PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用
王庭柱，高学军，杨振宇
东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030）
E-mail：wangtingzhu1980@https://www.doczj.com/doc/3c8113617.html,
摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。
关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学
1. 引言
乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。
传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。
只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。
PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培
养）。PCR技术用于LAB的鉴定和鉴别，一些是依赖于扩增子的多少有无，如特异性PCR、多重PCR、PCR-RFLP、ARDRA、T-RFLP、RAPD、AFLP、REP-PCR、LCR、LH-PCR以及小卫星序列多态性等，而另一些则是依赖于等长同源扩增子的序列比较分析或者是其在特殊电泳介质中迁移距离的差异，如序列同源性分析法、PCR-SSCP、PCR-DGGE和PCR-TGGE。以PCR为基础的方法学为LAB鉴定以及混合菌群的多样性研究提供了简单快速的方法。本文即对各种PCR技术在LAB分类鉴定研究应用中的原理及其应用的优势和局限性做一综述。
2. 特异性PCR
特异性PCR（Specific PCR），是依据某一（某些）乳酸菌株的已知（同源）基因序列设计菌株（菌种/菌属/菌群）特异性的PCR引物，扩增后产生排他性的唯一条带，据此做出鉴定。PCR的特异性取决于引物与模板核苷酸序列的特异性结合，即模板核苷酸顺序的特异性，因此靶序列的选择起着决定性的作用。
目前，多是以蛋白/酶编码基因作为靶序列进行鉴定引物的设计，如聚糖酶（dex）、氨基肽酶C（pepC）、氨基肽酶N（pepN）、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（htrA）、重组酶（recA）、N-乙酰溶菌酶（acmA）、脯氨酸亚氨基肽酶（pepI）、addAB、β-半乳糖苷酶（lacz）和谷氨酸脱羧酶（gad）、谷氨酸脱氢酶（gdh）等，且多为菌种（含亚种）水平的，涉及到的菌种有远缘链球菌、变形链球菌[7]、汉毛链球菌[8]、猪链球菌 [9]、嗜热链球菌[10]、瑞士乳杆菌[11]、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、类植物乳杆菌[12]、德氏乳杆菌[13]、乳酸乳球菌[14,15]以及亚种有德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种[16]、乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种[14,15]；也有依据组氨酸生物合成操纵子序列设计了乳酸乳球菌亚种特异性的PCR引物，可将其乳酸亚种和乳脂亚种鉴别开[17]。此外也有群、属特异性PCR引物，如JC Le等比较各种LAB的组氨酸脱羧酶基因（hdcA）设计了群特异性引物，可鉴定出所有可使组氨酸脱羧的LAB[18]；FJ Picard 等基于链球菌延伸因子编码基因（tuf）设计了属特异性的PCR引物[19]；甚至也有婴儿双岐杆菌Y1和短双歧杆菌Y8的菌株特异性PCR引物[20]。
随着16s rRNA基因及其结构的发现，认为其可作为遗传标记的“细菌化石”，所以其在分类学上的应用也越来越广泛，且多是依据16S rDNA可变区设计特异性引物，与其保守区域引物协同使用，进行菌种水平的鉴定，包括鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副酪乳杆菌[21]、短乳杆菌[22]、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、唾液乳杆菌[23]、婴儿双岐杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌[24]、青春双歧杆菌、齿双歧杆菌[25]、无乳链球菌[26]和乳酸乳球菌[27]；也有上下游引物都是依据保守区域设计，这样可进行更为广阔范围的LAB鉴定，如S Goto 等设计明串珠菌属特异性的PCR引物[28]，而S Nakano等甚至依据16s rDNA设计群特异性引物检测乳杆菌属和足球菌属的耐醋酸性LAB[29]。
特异性PCR用于LAB的种属鉴定是很方便直观的，但是用于种属之内的菌株鉴定却很麻烦，因为随着进化距离的降低，同源基因（包括rDNA）的多样性也不是很有效的，关系接近菌株的遗传关系也不容易做出准确的界定。研究表明，16S～23S rRNA基因间序列（intergenic sequences, ITS）能够克服这个问题 [6,30,31]，因为ITS区域的进化压力较小，所以可以提供更大的遗传变异。但是需要针对每一菌株都进行特异性引物设计，这无疑降低了实验的可操作性。
3. 多重PCR
多重PCR（Multiple PCR），是指在1次PCR反应中使用多套/个引物，针对多个乳酸菌DNA模板或同一LAB模板的不同区域进行扩增的过程，依据扩增片段的有无和长短差异做出鉴定。针对于多个DNA模板的多重PCR可同时检测出几个乳酸菌属[32]/菌种[8,12,33～36]甚至是几个菌株[26]，这取决于特异性PCR引物靶基因的序列特异性；而针对于同一LAB模板的不同区域进行扩增，可以增加鉴定的特异性和检测的准确性，且多为菌种水平[9,31,37,38]，也可达到菌株水平[39]。另外也可通过PCR的嵌套来扩大检测的范围[40]。
Multiple PCR在一个反应管中能够同时检测多种目的DNA，可同时满足分析不同DNA 序列的需要，这不仅能节省珍贵的实验样品，而且能使以往繁琐的操作变得省时省力。一般来说，扩增的靶序列越多，准确性和可靠性越大。多重PCR的主要局限性与PCR反应条件的优化（即退火温度、退火时间以及引物浓度的相对比例）有关，这使得必须选择有相似反应条件的引物，尤其是退火温度。如果有适当可用的序列信息，那么建立和确定潜在的多重PCR方案是可行的。
4. 群落分析技术
群落分析技术应用于LAB的鉴定方面是基于高分辨率的电泳系统，如单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism, SSCP）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis, TGGE），甚至可检测出1个碱基的序列差异。其基本原理是依据单一rRNA基因的构象差异以及双链rRNA基因的化学稳定性和解链温度的差异对其进行分离, SSCP是基于单链构象的多态性进行中性聚丙酰胺凝胶分离；DGGE的聚丙酰胺凝胶是由一个线性的变性梯度组成的，这个线性的变性梯度是由尿素和甲酰胺形成；而TGGE 中是一个线性的温度梯度。群落分析技术进行LAB的鉴定，多是进行等长16S rRNA特异性PCR扩增子的总体描绘，不仅能够进行多样性的快速判断，同时也可进行多样品的分析[41～44]。
SSCP只适合长度小于200bp的序列检测，而DGGE/TGGE能够进行500bp以下的序列测定，它们的另一个限度是，异种序列也可能有相似的迁移，因此凝胶中相同位置的条带并不能必然地说明它们在系统发生学上是密切相关的。通过缩小梯度可增强分辨率，但是图谱的随后鉴定工作（如杂交分析或者切离条带的克隆测序）也增加了鉴定的复杂性，尽管可以通过选用低拷贝的同源基因作为靶序列以减少所检测的序列数目来降低鉴定的复杂性[45]；也可通过PCR的嵌套来降低对扩增子进行克隆测序的必要性[46]。此外，这些突变检测系统的价格昂贵（约13000美元），也使其广泛应用受到了限制。
5. 遗传指纹技术
改进的遗传指纹技术依赖于特异性PCR扩增子的REA的多态性，PCR-RFLP是先用特定引物特异性扩增基因组DNA，然后用适当的限制性内切酶切割扩增产物，电泳检测多态性[15,47]，而扩增rDNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA）是基于16s rDNA的RFLP[48～50]。末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）是指应用荧光标记的引物进行PCR，可以产生荧光标记的特异性序列扩增子，随后的限制性酶切以及在高分辨率凝胶中的可视化荧光标记的末端片段，就形成了T-RFLP图谱[51,52]。T-RFLP的主要优势就是改良的分辨率，这是由核酸测序和数字输出提供的，所以比电泳系统的分辨率更高。T-RFLP能够确定基因型的精细差异，也表现了良好
的灵敏度和高效性。迄今，大多数T-RFLP 主要集中于16S rRNA序列。然而，其他的遗传标记（如hsp基因、谷氨酰胺合成酶、ATPases和拓扑异构酶标记）在评估生物多样性方面也是有用的。总的来说，较之那些利用全基因组的方法（如PFGE、RAPD和AFLP），rRNA 基因的保守性限制了这些技术的辨识力[53]。
6. 序列同源性分析法
最可靠的鉴定就是进行核苷酸测序，同源性分析就是依据某一同源基因序列的保守区域设计通用引物，对LAB基因组DNA进行PCR扩增，随后进行扩增子的测序，而后利用一些必要的计算机软件（如Clustsal W、Tree View、Sequence、Philips和Treecon等）将其与数据库（如Genbank、EMBL、DDBJ、RDP和ARB等）中的同源基因序列进行同源性比较，进而绘制系统进化树，从而做出鉴定。
当前主要是以16S rDNA作为生物系统发育的分子标记，16S rDNA的核苷酸序列为系统发育的分析和鉴定提供了精确的基础 [54,55]，其V1～V3可变区含有种属特异性序列，适合于进行同源性分析，但只有进行全16S rDNA测序得出的结果才是最准确的，这就意味着大约需要测序1500个碱基。目前定义菌种最可靠的方法是DNA-DNA杂交技术，并认为其与16S rRNA序列同一性一致，普遍认为拥有70%或更高DNA相似性的菌种通常有超过97%的16S rRNA序列同一性。但是16S rRNA序列同一性却不能充分的保证两个分类单元同属一个种，这说明16S rDNA序列分析尚不能够取代DNA-DNA杂交来描绘菌种和计量种内关系。研究表明，乳酸菌16S～23S基因间DNA序列是超变量，如缺乏tDNA（小间隔序列）时其长度约为200bp，也具有充分的种属特异性，可设计PCR引物用于LAB的鉴定，比较乳酸菌16S～23S 基因间序列的相似性，是一种实用的菌株鉴定方法，这些相对较短的序列不仅容易测序也容易比较[5,56,57]。此外，也有用蛋白/酶编码基因序列作为生物系统发育标记，如recA序列[12,22]、ldh序列[24]、sodAint序列[4]和tuf序列[19]。
7. 随机扩增多态性DNA
随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD），是利用短的随机引物（通常为10-mer）低要求的随机扩增LAB基因组DNA，进行扩增片段的分离后即可给出一个清晰可辨识的指纹，即一个RAPD基因型。RAPD是一个简单快速廉价的方法，但是其重现性低，主要是因为反应条件的小小变化就可引起图谱的改变，因此RAPD必须在可控制的条件下进行，只有进行小心仔细的优化才能够确保结果的可重复性。已证实RAPD分型用于大多数LAB种内和种间特异性鉴定的可靠性[6,21,58,59]。事实上，RAPD是用于分析食品相关LAB中最广泛的技术，其辨识力仅仅低于PFGE分析，更适用于菌株水平LAB的快速鉴定。RAPD的优点是：DNA需要量少、对DNA质量要求不高；操作简易、分析快速；一套引物可用于不同生物的整个基因组的分析、检测的多态性高。其不足之处是提供的信息量不完整、重复性较差[27,60～62]。
此外，多重RAPD（RAPD和多个随机引物）已成功用于LAB分离株的鉴定[63,64]，这更增强了RAPD技术在LAB菌株水平鉴定的应用性，尤其是在RAPD与信息学技术联合应用的情况下[65,66]。另外也有报道应用RAPD筛选LAB的种特异性和菌株特异性探针和PCR引物[67,68]。
8. 其他以PCR为基础的LAB鉴定方法学
8.1 扩增片段长度多态性
扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）分析是以全基因组DNA限制性片段的选择性扩增为基础的，随后对DNA片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。AFLP分析最初用于植物分类学，后来发现AFLP对于细菌来说也是一个非常有用的指纹技术，可用于菌种和菌株水平的鉴定。迄今为止，AFLP主要用于流行病学以及食品源性病原体毒力指标的测定研究（如李斯特杆菌和沙门菌），也有利用这一技术对种族遗传学上关系密切菌种（戊糖乳杆菌、植物乳杆菌和类植物乳杆菌）进行种水平的鉴定[69]。
8.2 重复非基因回文序列PCR
重复非基因回文序列PCR（repetitive extragenic palindrome-PCR, rep-PCR）的基本原理是利用LAB基因组上短小、高度保守且反复的序列为 PCR扩增的模板，PCR扩增后产生一些 DNA 片段的图谱，据此来断定细菌间的亲缘关系，可用于LAB亲缘关系的分类，当前主要用于菌种水平的鉴定，如乳酸乳球菌、海格乳杆菌和短乳杆菌，且已经证实不能够用于乳酸乳球菌亚种水平的鉴定[27,67,70]。
8.3 小卫星序列多态性
小卫星序列多态性（Minisatellite polymorphism）分析是以LAB基因组的串联重复序列，即小卫星序列（如6个或更多核苷酸的重复单位）的扩增为基础，据PCR扩增后产生的 DNA 片段图谱来判断LAB间的亲缘关系。P Quenee等鉴定了乳酸乳球菌的7个小卫星序列，并证实了小卫星序列分析是乳球菌株多样性的一个有价值的工具。证明：最大的多态性出现在编码输出蛋白的开放读码框内或者是基因间区域中；2/3的小卫星序列是没用的，尽管在串联重复序列中多达90％是相同的；基于RAPD和小卫星序列分析的树状图表是相似的[62]。
8.4 连接酶链反应
连接酶链反应（Ligase chain reaction，LCR）是一种新的DNA体外扩增和检测技术，是1997年Backman为检出靶基因序列中的点突变而设计发明的。LCR的基本原理为利用DNA连接酶特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增。LJ Ward等发现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种16S rRNA基因序列的前200bp内有9～10碱基是有差异的（依赖于菌株），利用序列180处的单碱基差异建立了1个LCR，进行亚种序列的鉴定[71]。
8.5 长度异质性PCR
长度异质性PCR（length heterogeneity-PCR, LH-PCR）是依据LAB菌株16S rRNA基因序列长度的自然变异来鉴别微生物的，其将PCR扩增与自动测序系统（荧光标记DNA扩增片段的激光检测）结合起来，用于研究微生物菌群的DNA指纹技术。C Lazzi1等应用 LH-PCR 研究不太复杂的菌群（乳酪天然乳清发酵剂），采用荧光标记的上游引物63F和未标记的下游引物355R扩增16S rRNA基因可变区的Domain A，扩增片段的长度范围是285–346 ± 1 bp，但是LH-PCR不能够鉴别德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种[72]。
LH-PCR有许多优点：方法可靠、有效、重现性高；理论上不仅可以进行优势菌群组成
的定性测定也可进行定量；可快速获得结果，较之那些通过传统凝胶电泳进行片段分离的技术（如DGGE/TGGE）进行过夜电泳，LH-PCR分析仅仅需要30～40 min。但是，LH-PCR和其他PCR基础方法一样，也有PCR所固有的典型偏见，如特定引物对的优先退火、渐增PCR 循环引起嵌合体PCR产物的发生率。此外，仅仅优势菌群可能扩增，因此许多的少量成员不能够检测到[73]。
8.6 单个碱基C-序列/测序
单个碱基C-序列/测序（Single Base C-Sequencing, SBCS）是在测序反应中应用dd-CTP's 替代4种双脱氧碱基，并且引物是荧光标记的。V Storms等应用16S rRNA基因前500个碱基的SBCS方法和毛细管电泳联合起来鉴定30株链球菌属的相关菌株，几乎所研究的全部菌种都产生了可辨识的图谱，证实了16S rRNA基因前500个碱基的SBCS对于乳酸菌菌种水平的鉴定来说是很有用的，也是可广泛应用的方法，同时相比于全顺序测定来说，此方法更加快速也更加容易自动化[74]。
此外，近年来，还可见应用于LAB鉴定的位点专一PCR（site-specific PCR, S-PCR）技术，P Basaran等基于乳酸乳球菌乳脂亚种的一个缺失区域设计位点专一引物，建立了一个快速灵敏的乳酸乳球菌乳酸亚种和乳脂亚种鉴定方法[75]。
综上所述，可以看到当前LAB分类学的发展趋势，分子生物学技术，尤其是PCR、核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，以及生物信息学的蓬勃发展都为LAB分类和鉴定的研究打开了新视野，打开了LAB快速准确鉴定的大门。只有分子生物学才能解决LAB鉴定的复杂性，但是其也各有局限性，因此对于LAB的分类鉴定，采用多相研究或者组合方法常常是必需的[76,77]。
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Application progression of PCR technique in taxonomy and identification of lactic acid bacteria
Wang Tingzhu, Gao Xuejun, Yang Zhenyu
(The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural
University, Harbin 150030, China)
Abstract
For the past few years, a lot of new methods for lactic acid bacteria taxonomy emerged, along with the quick development of the molecular biology and bioinformatics, especially for the the PCR technique as the milestone of biotechnology together with the nucleic acid sequencing technique and electrophoretic technique which were unceasingly improved and consummated, such as RAPD, PCR-RFLP, T-RFLP, ARDRA, PCR-SSCP, PCR-DGGE, PCR-TGGE, AFLP, REP-PCR, S-PCR, LCR, LH-PCR, SBCS, minisatellite polymorphism and sequence homology analysis. In this overview, the application progression of these techniques in taxonomy and identification of lactic acid bacteria as well as their predominance and limitations were discussed.
Keywords: Lactic acid bacteria, PCR, taxonomy, identification, molecular biology
作者简介：王庭柱（1980-），男（汉族），河北承德人，在读硕士研究生，主要从事乳酸菌的生物化学与分子生物学研究。
乳杆菌属（Lactobacillus）内13个新种的分类东北酸菜是我国传统的发酵制品,主要分布在我国东北地区,酿造和食用历史悠久,以自酿酸菜为采集菌种的来源。西藏地区的自然发酵酸奶已经有几千年的历史,具有独特的营养价值,它们中都蕴藏着丰富的乳酸菌资源。 本研究的目的是通过多相分类手段对从东北酸菜中分离得到的12个潜在乳酸菌新种和从西藏酸奶中分离得到的1个潜在乳酸菌新种进行鉴定,确定它们的分类学地位。采用多相方法进行鉴定,包括16S rRNA基因序列分析,phe S基因序列分析,rpo A基因序列分析,DNA G+C mol%测定,平均核苷酸一致性分析(ANI),脂肪酸甲酯(FAME)分析和表型特征分析。 菌株54-2~T与Lactobacillus composti、Lactobacillus floricola、Lactobacillus selangorensis、Lactobacillus perolens、Lactobacillus harbinensis和Lactobacillus shenzhenensis处于一个系统发育分支,16S rRNA 基因序列相似性在90.4-96.5%之间;phe S基因序列相似性在56.7-74.6%之间;rpo A基因序列相似性在57.2-81.6%之间;ANI计算结果分别在66.26-72.50%之间。菌株54-5~T、143-6~T、247-4~T、17-4~T和143-1~T与Lactobacillus dextrinicus和Lactobacillus concavus处于一个系统发育分支,16S rRNA基因序列相似性为94.9-99.9%;phe S基因序列相似性在70.1-83.1%之间;rpo A基因序列相似性在81.0-98.3%之间;ANI计算结果在70.34-81.73%之间。 菌株33-7~T、116-2~T、184-8~T、204-8~T、8-1(1)~T,256-3~T和M1575~T 与Lactobacillus tucceti、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus insicii、Lactobacillus allii、Lactobacillus metriopterae、Lactobacillus terrae、Lactobacillus versmoldensis和Lactobacillus furfuricola处于一个系统发
乳酸菌及其乳酸菌发酵食品 发酵是一种古老、传统的食品储存与加工的方法，凡利用微生物的作用而制得的食品都可以称为发酵食品。发酵食品是人类巧妙地利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和营养价值，丰富了我们的饮食生活。发酵食品因在食品加工过程中有微生物参与作用，进而可以形成一些特异性风味物质和营养因子，如乳酸菌参与牛乳发酵，产生乙醛、丁二酮、丙酮、3-羟基丁酮、挥发性酸等芳香物质，以及胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等营养因子。 乳酸菌是发酵食品最主要的有益微生物之一，人类对于乳酸菌的应用历史非常久远，在远古人类就在酿造食品方面不自觉地利用了乳酸菌。但是，人类能主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，还是近百年的事。 1 乳酸菌 1.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是一类以糖为原料产乳酸为主的细菌的总称，乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae)。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Strptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 1.2 乳酸菌的基本特性 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，可使培养基pH 值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1.3 乳酸菌的发酵类型 乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。异型乳酸发酵是指发酵终产物中除乳酸外,还有乙醇、二氧化碳等成分的乳酸发酵过程，以明串珠菌属的乳酸菌以及某些乳酸杆菌,如肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露醇乳杆菌等。双歧发酵是双歧杆菌的产能模式，双歧杆菌是一类特殊的严格厌氧菌,对营养要求较高,它们对葡萄糖的代谢也可归入异型乳酸发酵,但与其他乳酸菌的异型发酵不同。 1.4 乳酸菌的代谢产物 乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等，具有抗菌防腐的作用，并带给食品酸性的口感；细菌素又称乳酸菌素，具有固定抗菌谱，对病原菌和腐败菌具有很强的抑制能力；乙醛等芳香物质给乳酸菌发酵食品带来独特的发酵风味；胞外多糖作为生命物质的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节；γ-氨基丁酸是神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善脑机能，调节情绪抗焦虑，降低血压等方面具有重要作用。
酸奶中乳酸菌的筛选试验 一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法 二、实验原理： 市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。 .筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离 三、实验药品及仪器 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。 仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接
种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机 四培养基类型 ①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min ②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。 配制方法：1把除CaCO3以外的成分称量溶解后.调PH至6.2～6.4； 2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液； 3.将培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌； 4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干了以后再接种。 五、实验流程 1、吸取酸奶1ml 2、10 倍梯度稀释平板涂布（改良MC Medium） 3、厌氧培养（28℃培养48h）待形成菌落 4、挑取溶钙圈较大的单菌落→ 观察、记录菌落形态与特征 5、Improved MC Medium 划线分离纯化 6、选取溶钙圈较大的单菌落进行G+染色 7、革兰氏阳性菌（G+菌）→ 记录菌株细胞形态
乳酸菌的分類 1.乳酸菌的分類: (1)是一類可發酵利用碳水化合物而產生大量乳酸的細菌。 (2)大多數細菌都能產生或多或少的乳酸 →不能認為凡是產乳酸的細菌都是乳酸菌。 2.乳酸菌的分類体系→(1)生化狀態分類法(2)化學分類法。 3.按照Bersy細菌學手冊中的生化分類法: 乳桿菌屬(Lactobacillus) 鏈球菌屬(Streptococeus) 乳酸菌有5個屬明串珠菌屬(Leuconostoc) 雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 片球菌屬(Pediococcus) 每個屬中又有很多菌種，一些菌種還包括數個亞種。 4.乳桿菌屬: (1)一般呈細長的桿狀，大小為0.5～1 μm x 2～10 μm，常呈 鏈狀排列。G(+)，無芽孢菌，微需氧。 (2)目前已實際應用的，主要有： 德氏乳桿菌(L. delbrueckii)、保加利亞乳桿茵(L. bulgaricus)瑞士乳桿菌(L. helviticus)、嗜酸乳桿菌(L. acido phlus)和乾 酪乳桿菌(L. casei)及其亞种等；短乳桿茵(L. brevis)和發酵 乳桿菌(L. fementi)。 5.鏈球菌屬乳酸菌: (1)一般呈短鏈或長鏈狀排列，為無芽孢G(+)，兼性厭氧。
(2)有些屬於人或動物的病原菌: 如能引起牛乳房炎的無乳鏈球菌(S. agalactiae)和人咽喉炎的溶血鏈球菌(S.haemolytlcus)。 (3)有些能引起食物變質而常用于特種乾酪(羅馬諾乾酪)製造上 ，如糞鏈球菌(S. faecalis)和液化鏈球菌(S. liquefaciens)。 (4)有些則是發酵乳製品生產上常用的菌種，如乳酸鏈球菌(S. lactis)、丁二酮乳酸鏈球菌(S. diacetilactis)、乳酪鏈球菌 (S.creamoris)和嗜熱乳鏈球菌(S. thermophilus)等。 6.明串珠菌屬: (1)呈圓形或卵圓形，菌体排列成鏈狀。經常存在于水果、蔬菜 中，能在高濃度的含糖食品中生長。 (2)該屬乳酸菌可發酵利用葡萄糖產生CO2、乙酸和乳酸。依据 此特性可將明串珠菌從鏈球菌中區別開(鏈球菌不產生CO2，而且生成L-乳酸)。 (3)常見的菌种有腸膜明串珠菌(Leuc. Mesenteroides)及其乳脂亞 种(Leuc. Cremoris)和葡聚糖亞種(Leuc. Dextranicun)、蝕橙明串珠菌(Lcuc. Citrovorum)、乳酸明串珠茵(Leuc. Lactis)和酒明串珠菌(Leuc. Oenos)等。它們均可用在發酵乳製品生產上。 (4)腸膜明串珠菌乳脂亞种（又稱乳脂明串珠菌）最為常見，它 能發酵檸檬酸產生特殊風味物質，故又稱風味菌、香氣菌或產香菌。 7.雙歧桿菌: (1)因菌体尖端呈分支枝狀（如Y或V字形）而得名，是無芽孢
PCR技术在乳酸菌分类鉴定中的应用 王庭柱，高学军，杨振宇 东北农业大学教育部乳品科学重点实验室（150030） E-mail：wangtingzhu1980@https://www.doczj.com/doc/3c8113617.html, 摘要：近年来，随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的PCR技术以及核酸测序和电泳技术的不断改进与完善，产生了许多新的分类学方法，如RAPD、PCR-RFLP、T-RFLP、ARDRA、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGE、AFLP、REP-PCR、S-PCR、LCR、LH-PCR、SBCS以及小卫星序列多态性和序列同源性分析等。本文即论述了这些技术在乳酸菌分类鉴定中的应用及其优势和局限性。 关键词：乳酸菌，PCR，分类，鉴定，分子生物学 1. 引言 乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一大类缺乏细胞色素、糖代谢主要以乳酸为终产物的革兰氏阳性非芽孢细菌，其过氧化氢酶反应为阴性、耐氧耐酸、营养要求复杂并且严格发酵。LAB这个名称就细菌分类学而言实属一个非正式、非规范的名称。目前从自然界中已发现的这类细菌在分类学上至少可划分为23个属，涉及到的有关菌种则更多，其代表性的菌属有乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属、气球菌属、肉杆菌属、酒球菌属、足球菌属、四体球菌属和漫游球菌属等[1,2]。 传统的LAB鉴定方法主要依赖于表型分析，包括形态学观察、生长需要及特性、发酵图谱、细胞壁蛋白分析、血清学以及脂肪酸甲基酯分析等，其中有些技术已被证明适用于某些LAB的鉴定，但是也普遍意识到表型分析的一些缺点，如重现率及辨识能力低、相似的表型特性并不等同于相似的或者关系密切的基因型[3]。表型试验可能的固有问题是，不是每一给定种内的所有菌株都有一个共同的性状，而且即使是同一菌株也可能呈现出一定的生化变异性。此外，实验操作的一点改变也可能产生错误的结果。因此基于表型试验的常规技术并不能对菌株做出明确的鉴定[4]。一般来讲，准确地鉴定一株乳酸菌至菌种的水平，至少需要17种表型实验[5]，但是微生态系统的分离株需要更为简单快速的鉴定方法。因此，需要进行表型特性的分子水平研究和遗传特性的研究。 只有分子生物学技术才能解决LAB鉴定的复杂性。近年来发展起来的核酸技术如DNA 杂交和特定靶序列的扩增技术，对LAB的鉴定是一种改进和补充。在LAB分类学方面，代表性的遗传学方法是限制酶分析（restriction enzyme analysis, REA）的多态性（如PFGE、RFLP 和核糖分型）和PCR技术[3]。REA是进行基因组DNA的限制性内切酶消化。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE）是经酶切后，分离出大量的基因组片段；限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）指的是酶切后含同源序列的酶切片段在长度大小或数目上的差异；而核糖分型（Ribotyping）是以rDNA和/或其间隔区域作为探针，与基因组限制片段进行杂交。PFGE是菌株分类中最有识别力的方法，但是基因组DNA的所有限制片段的完全分离是个困难；迄今，最佳辨识力的遗传探针是种特异性的[6]；而PCR技术以及以PCR为基础的遗传指纹技术和群落分析技术甚至可以进行高度菌株特异性的LAB鉴定。 PCR技术的创立打开了LAB快速鉴定的大门，其不仅操作简便、快速可靠并且灵敏高效，而且还克服了对培养的依赖性（自然界中有85～99.9%的微生物至今还不能进行纯培
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙； 0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
乳酸菌的简介 一、乳酸菌的起源 根据圣经旧的书上记载，公元前4000多年，人类已经开始发酵乳酸肉制品及蔬菜腌渍物。直到公元1857年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微小生物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微生物作用所致的秘密才首次得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。1873年李斯特(Lister)利用稀释法，由酸乳中纯化分离出Bacterium lactis，也就是目前的Lactococcus lactis，这是乳酸菌最早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。 二、乳酸菌的定义 乳酸菌一般是指能将碳水化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐木隆,1998)。乳酸菌群具有以下几点特性： 1.为革兰氏阳性(gram positive)球菌或杆菌。 2.不产生孢子(nonsporting)且无运动性(nonmotile) 3.不具分泌催化酶(catalase negative)之能力。 4.可在有氧环境生长，但以无氧状态下生存较佳，亦有绝对厌氧者。 5.需有碳水化合物、胺基酸、维生素等多种生长因子方能生长之复合营养需求 性(complex nutritional requirements)。 6.依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发 酵(heterofermentative)两种乳酸菌。同质发酵性乳酸菌含有aldolase，最终产物90％-100％为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有phosphoketolase，其最终产物除了40％-50％的乳酸外，还包括乙醇、二氧化碳及醋酸等多项产物(Ingledew,1995)。 乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有利于生存的条件，故消化道三大菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997) 三、乳酸菌的分类 乳酸菌一般包括Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及Pediococcus (Ped.)四属；广义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。近年来依据DNA和RNA序列相似性比对，将传统特上归类不明的菌属，一一明确独立成群，并赋与分类上之位置；至1999年底为止，乳酸菌共被分成18个属，分别为Abiotrophia、Atopobium、Bifidobacterium、Carnobacterium、Enterococcus、Lactobacillus、Lactococcus、Lactospaera、Leuconosto、Oenococcus、Pediococcus、Sporolactobacillus、Streptococcus、Tetragenococcus、Vagococcus、Weissella、Granulicatella、Paralactobacillus(李, 2000)。其中Streptococcus属及Enterococcus属中的部份菌株对人类及动物具有病原性，Bifidobacterium属、Pediococcus属及Leuconostone属中的少数菌种，曾有报告指出在人类感染病例中被分离到(Gasser, 1994；Donohue & Salminen, 1996)。而Lactobacillus属及Lactococcus属两者则普遍被认为对人类及动物体无害
分子生物学实验作业 ——用分子生物学方法鉴定菌株 专业：生物化工 姓名：王晓娜 学号：1043111039
鉴定一株乳酸菌菌株 一、实验目的和方法 采用RAPD指纹图谱方法鉴定一株乳酸菌菌株 二、实验材料 2.1 菌株 实验给定的菌株 2.2 试剂 Taq DNA聚合酶、DNA电泳buffer、引物、dNTP、模板DNA
2.3 仪器 台式离心机，PCR仪，稳压稳流电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统 三、实验步骤 3.1 制备细菌DNA样品 收集菌悬液于1.5mlepp管中，5 000r/min离心5min。去上清，在沉淀中加入567微升 TE缓冲液、30微升10％的SDS、5微升10mg/ml 的溶菌酶后，37℃水浴3h。再加入3微升20mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴lh。加入100微升5mol/l NaCl，80微升CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min。加入等体积的氯仿／异戊醇，12 000r/min离心5min。取上清，加入等体积酚／氯仿／异戊醇，12 000r／min离心5min。取上清，加入2倍体积的冰乙醇，12 000r/min离心10rnin，沉降DNA。去上清，将沉淀吹干，用100微升TE缓冲液(pH8．0)溶解。取l微升 DNA样品，稀释200倍后，紫外测定0D260和0D280。选取浓度1．8≤0D26l／0D280≤2．0的样品。然后，将DNA浓度稀释至48ng/μl作为模板备用。 3.2 PCR反应 扩增体积为25μl (含TapDNA聚合酶2u，10×PCR reaction buffer 2μl，dNTP 2μl，引物lμl，模板DNA 1μl)。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，38℃复性lmin，72℃延伸2min，进行40个循环后72℃延伸10min。取12μl扩增产物进行电泳，电压为100V，琼脂糖凝胶为l％(0．5×TBE)电泳30—40min，用凝胶成像系统观察
乳酸菌的种类 微生物可依据革兰氏染色（阴性还是阳性）、菌的状态（球形还是杆形）、生存条件（需氧还是厌氧）、排列形态、碳水化合物的利用特性、代谢物等来进行分类。最近，通过对遗传基因序列的调查，发现它也同样适用于微生物的体系分类。 但是，如果新的分类基准被订立的话，这种较方便的区分法也可能会被随时改变。作为实例来讲，双歧杆菌属过去被称为杆状双歧杆菌，后来又变更为乳酸菌双歧杆菌。1986年，又变成为了双歧杆菌属。 现在，以人体大肠内繁殖的乳酸菌和其他微生物来举例说明：在人体肠内有数十亿的微生物，从这里采集到的食物里，我们会发现很多种类的微生物。为了分离这些微生物需要并用多种培养方法。 参考促进微生物生长的营养素、色素等特性，并对其进行分离分类是科研人员的主要工作。因为乳酸菌属于微生物的一种，所以同样可以按照革兰氏染色、菌的形态、生存条件和排列状态来进行分类。 一般来说，我们正在使用的乳酸菌从大的方面可分为6个属：棍状的乳酸杆菌属、球状的链球菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌属、小球菌属、乳球菌属。
是由lacto(意为牛奶乳糖)和bacillus(意为杆状菌)合并起来产生的名称，是指能分解牛奶里乳糖的棍棒模样的菌。 与其他的乳酸菌相比，对乳酸杆菌科学效能的研究是最多的。从学术和产业的角度来讲，乳酸菌是被最广泛应用的一种菌。乳酸杆菌包括：保加利亚乳杆菌、干酪乳酸菌、嗜酸乳杆菌等。 保加利亚乳杆菌 这种菌含有起源于保加利亚的意思。是从保加利亚 地区人们喜欢饮用的发酵乳产品里发现的一种乳酸菌。 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei shirota) casei 意为奶酪。 这种棍棒模样的乳酸菌，主要在小肠内活动。在人 体内不会被消化液、胆汁杀死，具有使小肠内菌群正常化和 净化大肠的效果。 作为耐酸性较强的特殊乳酸菌，在净肠和促进消化 方面，对人体起着非常有益的作用。 嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus asidophilus) 作为乳酸菌的一种，这种棍棒型的乳酸菌作为较强 的耐酸性菌，能阻止肠内腐败性微生物的滋生，并且有抗癌、 降低胆固醇和促进维生素B 群形成的作用。 SNUL 菌 作为嗜酸乳杆菌的代表，对降低胆固醇有非常明显
乳酸菌的分离和初步鉴定 刘海音张超 (长春师范学院生物系，长春，130032) 摘要：本文采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌，经过连续6次以上的传代，以达到分离提纯，镜检时观察到链球状和杆状两种形状。为了鉴定分离出的菌种，做了一系列的生理生化反应实验，如吲哚试验的反应结果为阴性，糖发酵试验的反应结果为阳性。此外还进一步做了小型发酵实验，检测出了乳酸的存在⑴。以上实验结果符合乳酸菌的特征，从而证实该分离出的菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌。 关键词：乳酸菌分离鉴定 乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。本报告采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选和分离乳酸菌，利用镜检观察到了链球状和杆状两种形状。通过吲哚试验和糖发酵试验以及小型发酵实验证明该菌种为乳酸菌，杆状的叫做短乳杆菌，链球状的叫做乳链球菌 1.材料和方法 1.1材料 1.1.1选用沈阳乳业有限责任公司乳品一厂生产的辉山纯酸奶 1.1.2 培养基 BCG牛乳培养基 A(溶液)：脱脂奶粉100g, 水500 ml, 加入1.6%溴甲酚绿（B.C.G）乙醇溶液1 ml, 80 摄氏度灭菌20 min. B(溶液)：酵母膏10 g, 水500 ml, 琼脂20 g, PH : 6.8 121摄氏度灭菌20 min 以无菌操作趁热将A ,B 溶液混合均匀后倒平板。 乳酸菌培养基 牛肉膏5 g , 酵母膏5 g , 蛋白胨10 g ,葡萄糖10 g , 乳糖5 g , 氯化钠5 g , 水1000 ml , PH : 6.8 121摄氏度湿热灭菌20 min 蛋白胨水培养基
乳酸菌的功能·应用及大量增殖生产技术 首先我们来认识一下乳酸菌是什么，以及它有什么特点及功能，这样就使我们能对乳酸菌的市场前景具有很好的认识： 一． 乳酸菌简介 什么是乳酸菌 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。乳酸菌存在于动物及植物中，在国外有时被称为植物性乳酸菌和动物性乳酸菌，从分类学来讲没有具体的分类，因为不管是以葡萄糖和乳糖为食的乳酸菌、他们的遗传因子是没有区别的。 乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种, 从形状上来看有乳酸杆菌和乳酸球菌，单个细胞的大小约0.5-10μm 。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，目前已被国内外生物学家所证实，其广泛存在于人体及动物的肠道以及各种植物中。而肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。 乳酸菌在有氧环境能够生存，但是喜欢在氧气很少的环境生存，是通性嫌气性菌。 中文学名： 乳酸菌 界： 细菌界 门： 厚壁菌门Firmicutes 纲： 芽孢杆菌纲Bacilli 在很久很久以前乳酸菌就和人类有着关联了，奶酪（是奶乳经乳酸菌发酵后的目： 乳杆菌目Lactobacillales 科： 乳杆菌科Lactobacillaceae 属： 乳杆
食品）在大约8000年前在格里斯河流和发拉底河流之间的狭长地区（现在的伊拉克）就被生产了，这就是最早的乳酸菌食品。 在中国历史上和乳酸菌的渊源也很早，东汉末年，中国大约有数百万人死于霍乱病的肆虐传播。公元200-205年，张仲景因而编撰成书具有划时代意义的《伤寒论》，在书中总结了艾蒿草的治疗方法。现代科学的研究表明，起到神奇功效的其实是艾蒿草中富含的乳酸菌。正是乳酸菌控制了瘟疫的蔓延，奇迹般地解救了中华民族。 在现代社会，乳酸菌的应用带来了一场乳酸菌的革命，中国科学院金锋教授的著书《乳酸菌革命》(日本株式会社评言杜2009年出版)中指出，研究表明：乳酸菌在工业、农业、畜牧业、医药及人们的日常生活中有着广泛效用。 二．乳酸菌的作用 乳酸菌对人体及动物（包括水产动物，以下统称动物）的作用： 乳酸菌在动物体内能发挥许多的生理功能。正常情况下在人体和动物的整个消化系统中，都寄生着大量微生物。大量研究资料表明，乳酸菌能促进动物生长，调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效果；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长：提高机体免疫力等。改善胃肠道功能，维持肠道菌群平衡， 乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表向成分等物质具有生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、免疫反应和应激反应等产生作用。就人体及动物体内所寄生的微生物作用而言，可分为三类： ①．共生性类型，主要是兼性厌氧菌，在生态平衡时，它们的维生素和蛋白质合成、消化吸收、生物拮抗和免疫等功能对宿主有利。
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名.这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。此外，这类菌中有些细菌又是人畜的致病菌，因此受到人们极大的关注和重视。 凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。 1.存在分布 乳酸菌也广泛存在于畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中。乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应
等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。 乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。 在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，双歧杆菌、屎肠球菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肠杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。2.生理功能 1．防治有些人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。 2．促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B族等大量有益物质。 3．增加肠道有益菌群，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。 4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。5．抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。 6．免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力 7．抗肿瘤、预防癌症作用。 8. 人体内毒素水平，保护肝脏并增强肝脏的解毒、排毒功能。
乳酸菌的鉴定 吲哚试验 1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。 3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 糖发酵试验 1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。 3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。 1.2.3 乳酸的检测 选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。 1.结果和分析 2.1 乳酸菌的分离提纯 在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下 观察到了链球状和杆状两种形状（如图一 2.2乳酸菌的鉴定 该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。 说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证
分子技术在食品乳酸菌分类和鉴定中的应用 近年来,乳酸菌的各种菌株用于多种食品和益生产品。由于乳酸菌的益生功效为菌株依赖性,而单纯采用表型鉴定方法都无法准确鉴别到种属水平。而基于DNA的基因型鉴定技术,因其检测的准确、稳定和灵敏可以实现乳酸菌种属甚至菌株水平的分类和鉴别。本文对目前的主要分子技术在乳酸菌菌株分类和鉴定中 的应用做一综述。 标签： 乳酸菌;益生菌;鉴定;食品;分子技术 随着人们生活品质的提高,人们广泛关注益生菌食品。益生菌是指一类活的,摄入足够量就可以通过改善肠道微生态平衡而促进人体健康的微生物。目前益生菌中应用较多的是乳杆菌和双歧杆菌。益生菌功效主要集中在维持和调节机体的正常肠道菌群上并由此产生一系列的益生作用,但其益生功效为菌株依赖性。由中国疾控中心营养与食品安全所牵头的研究结果证实,含有B益畅菌(即双歧杆菌DN173010)的酸奶能缩短肠道传输时间,对肠易激综合征人群、便秘人群的胃肠道有明显的改善效果。由于不同菌株改善肠道的机制不同,所以对乳酸菌在菌株水平的鉴定就至关重要。传统的表型法鉴定主要建立在形态学及生理生化特征基础上,但因其种间生化性状相似,单纯使用该法往往无法准确区分各个种。随着分子标记技术的发展,基因型鉴定法以核酸为检测对象,因其更加灵敏和准确而被国内 外学者用于乳酸菌的鉴定。 1 乳酸菌 乳酸菌是存在于人体内的益身菌。按照生化分类法,用于食品中乳酸菌分为5个属:乳秆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)和汁球菌属,每个属包括多种菌种,某些菌种还包括数个亚种。目前益生菌产品中应用较多的是乳杆菌属(Lactobacillaceae L)和双歧杆菌属(Bifidobacteria B)。乳杆菌属中同型发酵乳秆菌包括:德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、瑞士乳秆菌(L.helveticus)、嗜酸乳秆菌(L.acidophilus)和干酪乳杆菌(L.casei);异型发酵乳杆菌包括:短乳秆菌(L.brevis)和发酵乳杆菌(L.fermentum),主要用于发酵工业。双歧杆菌属目前已知的双歧秆菌有24种,而应用于发酵乳制品生产的仅有5种包括:两歧双歧秆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌(B.longum)、短双歧秆菌(B.breve)、婴儿双歧秆菌(B.infantis)和青春双歧杆菌(B.adolescentis),它们都存在于人的肠道内。2001年我国卫生部公布的可用于保健食品的益生菌菌种包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
乳酸菌基础知识 1.乳酸菌及其分类 1.1 什么是乳酸菌？ 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢，革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。乳酸菌发酵原理是在酶的催化作用下将葡萄糖转化为乳酸，同时放出能量提供给其自身生命活动。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为43个属，共有373个种和亚种。 1.2 乳酸菌的分类位置 界：细菌界Bacteria； 门：厚壁菌门Firmicutes； 纲：芽孢杆菌纲Bacilli； 目：乳杆菌目Lactobacillales； 科：乳杆菌科Lactobacillaceae； 属：乳杆菌属Lactobacillus Beijerinck. 1.3 乳酸菌的分类 乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。因为动物源取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。 1.4 乳酸菌的分布 乳酸菌广泛分布于人体和动物的消化系统、呼吸系统、泌尿系统、口腔系统、皮肤系统和粪便，乳汁和乳制品，植物的果实、枝叶和根茎，腐烂的植物体，发酵动植物食品和饮料，堆肥、土壤和淤泥、污水，以及若干种临床样品等。它们是生物界中重要一员，对人类、动物、植物的生存起着不可替代的重要作用。乳酸菌在人体的食道中很少，在胃中乳酸菌数量为103个/ml左右，肠道中的乳酸菌数量为105个/g左右。 1.5 常用的乳酸菌 ①①用于乳酸发酵工业和乳酸钙生产的德氏乳杆菌（L．delbrueckii）； ②肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）是制药工业上生产右旋糖酐的重要菌种，但也是制糖工业的一种害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。 ③用于乳制品发酵加工的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌； ④用于蔬菜、水果和青贮饲料乳酸发酵的植物乳酸杆菌； ⑤用于益生菌胶囊生产的长双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌（LGG ）等。 ⑥用于乳酸菌素生产的嗜酸乳酸杆菌为主的复合乳酸菌菌种。 2.乳酸菌的发展 2.1 乳酸菌的起源 早在4～5000年前人类就已经在使用乳酸菌。在佛教教典、《圣经·创世纪》、