30个左右的种，金黄色葡萄球菌为其中的一个种。在营养肉汤及营养琼脂培养基上生长良好。最适生长温度37℃，最适pH值为7.4。耐盐性强，在10%～15%氯化钠培养基中亦能生长，故可用高盐培养基分离葡萄球菌。在营养肉汤培养基中培养24小时，呈均匀混浊，管底有易摇散的少量沉淀，表面有薄环状菌醭。
1.平板菌落特征
在营养琼脂培养基平板上，经37℃培养24～48小时，形成0.8～1.5mm的较小菌落，圆形，凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润、不透明，金黄色。因色素为脂溶性，故不向菌落四周及培养基中扩散。在卵黄氯化钠琼脂培养基平板上，由于分解卵磷脂而使菌落外围有乳浊圈，金黄色菌落，直径1～2mm，圆形凸起，边缘整齐。在甘露醇氯化钠琼脂平板上形成金黄色菌落，直径0.7～1 mm，圆形凸起，边缘整齐，菌落外围有黄色环。
2.血浆凝固酶试验
测定葡萄球菌的致病性，是以能否产生血浆凝固酶为准，产生者为致病菌株。葡萄球菌产生
的血浆凝固酶有两种，一种是血浆凝固酶与细菌细胞壁结
合在一起，直接作用于血浆中的纤维蛋白，使细菌凝成块
状，可以用玻片法检查此类酶。另一种是在细菌菌体中产
生后释放到细菌菌体外，称为游离血浆凝固酶，它能使血
浆中的凝固酶原转变为凝血酶类产物，可以用试管法检查
此类酶。
3．过氧化氢酶实验（触酶试验）
细菌代谢产生过氧化氢，过氧化氢对细菌细胞有毒，细胞内的过氧化氢酶能将过氧化氢分解生成水和氧气而使其解毒。在细菌培养物上滴加过氧化氢溶液（3％）后，立即产生大量气泡，为阳性反应。
H2O2 →H2O ＋O2
绝大多数细菌的营养琼脂培养物均产生过氧化氢酶。金黄色葡萄球菌、微球菌过氧化氢酶阳性反应，链球菌属、乳酸菌、梭菌、铜绿假单孢菌为阴性反应。
注意事项：
（1）应使用新鲜培养物（培养18～24小时），陈旧培养物可能丧失酶活性，容易出现假阴性反应。
（2）不要使用过浓的过氧化氢，因过浓会产生泡沫造成误判。
（3）应将过氧化氢溶液滴加到菌苔上，操作顺序不能颠倒，否则会出现假阳性。
（4）实验时应同时以已知阳性菌或阴性菌作对照。
五、铜绿假单胞菌
此菌为假单胞菌属的细菌。在自
然界分布广泛，水、土壤、空气和腐物
中常见，医院环境中都存在此菌。在人
的皮肤和肠道中也存在。14％正常人
的粪便中带有此菌。本菌对外界环境有
较强的抵抗力，在潮湿环境可长期生
存，抗干燥能力也极强，在干燥滤纸上
可存活三个月。在苯扎溴铵和十六烷除
臭剂中生存，对磺胺类和大多数抗生素不敏感，有天然耐药菌之称。但对庆大霉素、多粘菌素及羧卞西林较敏感，对石碳酸、甲酚皂、过氧乙酸和有机碘较敏感。常引起人体各部位的感染，特别是外伤及烧伤患者感染后，最易引起化脓性疾病。因此，局部给药制剂规定每1g、l ml或10cm2不得检出铜绿假单胞菌。
本菌为革兰阴性杆菌，球杆状至杆状，无芽孢及荚膜，极生鞭毛，细胞壁外有粘液层。专性需氧菌，在培养基表面生长良好，培养基液体深部发育不良。在营养肉汤培养基中生长迅速，24小时液面出现菌膜，并有兰绿色或黄绿色素产生。最适生长温度为36℃±1℃，在41℃生
长，4℃停止生长。在pH8.0碱性环境中有细胞自溶现象并呈粘液状。在营养琼脂培养基平板上菌落扁平，无定形，周边扩散、表面湿润、灰白色，菌落周围有兰绿色素扩散。能氧化分解葡萄糖、木糖、果糖，不分解乳糖、麦芽糖。能分解蛋白质，液化明胶，分解尿素，不产生靛基质，能还原硝酸盐为亚硝酸盐和氨。可水解精氨酸，能利用枸櫞酸盐作碳源。
1.氧化酶试验
铜绿假单胞菌有氧化酶（细胞色素氧化酶），可将细胞色素C氧化。氧化型细胞色素C 与二甲基对苯二胺反应，生成玫瑰红色至暗紫色的醌类化合物。
注意事项：
（1）含葡萄糖培养基上的菌落，不宜做氧化酶试验。因葡萄糖发酵可抑制氧化酶的活性，造成假阴性。
（2）待检菌避免与铁、镍等金属接触，故应注意不使用镍铬合金丝制成的接种环挑取菌落。
（3）试验菌落须新鲜，陈旧者反应不可靠。
（4）1％盐酸二甲基对苯二胺溶液宜新鲜配制，棕色瓶密闭保存，颜色变为红褐色，不可使用
（5）反应需在有氧条件下进行。因此，试液勿多加，以免妨碍菌苔与空气接触，造成假阴性。
（6）有时菌苔本身显红色，不易观察。滴加1％盐酸二甲基对苯二胺溶液后，可再滴新制的1%α—萘酚乙醇溶液1～2滴，如出现蓝色，即为阳性反应。
铜绿假单胞菌多数都产生水溶性的兰绿色素扩散于培养基中，此色素溶于氯仿。经提取、转
静臵后，上层盐酸液呈现粉红色至红色。
绿脓菌素为铜绿假单胞菌特征产物，
但也有的菌株不产生绿脓菌素。因此，不
能以绿脓菌素试验阴性作为否定铜绿假单
胞菌的唯一依据。另外，培养基成分也有
影响。若培养基斜面无色素产生，应于室
温培养1～2天再按上法试验，仍为阴性者，继续以下试验：
3.硝酸盐还原产气试验
该菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，进一步分解亚硝酸盐产生氮气,使培养基放臵的玻璃小倒管
内产生气泡。
4.42℃生长试验
细菌在一定的温度范围内才能生长，分裂。不同种属的细菌生长温度不尽相同。假单胞菌属
的一些种，如铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌、类鼻疽假单胞菌等能在42 ℃下生长，其他种的假
单胞菌则不能生长，以此将不同种的假单胞菌区分开来。
注意事项：
（1）测定水浴温度的温度计应为校准后的。
（2）应在41℃水浴箱中培养。电热培养箱温度波动范围大，不易平衡培养基的温度，特
别是在冬季。
5. 明胶液化试验
明胶是一种胶原蛋白，不具有一般蛋白质加热凝固的特性，其水溶液在20℃以下为凝固状态，高于24℃则自行液化为液体。某些细菌具有明胶液化酶，明胶经其水解后，虽在低于20℃亦不再凝固。本试验为细菌鉴定的常规试验方法。铜绿假单胞菌、腐败假单胞菌等为阳性反应，肠杆菌科的细菌很少能液化明胶。
六、白色念珠菌
本菌细胞呈卵圆形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6倍，革兰氏染色阳性，但着色不均匀。在病灶材料中常见菌细胞出芽生成假菌丝，假菌丝长短不一，并不分枝，假菌丝收缩断裂又成为芽生的菌细胞。该菌通常存在于正常人口腔，呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，念珠菌对热的抵抗力不强，加热至60℃1小时后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。在假丝酵母菌中80%～90%病原体为白假丝酵母菌，10%～20%为光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等。白假丝酵母菌为条件致病菌，10%～20%非孕妇女及30%孕妇阴道中有此菌寄生但菌量极少，呈酵母相，并不引起症状。念珠菌生长最适宜的pH值为5.5，阴道的弱酸性环境能保持阴道的自洁功能，正常人为3.7-4.5，但阴道的弱酸性改变为pH5.5后，假丝酵母菌大量繁殖，并转变为菌丝相，才引发阴道炎症状。
取相当于1g 或1mL 供试品的供试液，接种到100mL沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天。取上述预培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。挑取疑似菌落接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72小时），或采用其它适宜方法进一步鉴定。
若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落阳性反应，应进一步进行适宜的鉴定试验, 确证是否为白色念珠菌；若沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或疑似菌在念珠菌显色培养基平板上生长的菌落呈阴性反应，判供试品未检出白色念珠菌。
七、梭菌
1.菌体特征
梭菌是指芽孢杆菌科芽孢梭菌属的细菌。革兰阳性杆菌，产生芽孢时孢子囊膨大而使细胞呈梭状、鼓槌状、棍棒状或船形。周生鞭毛，运动。单个或呈链状排列。专性厌氧，大多数种在pH6.5～7，30～37℃生长最快。15～69℃均能生长。
2.生化反应
能分解和发酵糖类，产生各种酸、产气（C02, H2或CH4 )。有的能利用蛋白盶和凝蛋白，进行较完全的分解。过氧化氢酶阴性。
此属细菌主要存在于土壤、海水和淡水的沉积物中，人和家畜的肠道中。可随粪便排泄于外界，污染土壤和水源。对环境抵抗力特强，芽孢体可耐高温及干燥，在土壤中存活数十年。本属有近百个种，约有25～30种能引起人和动物致病。临床上常见的致病性梭菌有破伤风梭菌、肉毒梭菌、气性坏疽病原菌群与艰难梭菌。
3.过氧化氢酶试验（触酶试验）
细菌代谢过程中产生过氧化氢，对菌体细胞有毒性。过氧化氢酶可将H202分解为02和H20。具有过氧化氢酶的细菌经培养后，向菌落上或取培养物臵洁净玻片上，滴加3％过氧化氢后，立即产生气泡，即为阳性反应。若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无球形或卵圆形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌；否则，判供试品未检出梭菌。
1.目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2.适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3.责任者：QC检验员、QC经理。 4.正文： 4.1非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2计数方法
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表1试验菌液的制备和使用
通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。 供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。 菌种及菌液制备 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕 大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕 菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
微生物限度检查若干问题 微生物限度检查若干问题 微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要容之一。中国药典2000年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”、《中国药品检验标准操作规》（2000年版）及参考书《药品微生物学检验手册》均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。 一、实验室要求 开展微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规》及《药品生产质量管理规》的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室（接种对照菌及菌种传代）均应严格分开。 （一）无菌室： 1结构与要求： 最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10平方米，高度不超过24米，由2个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。 无菌室光照应不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线杀
菌灯2-25w/m3作空气消毒用。紫外线波长200-300nm者''具有杀菌作用，其中以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱围一致。其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA复制，导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m以距离杀菌效果最佳''每次开灯照射时间为 20min。其缺点：穿透力弱，一纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。 2温度、湿度：温度应控制在18-26℃''相对湿度40-60''操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比''不低于49Pa。 3操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于1万级，净化工作台局部应为100级。操作间应准备电子称（感量01g''最大称量300g''乙醇灯''火柴''2碘酊及75乙醇棉球，大、小橡皮乳头，记号笔，灭菌的剪刀，镊子、注射器等。 4缓冲间：应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口罩，拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物。 （二）洁净级别及检查方法： 通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。 98年国家药监局颁布药品生产质量管理规''把药品生产洁净区空气洁 净度划分为四个级别： 空气洁净度级别表 ──────────────────────────── 尘埃数/立方米活微生物数个 洁净级别─────────────────────
附录ⅩⅢJ 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（附录×××）。 如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 培养基适用性检查和方法适用性试验 供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。 菌种及菌液制备 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕 大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕 乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
微生物限度检查法 录入时间:2006-7-6 15:25:25 来源：其它 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。 检查的全过程,均应严格遵守无菌操作，严防再污染。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。 检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 培养基及其制备方法 除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。 1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基见无菌检查法（附录ⅪH）。 2.玫瑰红钠琼脂培养基 胨5g 玫瑰红钠0.0133g 葡萄糖10g 琼脂15～20g 磷酸二氢钾1g 水1000ml 硫酸镁0.5g 除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。 3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD) 胨10g 琼脂15～20g 酵母浸出粉5g 水1000ml 葡萄糖20g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。 4.胆盐乳糖培养基(BL) 胨20g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖5g 牛胆盐（或去氧胆酸钠0.5g）2g 氯化钠5g
磷酸氢二钾 4.0g 除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。 5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB) 营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml 20％乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。 6.麦康凯琼脂培养基(MacC) 胨20g 1%中性红指示液3ml 乳糖10g 琼脂15～20g 牛胆盐5g 水1000ml 氯化钠5g 除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。 7.4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide，MUG)培养基 胨10g 磷酸二氢钾0.9g 硫酸铵5g 磷酸氢二钠(无水) 6.2g 酸锰0.5mg 亚硫酸钠40mg 硫酸锌0.5mg 去氧胆酸钠1g 硫酸镁0.1g MUG 75mg 氯化钠10g
微生物基础知识培训试题（卷） 姓名部门得分 一、填空题（每空2分、共50分） 1．微生物（microorganism, microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。 2．微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类：真核细胞型、原核细胞型、非细胞型。 3．微生物按形态结构分为：细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、病毒。 4．微生物的营养：水分、碳源、氮源、无机盐类、生长因子。 5．洁净室对温湿度、压差及微生物和尘粒进行严格的控制。 6．辐射灭菌法：辐射有两种类型：一种是电磁波辐射，如紫外线、红外线、微波；一种是电离辐射，如可引起被照射物电离的X射线、γ射线。 7．过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。 8．高压蒸汽灭菌法：超过一个大气压时，水的沸点高于100℃，反之亦然。此法适用于耐高温和潮湿的物品。 二单项选择题（每题2分、共16分） 1．真菌属于___A__型微生物。 A. 真核细胞型 B. 原核细胞型 C. 非细胞型 D.多核细胞型 2.下列不属于原核细胞型的是____D__ A.细菌 B.衣原体 C. 放线菌 D.病毒 3. 杀灭芽胞最可靠的方法是___C___ A.干热灭菌法 B. 流通蒸汽灭菌法 C. 高压蒸汽灭菌 D. 巴氏灭菌法 4. 下列那个是构成细胞的重要物质__B____ A.水 B.碳源 C. 细胞核 D.无机盐 5. 滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为__A____ A.0.22μm B.0.36μm C.0.45μm D.0.65μm 6. 紫外线杀菌的常用波长为 D A.80-100nm B.120-140nm C.160-195nm D. 253.7nm 7. 新洁尔灭为常用消毒剂，其浓度为____B__ A. 0.01% B.0.1% C.1% D.10% 8．常用乙醇消毒剂的浓度为____A__ A. 55% B.65% C.75% D.85% 三多项选择（每题4分、共16分） 1.下列哪些是我们常用的消毒剂 ABCD A. 75%乙醇水溶液 B. 37%~40%甲醛溶液 C. 新洁尔灭 D. 过氧乙酸 2. 高压蒸汽灭菌常用条件为：ABC A. 115.5℃ 30min B. 121.5℃ 20min C. 126.5℃ 15min D. 200℃ 45min 3.下列哪些属于微生物的特点ABCD A. 体积小，面积大 B. 吸收多，转化快 C. 生长旺，繁殖快
752015年药典通则1105 非无菌产品微生物限度检 查 通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数；微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和；微生物计数试验环境应符合微生物限度检 查的要求；如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和；供试液制备时如果使 用了表面活性剂，应确认其对微生；计数方法；计数方法包括平皿法、薄膜过 滤法和最可能数法（Mo；供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标；计数培养基适用 通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应 按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本 法不适用于活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格 遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中 和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表 1 试验菌液的制备和使用 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。 菌种及菌液制备
药品微生物限度标准 王知坚
?我国药品微生物限度标准的历史沿革?药品微生物限度检查在制剂通则中的修订内容 ?药品微生物限度标准的修订内容 ?限度标准的注意事项 ?国外药典微生物限度标准的收载情况
历史沿革
?检查法的历史沿革 –国务院1973年121号文件标志着我国药品微生 物限度检查工作正式启动 –在1974年颁布了74版《卫生部药品卫生学检查法》，是首次颁布与药品微生物限度检查有关 的检查方法 –先后于84年和90年两次修订，颁布新的检查法–1995年版《中国药典》首次在附录中收载微生物限度检查法 –2000年版、2005年版和2010年版《中国药 典》先后收载该检查法，并进行了不同程度的 修订和完善
?限度标准的变迁 –1986年版《卫生部部颁药品微生物限度标准》?国内首次颁布与药品微生物质量有关的限度标准 ?限度标准的分类依据为剂型，不同剂型制订不同的 限度标准值；控制菌检查的分类依据为给药途径， 不同途径的制剂有不同的检查内容 –1989年版《卫生部部颁药品卫生补充规定》?是对86版限度标准的修订和补充 ?分类方式上与86版相同
–《中国药典》2000年版 ?首次将微生物限度标准收载入国家药典 ?在编制体例上仍延用部颁标准的做法，按剂型制订限度标准，按给药途径和剂型特点制订控制菌标准–《中国药典》2005年版 ?首次确定按给药途径来制订不同产品的限度标准和控制菌标准 ?首次在制剂通则中对某一类制剂制订较为特殊的微生物控制要求，如眼用液体制剂需要达到近似无菌的要求 ?在标准的具体规定上，体现了当时对微生物质量的研究水平，如含生药原粉的制剂要求开展大肠菌群检查，用于深部组织的制剂要求不得检出梭菌。
微生物、洁净区基础知识及无菌保证知识培训试卷姓名: 一、填空题（每空1分，共 20分） 1、进入洁净区的工作人员（包括维修、辅助人员）应定期进行卫生、微生物学基础知识和洁净作业等方面的培训及考核。 2、洁净区的设计必须符合相应的洁净度要求，包括达到“静态”和“动态”的标准。 3、无菌药品的生产须满足其质量和预定用途的要求，应当最大限度降低微生物、各种微粒和热原的污染 4、常见微生物:细菌、霉菌、酵母菌、病毒。 5、微生物的五大特点：小，多，快，强，广。 6、传播污染的四大媒介为：空气、水、表面、人。 二、单选题(每空2分，共20分) 1、微生物是存在于自然界中的个体微小，结构简单、肉眼看不见，必须借助于显微镜才能看清它们外形的一群低等的、原始的微小生物。 A、个体微小 B、个体庞大 C、结构复杂 D、结构简单 2、无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，包括无菌制剂和无菌原料药 A、无菌 B、热原 C 细菌内毒 D 微生物限度 3、采用湿热灭菌方法进行最终灭菌的，通常标准灭菌时间F0值应大于 __8__分钟，流通蒸汽灭菌处理不属于最终灭菌。 A、6 B、12 C、10 D、8 4、无菌药品按生产工艺可分为两类：采用最终灭菌工艺的为最终灭菌产
品；部分或全部工序采用无菌生产工艺的为非最终灭菌产品。 A、最终灭菌产品 B、非最终灭菌产品 C、辅助灭菌产品 5、内毒素——是革兰氏阴性菌产生的具有强致热效应的脂多糖类物质。 A、霉菌 B、革兰氏阳性菌 C、革兰氏阴性 D酵母菌 6、A级洁净区静态环境下≥5.0μm悬浮粒子的最大允许数/立方米为(20 ) A、 20 B、200 C、290 D、29 7、洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净区之间的压差应当不低于10帕斯卡。 A、 5 B、10 C、15 D、20 8、2010版药典规定注射用水细菌内毒素检测限度为：为每1ml中含内毒素量应小于0.25EU。 A、 0.125 B、0.25 C、0.5 D、0.1 二、多选题(共5题，每题2分，共10分) 1、洁净区防止交叉污染的重要措施：（ABCD） A、合理布置空间面积 B、提高设备水平 C、分设空调净化系统 D、严格控制人流物流 2、洁净区气流组织形式中单向流的特点：( ACDE ) A、空气流线呈平行 B、具有不规则运动轨迹 C、类似活塞作用 D、各流线间的尘粒不易相互扩散 E、达到净化程度高 3、药品污染热原的途径（生产过程）：（ABCDF） A、注射溶媒 B、容器和设备、管道、滤器 C、原辅料 D、制造过程及生产环境 E、输液器带入 F、由于包装不严密产生热原
湖南湘大兽药有限公司工作标准文件 一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。 二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。 三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。 四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。 五、正文： 1简述： 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 2.计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，
MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 表 1 试验菌液的制备和使用
微生物限度检验 1概述：微生物限度检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。饮用水，纯化水，注射用水、及其他完全溶解并能通过滤膜的样品，采用薄膜过滤法进行检查；精制卡介菌多糖核酸等其他不完全溶解或无法通过滤膜的样品，采用直接接种法进行检查。 2设备、仪器及用具 2.1 设备净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱(30～35℃)、霉菌培养箱(23～28℃)，恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱(180℃～300℃)、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、365nm紫外灯、显微镜、集菌仪、薄膜过滤装置等。 2.2 用具 2.2.1 玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。于180℃干热灭菌2小时以上或250℃干热灭菌30分钟以上（仅适用于玻璃器皿或不锈钢用具），或高压蒸汽121℃湿热灭菌30min,50～60℃烘干备用。 2.2.3 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套,用牛皮纸包严）、移液管、试管、接种环、孔径0.45UM且直径50的微孔滤膜灭菌,备用。也可用一次性无菌口罩、手套。 2.2.3 酒精灯、乙醇棉球、打火机、实验记录纸等。 2.2.4经灭菌处理的用具存放时间不超过48小时，否则需重新灭菌后方可使用。 3稀释液 PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。 4培养基及试液 4.1 细菌检查用酪蛋白大豆营养琼脂培养基。 4.2 霉菌、酵母菌检查用沙氏培养基、（玫魂红钠琼脂培养基）、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）。 4.3 大肠埃希菌检查用胆盐乳糖(BL)培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、靛基质试液、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基。 4.4 大肠菌群检查用乳糖胆盐发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基。 4.5稀释液 0.9%氯化钠溶液或PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 4.6 培养基制备应注意: 4.6.1 配制的培养基应测定PH值，确保灭菌后培养基的PH值符合相关培养基的要求。并且，不能有沉淀,如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,灭菌后使用。灭菌条件为：121℃蒸汽灭菌20分钟。 4.6.2 培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。包装时塞子必须塞紧,免松动或脱落造成染菌。 4.6.3 培养基配制后应在2小时内灭菌,避免细菌繁殖。
Appendix XVI D. Microbiological Quality of Non- sterile Pharmaceutical Preparations and Substances 非无菌制剂的微生物限度 (Ph. Eur. general text 5.1.4) The presence of certain micro-organisms in non-sterile preparations may have the potential to reduce or even inactivate the therapeutic activity of the product and has a potential to adversely affect the health of the patient. Manufacturers therefore have to ensure a low bioburden of finished dosage forms by implementing current guidelines on Good Manufacturing Practice during the manufacture, storage and distribution of pharmaceutical preparations. 非无菌制剂中存在一定量的微生物可能导致药物的治疗活性降低或消失，并对患者健康有着潜在的危害。因此生产商应在药品生产、储存、运输过程中实施GMP管理，使制剂的微生物负荷保持在低水平。 Microbial examination of non-sterile products is performed according to the methods given in general chapters 2.6.12 and 2.6.13. Acceptance criteria for non-sterile pharmaceutical products based upon the total aerobic microbial count (TAMC) and the total combined yeasts/moulds count (TYMC) are given in Tables 5.1.4.-1 and 5.1.4.-2. Acceptance criteria are based on individual results or on the average of replicate counts when replicate counts are performed (e.g. direct plating methods). 非无菌制剂的微生物检测按照通则2.6.12和2.6.13的方法执行。非无菌制剂的微生物限度基于表5.1.4-1和5.1.4-2的需氧微生物总数（TAMC）及酵母菌/霉菌总数（TYMC）。接受标准适用于单个检出结果或者做重复样品时结果的平均数（例如，直接平板法）。 When an acceptance criterion for microbiological quality is prescribed it is interpreted as follows: 给出的微生物质量接受标准解读如下： — 101 CFU: maximum acceptable count = 20; — 101 CFU: 最大可接受数= 20; — 102 CFU: maximum acceptable count = 200; — 102 CFU: 最大可接受数= 200; — 103 CFU: maximum acceptable count = 2000； — 103 CFU: 最大可接受数= 2000； Table 5.1.4.-1 includes a list of specified micro-organisms for which acceptance criteria are set. The list is not necessarily exhaustive and for a given preparation it may be necessary to test for other micro-organisms depending on the nature of the starting materials and the manufacturing process. 表5.1.4-1给出了各种剂型的具体微生物接受标准。此表格并不完全，根据起始物料和生产工艺的性质可能需要其他的微生物检查。 If it has been shown that none of the prescribed tests will allow valid enumeration of micro-organisms at the level prescribed, a validated method with a limit of detection as close as possible to the indicated acceptance criterion is used.
微生物限度-无菌-内毒素区别与联系 微生物检测基本就这3项了。 微生物限度：用营养琼脂、玫瑰红钠培养。洁净度中等操作台内进行（B级) 无菌：硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。洁净度要求较高(A级） 内毒素：鲎试剂稀释不同浓度来判定。洁净度要求不高，D级情况下即可。 我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象，各种杂菌都有 无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别？ 内毒素是一种热源，服用没什么关系，在注射后容易导致人体发热。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。耐高温 比如说注射液产品用气接触产品，他应该用滤器过滤其他吧。用膜直径改用0.45（过滤）的好还是0.22（除菌）的好？滤膜泡点肯定要做的，高风险产品应该要最少2层滤膜吧。用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目？而且有的企业只是一年验证一下，不对气体日常可行吗？ 求大神详解3者的联系与区别，各什么时候需要检这3项及为什么。 答：微生物限度针对非无菌产品 无菌和内毒素针对无菌产品。 微生物限度，无菌检验，内毒素检验均为供试品安全性检测。主要区别是微生物限度，无菌检验是检验活的微生物方法，内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。 什么时候选用不同的检验方法，主要参见药典要求，例如口服制剂选择微生物限度，注射剂和眼用制剂选择无菌检验，注射剂也需要做内毒素检验。选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。 例如纯化水检验中不需做内毒素实验，注射用水检验中不需做无菌实验。依据是纯化水主要用途为清洗，注射用水用途是配液，所以注射用水的微生物风险更高，需要做内毒素实验，控制风险。 微生物限度和无菌实验用具要求无菌，内毒素实验用具要求去除内毒素。 检验环境要求 现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级，微生物限度在超净工作
1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3. 责任者：QC检验员、QC经理。 4. 正文： 4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1 简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不
适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2 计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试
微生物及无菌知识培训 一．前言 我们所生活的环境中，到处都存在着大量的微生物。在一般空气中，微生物达800~3500个/m3，在土壤中达1~500×108个/g，在严重污染的水中可达107个/ml。（饮用水要求细菌总数≤100个/ml，大肠杆菌≤3个/ml。经水塔或贮水池贮存后，短期内可繁殖至105~106个/ml。）人的头皮上有140万个/cm2，两手上约有4~40万个，1g指甲污垢有38亿个，1g粪便可达10~1000亿个。可以说微生物是无处不在，无处不有。许多以前被人们认为是极端（高温、高压、强酸、强碱、低温等）甚至是致死的环境，现在已发现生活着各种类型的微生物（称为极端微生物）。事实说明，微生物有特别顽强的生存、繁殖和变异能力来适应环境。 微生物种类繁多，有的对人有益，有的有害，有的无益也无害。但在药品生产过程中，不可能对环境中的各种微生物加以区别对待，为保证药品的安全有效，需要对其进行控制。空气中的微生物多数附着在灰尘上，或以芽孢形式悬浮于空气中，1μm以下者处于悬浮状态，10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。所以也要对尘粒进行控制。 大量临床资料表明，注射剂（尤其是静脉注射剂）如污染了7~12μm的尘粒，可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等，严重的还会致人死命。而如果污染了细菌，轻则局部红肿化脓，重则引起全身细菌性感染。因此，对微生物和尘粒进行更加严格的控制对于针剂生产洁净室非常重要。 人是洁净室最大的污染源，占90%左右。一般男性每人每分钟向周围排放1000个以上的含菌粒子，女性为750个以上。穿无菌服时，静止时的发菌量为10~300个/min，一般活动时发菌量为150~1000个/min，行走时发菌量为900~2500个/min。咳嗽一次发菌量为70~700个/min，喷嚏一次为4000~60000个/min。所以在洁净室中，人的数量和活动应有特别严格的限制。 二．微生物简介 微生物是广泛存在于自然界的一群体形微小（直径小于1mm）、结构简单、肉眼看不见，必须藉助光学或电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的生物。需要说明的是，微生物是一个比较笼统的概念，界线有时非常模糊。如单细胞藻类和一些原生动物也应算是微生物，但通常它们并不放在微生物中进行研究。 微生物具有以下特点：①体积小，面积大；②吸收多，转化快（2000倍体重/h）；③生长旺，繁殖快（20min分裂一次）；④易变异，适应强；⑤分布广，种类多（10万种以上）。 微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类： 1．真核细胞型细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体；胞质内有完整的细胞器（如内质网、核糖体及线粒体等）。真菌属于此类型微生物。 2．原核细胞型细胞核分化程度低，仅有原始核质，没有核膜与核仁；细胞器不很完善。这类微生物种类众多，有细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。
１、目得：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程,规范检验操作,确保检验结果准确。 ２、适用范围:适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定得供试品. ３、责任者：QC检验员、ＱC经理。 4、正文: 4、1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 ４．1.１简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长得嗜温细菌与真菌得计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等就是否符合规定得微生物限度标准时，应按下述规定进行检验,包括样品得取样量与结果得判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂得检查。 本检查法可采用替代得微生物检查法,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典规定得检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下得局部洁净度不低于B 级得单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中与。供试品检查时，若使用了中与剂或灭活剂,应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中与剂或灭活剂得相容性。 4．1。２计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法与最可能数法（Moｓt—Probabｌe—Ｎｕm ｂerMethod，简称MPN 法)。ＭPN 法用于微生物计数时精确度较差,但对于某些微生物污染量很小得供试品,MＰN 法可能就是更适合得方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性与微生物限度标准等因素选择计数方法,所选得方法必须具备检测充足样品量得能力,以保证所获得得试验结果能够判断供试品就是否符合规定。所选方法得适用性须经确认。 4.1。3 计数培养基适用性检查与供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用得培养基应进行适用性检查。 供试品得微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确认所采用得方法适合于该