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t V R R ?=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术
色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。
按固定相的基质（载体）类型分类：
层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。
色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。
层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。
高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。
色层分离过程包含两部分：
●固定相：载体或载体+功能基团
●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。
液相色谱的基本原理和参数
●保留时间(t R )和保留体积(V R )
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。 理论塔板数的计算公式为：2)(σR
t N =
容量因子k ' 和平衡常数K
某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=
)
/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '
1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'
11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反
比： R
o R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='
0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。
塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。
理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。
理论塔板高度为： 式中， L ? 柱长。 m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'R
R R R R R R t t t t t t t k =-=-=
塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。
●影响柱效的因素
（1）理论塔板高度随填料粒度减少而减少；
（2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；
（3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小；
（4）分子量较小的样品分子柱高较小。
色层分离的类型
●凝胶筛分
●离子交换
●反向色谱
●疏水色谱（层析）
●亲合色谱（层析）
凝胶过滤层析（体积排阻色谱）
Gel filtration chromatography,GFC
Size exclusion chromatograpy，SEC
是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大
小进行分离的层析技术。
应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和
除盐。一般用作原料液的初分离，获取
几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。
●分离原理：
含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。
●凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；
（3）具有一定的孔径分布范围；
（4）机械强度高，允许较高的操作压力。
常用的分离介质
●天然及高分子介质
经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
⑴Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加
工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P ），由美国Bio-Rod 厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
四）聚苯乙烯凝胶
商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
凝胶过滤的特点是：
填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性材料，亲水性能好，又不与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。
功能
脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；
分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。
缺点：凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，故流速低，通常的线速度小于20cm/h 。因此，处理速度较慢。但Superdex 的最大耐受压力可达15个大气压，流速也提高近10倍。 无机填料：
表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。
优点：可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。具有较高的柱效率和分离度。
缺点：pH 的适用范围窄。以硅胶为基质的填料，pH 范围在2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit):
凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。Sephadex G50的排阻极限是30kD 。
（2）分级范围（fractionation range):
即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G-50的分级范围为1.5 ~30kD.
（3）溶胀率：
某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G 系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即
Sephadex G50 的溶胀率为500%±30%。
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。
软凝胶粒径较大，一般为50 ~ 150μm ，硬凝胶粒径较小，一般为5 ~ 50 μm 。Sepharose 和Sephadex 凝胶粒径分布为45 ~ 165 μm ，而Superdex 和TSK Toyopearl HW 系列可小到20 ~ 40 μm ，甚至6 ~ 10 μm 。
（5）床体积（bed volume ）
即1g 干燥凝胶溶胀后所占的体积。Sephadex G50的床体积为9 ~ 11cm 3/g 干胶。
（6）空隙体积（void volume)
指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V 0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。一般使用相对分子质量为2000kD 的水溶性兰色葡聚糖。影响分离特性的因素
1、填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK 系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，因此应根据分离的要求确定柱长，一般柱
%100?-=干燥重量
干燥重量）（溶胀处理平衡后重量溶胀率
长60-120厘米对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。
3、洗脱液
洗脱液的pH值和离子强度都将影响到分离效果。以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。当离子强度很低时，TSK系列凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应，一般通过加入0.3-0.5mol/L的NaCl来抑制。蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入5-10%的乙醇或异丙醇来控制。
3、流速
是影响蛋白质分离的重要因素。一般流速低分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
凝胶筛分的应用
1、分离纯化
GFC可用于相对分子量从几百到百万的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒（50-400nm）的分离与分析中频繁使用的液相层析法。
2、脱盐
盐析沉淀中得到的高盐浓度的蛋白质溶液用凝胶法脱盐后，可用于其它层析过程。
也可用于缓冲液的置换。
3、相对分子量的测定
通过分子量与分配系数的线性关系进行测量，对球形分子较准确。
4、用于包含体的复性
实验技术
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之比为20:1─100:1，层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
（二）凝胶的选择
根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度小分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好，脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。
（三）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（四）样品溶液的处理
样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
（五）防止微生物的污染
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:
叠氨钠（NaN3）：在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01- 0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠：在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
（4）苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
●GFC分离的优点：
（1）由于溶质不与介质发生作用，可采用恒定洗脱法洗脱，操作条件温和。回收率可达100%；（2）使用后，不需要进行柱子的清洗和再生，利于循环使用；
（3）作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切率小，蛋白活性回收率高；
（4）分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。
●缺点
（1）选择性低，料液处理量小；
（2）洗脱展开后产品被稀释，因此还需要具有浓缩作用的单元操作。
◎色层分离技术2
反相作用色谱
反相色谱(revelsed phase chromatography，RPC)是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。
固定相：用短链烷基(如C4，C8，苯基)和长链烷基(如C18,C22)改性的孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相。
流动相：有机溶剂主要是乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等。有机溶剂和水组成的洗脱体系可以得到高的蛋白回收率。流动相的洗脱强度是随着有机溶剂的强度增加而增加。其次序为：乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃。
实验表明:
烷基链长对蛋白质的反相保留没有显著的影响，但在蛋白质的活性回收上短链烷基(如C4, C8，苯基)和长链烷基(如C18，C22)反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分；过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附和生物活性的损失。
应用领域：蛋白质、多肽、核糖核酸、脱氧核糖核酸、信息核糖核酸等的分离和制备。
◎疏水作用层析（色谱）
一、原理
疏水作用层析（HIC)：是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。
二、疏水性吸附剂
将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。
常用的疏水性配基：
苯基、短链烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。
吸附特点：
疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在10 ~ 40μmol/ml，配基修饰密度过小则疏水性吸附不足，密度过大则洗脱困难。
三、HIC 操作
上样及洗脱的一般规律：
在高盐浓度条件下，蛋白质与固定相疏水缔合；浓度降低时，疏水作用减弱，逐步被洗脱下来。一般用pH 6-8的盐水溶液[如（NH 4）2SO 4]。盐的浓度影响蛋白质的疏水性，从而影响蛋白质的保留值。盐：Na 2SO 4，KH 2PO 4，NaHPO 4，(NH 4)2SO 4，NH 4OAc ，KOAc ，NaOAc ，NaCl
盐析作用增强 洗脱能力增强
1、影响疏水性吸附的因素
蛋白质的疏水性与其荷电性质相比复杂得多，不易定量掌握。除疏水性吸附剂的性质(疏水性配基的结构和修饰密度)外，流动相的组成以及操作温度对蛋白质疏水性吸附的强弱均产生重要影响。
(1)离子强度及种类
蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大。离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。疏水性吸附与盐析沉淀一样，在高价阴离子的存在下作用力较高。因此HIC 分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。
(2)破坏水化作用的物质
等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子之间相互
作用。这类阴离子与上述盐析作用强的高价阴离子(如
等)的作用正好相反，前者称为离液离子(c haotropic ion)，后者称为反离液离子(antichaotropic ion)。在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。
除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱促进剂，洗脱疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱的高疏水性蛋白质。
(3)表面活性剂
表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC 法进行洗脱分离。但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。
(4)温度
一般吸附为放热过程，温度越低吸附结合常数越大。但疏水性吸附与一般吸附相反，吸附结合作用随温度升高而增大。蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附，而失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程, >0
因为：
所以吸附平衡常数K 随温度的升高而增大。
2，蛋白质的分离
蛋白质与HIC 填料之间的作用很复杂，有时不能完全用疏水性相互作用来解释，有时配基苯环还会与蛋白质分子上的芳香族氨基酸产生π-π键。因此，在利用HIC 分离蛋白质混合物时，需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳吸附剂和洗脱剂。
3，HIC 的特点
HIC 主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化。虽然HIC 不如IEC 应用昔遍，但可作为IEC 的补充工具。如果使用方法适当，HIC 具有与IEC 相近的分离效率．归纳而言，H1C 具有如下特点：
(1) 由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此，HIC 可直接分离盐析后的蛋白质溶液；
(2) 可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力，因此此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂；
（3） 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
-SCN -4ClO -I -24SO -24HPO H ?2ln RT H dT K d ?=
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案
精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2 生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。
第六章层析分离技术 第一节吸附 一、吸附层析的原理与特点 吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。 典型的吸附过程包括四个步骤： 固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小， 因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附的类型 （1）物理吸附: 放热，可逆，单分子层或多分子层，选择性差 （2）化学吸附: 放热量大，单分子，选择性强 （3）交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子到溶液中 物理吸附与化学吸附的特点 吸附法特点 （1）不用或少用有机溶剂 （2）操作简便、安全、设备简单 （3）生产过程pH 变化小 （4）从稀溶液分离溶质 （5）吸附剂对溶质的作用小 （6）吸附平衡为非线性 （7）选择性较差 吸附法的应用 气体过滤 水处理
脱色、除臭 目标产物的分离 二、吸附剂（固定相）的选择 吸附剂通常应具备以下特征： ?表面积大、颗粒均匀、 ?对被分离的物质具有较强的吸附能力 ?有较高的吸附选择性 ?机械强度高 ?再生容易、性能稳定 ?价格低廉。 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等属前者，活性炭属后者 人工合成的如大网格吸附剂、分子筛等两种都有。但大多属非极性的常用的吸附剂 1大网格聚合物吸附剂： 2活性碳：助滤，脱色，去热原 使用:偏酸性(pH 5-7),加热(50-60℃)搅拌30min 活性白土：脱组胺类过敏物，脱色。 硅藻土：助滤，澄清 1.大网格聚合物吸附 树脂的网络骨架 大网格树脂吸附法 Ⅰ. 基本概念 一．什么是大网格树脂吸附法？ 将多孔的大网格吸附树脂作为吸附剂，利用表面分子与物 质分子间范德华引力，把液相中物质吸附到吸附树脂表面。 ◆大网格树脂吸附法与离子交换法的比较： 相同：①操作方法：静态法、动态法； ②骨架结构：树脂均有溶胀孔隙和永久孔隙的大 网格骨架结构。 区别 介质不同： 离交法－离交树脂，骨架上接有离子交换基团，利用表面层 和孔隙中离子基团起作用； 吸附法－吸附树脂，无离交基团（称白球），利用外表面和
实验十一色素的分离(层析法) 一、目的要求 1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。 2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。 二、实验原理 层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。按操作方式的不同，又可分为柱型、薄层和纸型。在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层析柱中向下移动的距离不同而得以分离。 用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。 三、实验器材 抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20㎝×1㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞试管。 40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉 四、实验试剂 1.石油醚 2.甲醇 3.苯 4.无水硫酸钠 5.细粉状蔗糖 6.无水碳酸钙 7.氧化铝 8.海砂 五、操作步骤 1．取烘干的菠菜叶1 g置于研钵中，加少许海砂研碎。浸入含有22.5 mL 的石油醚、2.5 mL苯和7.5 mL甲醇的混合溶剂中，放置约1 h。 2．将上述溶液置于分液漏斗中，加5 mL水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。将剩余的液体通过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在通风橱中小心浓缩)。提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。 3．取层析柱1支（也可用25 mL酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉，将约2 g细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要与柱壁紧密相接，不得留有空隙。装到3 cm高为止。用同样的方法装入约2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为5 cm，然后再用同样的方法将约3.5 g的细蔗糖粉末装入柱内，高度为7 cm。最后在蔗糖上面再放一块脱脂棉，将准备好的吸附柱装在抽滤瓶上(见图实-3)。
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二：关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm ×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
生物分离与纯化技术模拟试卷九答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心分离技术：是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。 2．物理萃取：即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 3．有机聚合物沉析：利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 4．平衡离子：离子交换树脂中与功能基团以离子键联结的可移动的平衡离子，亦称活性离子。 5．离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．葡聚糖凝胶可使用那种溶剂溶胀（C ） A.甲醇 B 乙醇 C.缓冲液 D.乙酸乙酯 2．不能用于固液分离的手段为（C ） A.离心 B 过滤 C.超滤 D.双水相萃取 3．最常用的干燥方法有（ D ） A 、常压干燥 B 、 减压干燥 C 、喷雾干燥 D 、以上都是 4．物理萃取即溶质根据（ B ）的原理进行分离的 A.吸附 B.相似相溶 C 分子筛 D 亲和 5．适合小量细胞破碎的方法是（ B ） A.高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 6．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。 A 装柱分干法和湿法两种 B 分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和 C 用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平 D 分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。 7．颗粒与流体的密度差越小，颗粒的沉降速度（ A ） A.越小 B.越大 C.不变 D.无法确定 8．“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ） A ．极性溶剂 B ．非极性溶剂 C ．水 D ．溶剂 9．关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是： （ A ） A 、最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。 B 、对弱酸性物质可用碱来解吸。 C 、对弱碱性物质可用酸来解吸。 D 、如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。 10．亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ D ） A 、 阴性洗脱 B 、剧烈洗脱 C 、正洗脱 D 、负洗脱 11．下列哪一项不是常用的滤布材料 （ C ） A. 法兰绒 B. 帆布C. 滤纸 D.斜纹布 12．阴树脂易受有机物污染，污染后，可用（ B ）处理 A 柠檬酸 B 10%NaCl+2%～5%NaOH 混合溶液 C 氨基三乙酸 D EDTA 13．HPLC 是哪种色谱的简称（ C ）。 A ．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 14．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A ．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 15．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ） A 、分离量大分辨率低的方法 B 、分离量小分辨率低的方法 C 、分离量小分辨率高的方法 D 、各种方法都试验一下，根据试验结果确定 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞内产物释放到水相中去。（√ ） 2．向含有生化物质的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能使生化物质沉淀析出。（√ ） 3．等电点沉淀在实际操作中应避免溶液pH 上升至5以上。（√ ） 4．在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS ），影响凝胶的形成。（× ） 5．当气体的温度超过其临界温度，压力超过临界压力之后，物质的聚集状态就介于气态和液态之间，成为超临界流体。（√ ） 6．冻结-融化法冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性来破坏细胞的。（√ ） 7．盐析作用也能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（√ ） 8．氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等两性物质可用等电点沉析。（√ ） 9．甲醇沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇、丙酮都小，所以应用广泛。（×） 10．若两性物质结合了较多阳离子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+等），则等电点pH 升高。（√ ）
F t V R R ?=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术 色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。 按固定相的基质（载体）类型分类： 层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。 色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。 用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。 层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。 高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。 色层分离过程包含两部分： ●固定相：载体或载体+功能基团 ●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。 液相色谱的基本原理和参数 ●保留时间(t R )和保留体积(V R ) 从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。 理论塔板数的计算公式为：2)(σR t N = 容量因子k ' 和平衡常数K 某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量= ) /)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有 溶质在固定相停留的时间分数= ' 1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)' 11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反 比： R o R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+=' 0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。 塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。 理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。 理论塔板高度为： 式中， L ? 柱长。 m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-=
第三章层析分离法 1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。 2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。 3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱 色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。 色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。 图3-1 Tsweet的色谱工作图 尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。并发表了“植物界的色素”专论。到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。 1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。 1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。
1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。 1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。 1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。 1952年Martin和Games开创了气一液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。 到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善，操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。 色谱法有许多分支，但在色谱分析过程中总是由一种流动相(例如Tsweet工作的石油醚)，带着被分离物质(如叶绿素)流经固定相(如CaCO3)，从而使分离物中各组分分离。它有许多分类方法。 按流动相和固定相性质不同分类 流动相固定相色谱分析法种类 固体气固色谱法 气体气相色谱(气相层析) 液体气液色谱法 固体液固色谱法 液体液相色谱(液相层析) 液体液液色谱法 按操作形式分类 ①柱色谱：柱色谱顾名思义就是将固定相(如硅胶、氧化铝、氧化铝、碳酸钙、淀粉、纤维素)，离子交换(树脂等)装人一根被称为色谱柱的玻璃瓶中，这种色谱柱通常又称为“层析柱”或“分离柱”。
（生物科技行业）生物分离与纯化技术复习重点
生化分离技术复习重点 1.生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。 来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物 特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高 基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作 2.吸附技术 概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术 吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换） 常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。 活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸
附力大于相对分子质量小的化合物。 影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。 3.膜分离技术 概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。 类型：渗析；电渗析；微滤；超滤；反渗透；纳滤；气体分离 微孔滤膜清洗和再生方法：将滤膜平放于清洁盛器内，用60℃左右的蒸馏水浸泡，使全部湿润，数小时候（约4小时以）倾去水，再用上法浸泡12小时，使用前再用适量温蒸馏水清洗一次。 微孔滤过膜截留粒子的范围：0.1—10μm的粒子。 4.液膜分离技术 概念：是一种以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的分离操作，是属于液—液系统的传质分离过程。 组成：膜溶剂；表面活性剂；流动载体；膜增强剂。 分类：乳状液膜；支撑液膜。 液膜分离步骤：制备液膜；液膜萃取；澄清分离；破乳。 影响因素：液膜乳液成分的影响；乳水比；连续的PH；搅拌速度的影响；料液的浓度和酸度的影响；操作温度的影响；接触时间。应用：分离氨基酸；提取抗生素；提取生物碱；提取蛋白质；分离
层析技术的应用
层析技术的应用 一、层析技术的原理和分类 （一）层析技术的原理 层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。 层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 （二）层析法分类见表16-5～7 （三）层析法的特点与应用 表16-5按两相所处状态分类 流动相 液体气体 液体液-液层析法气-液层析法 固定相 固体液-固层析法气-固层析法 层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层
析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。 表16-6按层析原理分类 名称分离原理 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力吸附层析法 不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不分配层析法 同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不离子交换层析法 同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶层析法 凝胶上受阻滞的程度不同 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲亲和层析法 和力的其它组份分离 表16-7按操作形式不同分类 名称操作形式 柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流薄层层析法 动相展开，使各组份分离 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组纸层析法 份分离 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析薄膜层析法 方法进行物质的分离
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。 2、液体环境：为了保持被分离物质运动的均一性，以及好的吸附和解析效果，因此要保持孔隙内部和外部液体环境的一致，所以进行液体环境的平衡。
填空 1、色谱分离的基本特点：分离效率高、应用范围广、选择性强、设备简单，操作方便。 2、高效液相色谱的特点：高压、高速、高灵敏度、高效、适用范围广。 3、膜分离技术的优点：a易于操作。b成本低，寿命长。c高效，特别是对于热敏性的物质的处理具有其他分离过程无法比拟的优越性。d 常温下操作无相态变化，分离精度高，没有二次污染。P168 4、七种常见的膜分离过程：渗析（DS），电渗析(ED)，微滤（MF），超滤（OF），反渗透（RO），纳滤（NF），气体分离（GS）。 5、微滤的分离机理：a 表面层截留。b 膜内部截留。 6、液膜的组成：膜溶剂（水和有机溶剂），表面活性剂，流动载体和膜增强剂。 7、液膜的分类：液膜按其构型和操作方式的不同可以分为乳状液膜和支撑液膜。 8、乳状液膜分类：根据是否含有载体可以分为流动载体液膜和非流动载体液膜。 9、液膜分离的操作过程：a 制备液膜。b 液膜萃取。c 澄清分离。d 破乳。 10、预处理的目的：1）改变发酵液的物理性质2）取出发酵液中的部分杂质以利于后续各步操作。 11、杂志的去除方法：1）等电沉淀法：蛋白质等电时溶解度最小，能沉淀出去2)变性沉淀：使蛋白质从有规则的排列变成溶解度较小的无规则的排列而沉淀3吸附：利用吸附作用能经常有效的去除蛋白质杂质。 12、双水相萃取的工艺流程：主要三部分1）目的产物的萃取2）PEG的循环3）无机盐的循环。 13、过饱和溶液的制备一般有四种方法：饱和溶液冷却、部分溶剂蒸发、化学反应结晶法、解析法。P72 14、吸附的类型：物理吸附、化学吸附、交换吸附。P83 名词解释 1、离子交换树脂的命名：有三位阿拉伯数字组成，第一位数字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字微顺序号。 2、交联度：离子交换树脂中交联剂的含量。 3、交换容量：每克干燥剂的离子交换树脂或每毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。 4、色谱分离：一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在流动相和固定相中。 5、正相色谱法：流动相极性小于固定相的分配色谱法。 6、反相色谱法：流动相极性大于固定相的分配色谱法。 7、浓缩：是低浓度溶液通过除去溶剂（包括水）变为高浓度溶液的过程。 8、干燥：是从湿的固体生化药物中除去水分或溶剂而获得相对或绝对干燥制品的工艺过程。9、差速离心法：采用逐渐增加离心速度或交替使用低速和高速进行离心，用不同强的的离心力是不同质量的目的产物分级分离的方法。 10、速率带离心法：在离心前于离心管内装入密度梯度介质，待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度液的中间，同梯度液一起离心。 11、超临界流体：:处于临界温度和临街压力以上的非凝缩性的高密度流体。处于超临界状态时，气液两相非常接近，无法分别，成为超临界流体。 12、盐析：在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质（或酶）等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的现象叫做盐析。 13、活性炭“中毒”：由于活性炭是一种强吸附剂，对气体的吸附能力很大，气体分子占据了活性炭的吸附表面，会造成活性炭中毒，使其活力降低，因此使用前可加热烘干，以除去大部分气体。P84 14、大网格聚合物吸附剂：又称大孔吸附树脂，是一种有机高聚物，具有与大网格离子交换树脂相同的大网格骨架（由于在聚合时加入了一些不能参加反应的致孔剂，聚合结束后又将其除去，因而留下永久性孔隙，形成大网格结构），一般为白色球形颗粒。 简答 1、离子交换树脂的构成是什么？ 答：1）惰性、不溶的具有三维空间立体结构的网络骨架，称为载体或骨架； 2）与载体连成一体的、不能移动的活性基团，又称功能基团； 3）与功能基团带相反电荷的可移动的活性离子，又称平衡离子或可交换离子。 2、离子交换树脂的分类是什么？ 答：1）按树脂骨架的主要成分分： 1’聚苯乙烯性树脂2’聚苯烯酸型树脂3’多乙烯多胺-环氧氯苯烷树脂4’酚-醛树脂 2）按骨架的物理结构来分：1’凝胶型树脂2’大网格树脂3’均孔树脂 3、微滤的操作模式是什么？ 答：1’常规过滤（静态过滤或死端过滤）：原料液置于膜的上游，在压差的推动下，溶剂和小于膜孔的颗粒透过膜，大于膜孔的颗粒则被膜截留，该压差可通过上游加压或下游侧抽真空产生。但是，常规过滤操作只能是间歇的，必须周期性的停下来清除膜表面的污染层或更换膜。常规过滤操作简便易行，对于固体含量低于0.1%的料液常采用常规过滤；对于固体含量在0.1%~0.5%的料液则需要进行预处理或采用错流过滤；对于固体含量高于0.5%的料液则采用错流过滤操作。 2’错流过滤（动态过滤）：微滤的错流过滤操作类似于超滤和反渗透，原料液以切线方向流过膜表面。溶剂和小于膜孔的颗粒，在压力的作用下透过膜，大于膜孔的颗粒则被膜截留而停留在膜表面形成一层污染层。与常规过滤不同的是，料液流经膜表面产生的高剪切力可使沉积在膜表面的颗粒扩散返回主体流，从而被带出微滤组件，使污染层不能无限增厚。当处理量大时，为避免膜被堵塞，宜采用错流操作。P176
第四节层析分离技术 层析法又称色谱法，色层法或层离法(chromatography)，是广泛应用的一种生物化学技术。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相的称为气相层析。 按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型： 吸咐层析：利用吸咐剂表面对不同物质吸咐性能的差异进行分离。 分配层析：利用不同物质在流动相和固定相之间的分配系数或溶解度不同，使物质分离。 离子交换层析：利用不同物质对离子交换剂亲和力不同而分离。 凝胶层析：利用某些凝胶对不同分子量的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。 亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。 层析法采用的方式主要是柱层析和薄层层折，前者将固定相或载体装入柱内，使被分离的物质沿一个方向移动而达到分离，后者将吸附剂涂布成薄层，使样品在薄层上进行分离。 一、吸附层析 氧化铝，硅胶等物质具有吸咐其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被吸附物质的性质有关。 (一)柱层析法 柱层析是用一根玻璃管。管内加吸附剂粉末，用溶剂湿润后，即成为吸咐柱，然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸咐在柱上端，形成色圈，样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。 在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如被吸附的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸附，随后，新溶剂又使A溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同。A 与B移动的距离也不同，连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液。各成分即可顺序洗出。
生物分离与纯化技术模拟试卷五答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心沉降：利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离 2．固相析出技术：利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 3．乳化液膜系统：乳化液膜系统由膜相、外相和内相三相组成，膜相由烷烃物质组成，最常见的外相是水相，内相一般是微水滴。 4．反相色谱：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 5．等电点：是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH 值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．在蛋白质初步提取的过程中，不能使用的方法（C ）。 A 、双水相萃取 B 、超临界流体萃取 C 、有机溶剂萃取 D 、反胶团萃取 2．离子交换法是应用离子交换剂作为吸附剂，通过（A ）将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上。 A 、静电作用 B 、疏水作用 C 、氢键作用 D 、范德华力 3．丝状（团状）真菌适合采用（A ）破碎。 A 、珠磨法 B 、高压匀浆法 C 、A 与B 联合 D 、A 与B 均不行 4．真空转鼓过滤机工作一个循环经过（A ）。 A 、过滤区、缓冲区、再生区、卸渣区 B 、缓冲区、过滤区、再生区、卸渣区 C 、过滤区、缓冲区、卸渣区、再生区 D 、过滤区、再生区、缓冲区、卸渣区 5．阴离子交换剂（C ）。 A 、可交换的为阴、阳离子 B 、可交换的为蛋白质 C 、可交换的为阴离子 D 、可交换的为阳离子 6．凝胶色谱分离的依据是（B ）。 A 、固定相对各物质的吸附力不同 B 、各物质分子大小不同 C 、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D 、各物质与专一分子的亲和力不同 7．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（A ）。 A 、Fe3+>Ca2+>Na+ B 、Na+ >Ca2+> Fe3+ C 、硫酸根>柠檬酸根>硝酸根 D 、硝酸根>硫酸根>柠檬酸根 8．乳化液膜的制备中强烈搅拌（B ）。 A 、是为了让浓缩分离充分 B 、应用在被萃取相与W/O 的混合中 C 、使内水相的尺寸变小 D 、应用在膜相与反萃取相的乳化中 9．盐析法纯化酶类是根据（ B ）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 10．以下哪项不是颗粒在离心力场中受到的力（ C ） A.离心力 B. 向心力 C.重力 D. 阻力 11．关于精馏回流比控制，对于一定的分离任务，以下正确的两项是（A ） A 、若回流比变大，则精馏能耗增大； B 、若回流比变大，则精馏能耗减小； C 、若回流比变大，则所需理论塔板数变大； D 、若回流比变小，则所需理论塔板数变小。 12．其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离 B 过滤 C. 沉降 D.超滤 13．蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（A ）范围内适合。 A. 0.5％～2％ B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 14．超滤技术常被用作（C ） A. 小分子物质的脱盐和浓缩 B 小分子物质的分级分离 C. 小分子物质的纯化 D.固液分离 15．通过改变pH 值从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来，可使用（A ） A. 阳离子交换剂一般是pH 值从低到高洗脱 B 阳离子交换剂一般是pH 值从高到低洗脱 C. 阴离子交换剂一般是pH 值从低到高 D. 以上都不对 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．溶剂萃取中的乳化现象一定存在。（×） 2．用冷溶剂溶出固体材料中的物质的方法又称浸煮。（× ） 3．在生物制剂制备中，常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液；碳酸盐缓冲液；盐酸盐缓冲液；醋酸盐缓冲液等。（× ） 4．蛋白质变性，一级、二级、三级结构都被破坏。（× ） 5．不同高分子化合物的溶液相互混合可形成两相或多相系统，如葡聚糖与聚乙二醇（PEG ）按一定比例与水混合后，溶液先呈浑浊状态，待静置平衡后，逐渐分成互不相溶的两相，上相富含PEG ，下相富含葡聚糖。（√ ） 6．离子交换剂可以分为3部分：高分子聚合物基质、电荷基团和被交换离子。（× ） 7．由于pH 值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱（√ ） 8．盐析一般可在室温下进行，当处理对温度敏感的蛋白质或酶时，盐析操作要在低温下（如0℃～4℃）进行。 （√ ） 9．采用凝胶过滤分离蛋白质主要取决于蛋白质分子的大小，先将蛋白质混合物上柱然后进行洗脱，小分子的蛋白质由于所受排阻力较小首先被洗脱出来。( × ) 10．树脂使用后不可再回收。（×）