实验一光学显微镜的使用与微生物观察
第一节普通光学显微镜的使用
一、实验目的
1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。
2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。
3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。
二、基本原理
（一）普通光学显微镜的构造
普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。
1、机械系统
机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。
（1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。
（2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。
（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。
（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。
（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。
（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。
图1-1 普通光学显微镜的构造
1. 镜座
2. 镜臂
3. 镜筒
4. 转换器
5. 载物台
6. 压片夹
7. 标本移动
器 8. 粗调螺旋 9. 细调螺旋10. 目镜11. 物镜12. 虹彩光阑（光圈） 13. 聚光器 14. 反光镜
2、光学系统
光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。
（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的范围之内，在光阑上粘一小段细发可用作指针，指示视野中标本的位置。在进行显微测量时，目镜测微尺被安装在视野光阑上。目镜上刻有5×、10×、15×、20×等放大倍数。可按需选用。
（2）物镜：它的功能是把标本放大，产生物像。物镜可分为低倍镜（4或10×）、中倍镜（20×）、高倍镜（40～60×）和油镜（100×）。一般油镜上刻有“OI”（oil immersion）或HI（homogeneous immersion）字样，有时刻有一圈红线或黑线，以示区别。物镜上通常标有放大倍数、数值孔径（numerical aperture，简写为NA）、工作距离（物镜下端至盖玻片间的距离，mm）及盖玻片厚度等参数（图1-2）。以油镜为例，100/1.25分别表示放大倍数为100倍，NA为1.25；160/0.17分别表示镜筒长度160mm，盖玻片厚度等于或小于0.17mm。
图1-2 XSP-I6型显微镜物镜的主要参数
（3）聚光器：聚光器又称聚光镜，它的功能是把平行的光线聚焦于标本上，增强照明度。聚光器安装在镜台下，可上下移动。使用低倍物镜（简称低倍镜）时应降低聚光器，使用油镜时则应升高聚光器。聚光器上附有虹彩光阑（俗称光圈），通过调整光阑孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱（物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系见图1-3）。在观察透明标本时，光圈宜调得相对小一些，这样虽会降低分辨力，但可增强反差，便于看清标本。
图1-3 物镜焦距、工作距离与光圈孔径之间的关系
（4）反光镜：它是普通光学显微镜的取光设备，其功能是采集光线，并将光线射向聚光器。反光镜安装在聚光器下方的镜座上，可以在水平与垂直两个方向上任意旋转。反光镜的一面是凹面镜，另一面是平面镜。一般情况下选用平面镜，光量不足时可换用凹面镜。
（二）普通光学显微镜的性能
1、数值孔径
数值孔径（NA ）又称开口率，是指介质折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可用式1-1表示。
2sin α
n NA = （1-1）
式中，n 为物镜与标本之间介质的折射率，为镜口角（通过标本的光线延伸到物镜边缘所形成的夹角（图1-4）。
物镜的性能与物镜的数值孔径密切相关，数值孔径越大，物镜的性能越好。因为镜口角总是小于180?，所以sin 2α的最大值不可能超过1。又因为空气的折射率为1，所以以空气为介质的数值孔径不可能大于1，一般为0.05～0.95。根据式1-1，要提高数值孔径，一个有效途径就是提高物镜与标本之间介质的折射率（图1-5）。使用香柏油（折射率为1.515）浸没物镜（即油镜）理论上可将数值孔径提高至1.5左右；实际数值孔径值也可达1.2～1.4。
图1-4 物镜的镜口角 图1-5 介质折射率对光线通路的影响
2、分辨率
分辨率是指分辨物像细微结构的能力。分辨率常用可分辨出的物像两点间的最小距离（D ）来表征（式1-2）。D 值愈小，分辨率愈高。 22nsin α
λ
=D 式中，λ为光波波长。
（1-2）
比较式1-1和式1-2可知，D 可表示为：
A 2N D λ= （1-3）
根据式1-3，在物镜数值孔径不变的条件下，D 值的大小与光波波长成正比。要提高物镜的分辨率，可通过两条途径：① 采用短波光源。普通光学显微镜所用的照明光源为可见光，其波长范围为400～700nm 。缩短照明光源的波长可以降低D 值，提高物镜分辨率。②加大物镜数值孔径。提高镜口角或提高介质折射率n ，都能提高物镜分辨率。若用可见光作为光源（平均波长为550 nm ），并用数值孔径为1.25的油镜来观察标本，能分辨出的两点距离约为0.22μm 。
3、放大率
普通光学显微镜利用物镜和目镜两组透镜来放大成像，故又被称为复式显微镜。采用普通光学显微镜观察标本时，标本先被物镜第一次放大，再被目镜第二次放大（图1-6）。所谓放大率是指放大物像与原物体的大小之比。因此，显微镜的放大率（V ）是物镜放大倍数（V 1）和目镜放大倍数（V 2）的乘积，即：
V =V 1×V 2 （1-4）
如果物镜放大40倍，目镜放大10倍，则显微镜的放大率是400倍。常见物镜（油镜）的最高放大倍数为100倍，目镜的最高放大倍数为15倍，因此一般显微镜的最高放大率是1500倍。
图1-6 普通光学显微镜的成像原理
4、焦深
一般将焦点所处的像面称为焦平面。在显微镜下观察标本时，焦平面上的物像比较清晰，但除了能看见焦平面上的物像外，还能看见焦平面上面和下面的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深与数值孔径和放大率成反比，数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此，在使用油镜时需要细心调节，否则物像极易从视野中滑过而不能找到。
三、实验器材
1、 仪器 显微镜；
2、材料？标本片，香柏油，二甲苯，擦镜纸。
四、实验程序
（一）显微镜（油镜）操作
1、领取并检查显微镜：按学号向实验指导老师领取显微镜，所有实验课均对号使用。从显微镜箱中取出显微镜时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，直立平移（图1-7），轻轻放置在实验台上（图1-8），检查各部件是否齐全，镜头是否清洁，有问题及时报告老师。
图1-7 显微镜的搬动图1-8 显微镜的放置
光源：良好的照明是保证显微镜使用效果的重要条件。将低倍镜旋转到工作位置，用粗调螺旋提升镜筒，使镜头距离载物台10mm左右，降低聚光镜的位置，完全打开虹彩光阑，一边看目镜，一边调节反光镜镜面的角度（在正常情况下，一般用平面反光镜；若自然光线较弱，则可用凹面反光镜）。然后，调节聚光器的位置（酌予升降），直至视野内得到均匀适宜的亮度。
3、低倍镜观察：使用低倍镜观察，视野较广，焦深较大，便于搜寻目标，因此宜从低倍镜开始观察。将载玻片标本（涂面朝上）置于载物台中央（图1-9），用压片夹固定（图1-10），并将标本部位移到正中，转动粗调螺旋（图1-11），使镜头与标本的距离降到10mm左右。然后，一边看目镜内的视野，一边调节粗调螺旋缓慢升高镜头，至视野内出现物像时，改用细调螺旋（图1-12），继续调节焦距和照明，以获得清晰的物像，并将所需部位移到视野中央，再换中、高倍镜观察（图1-13）。
图1-9 将载玻片标本置于载物台中央图1-10 用压片夹固定载玻片标本
图1-11 转动粗调螺旋图1-12 转动细调螺旋图1-13 转换物镜
4、中、高倍镜观察：依次用中、高倍镜观察低倍镜下锁定的部位，并随着物镜放大倍数的增加，逐步提升聚光器增强光线亮度。找出所需目标，将其移至视野中央。
5、油镜观察：将聚光器提升至最高点，转动转换器，移开高倍镜，使高倍镜和油镜成“八”字形，在标本中央滴一小滴香柏油，把油镜镜头浸入香柏油中，微微转动细调螺旋，直至看清物像。如果油镜上升至离开油面还未看清物像，则需重新调节。可从侧面注视，小心地转动粗调节器将油镜重新浸在香柏油中，但不能让油镜压在标本上，更不能用力过猛，击碎玻片，损坏镜头。
6、调换标本：观察新标本片时，必须重新从第3步开始操作。
7、用后复原：观察完毕，转动粗调螺旋提升镜筒，取下载玻片，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸取少许二甲苯（香柏油可溶于二甲苯）擦去镜头上的残留油迹，再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用细软的绸布擦去机械部件上的灰尘和冷凝水。降低镜筒，将物镜转成“八”字形置于载物台上。降低聚光器，避免聚光器与物镜相碰。使反光镜垂直于镜座，以防受损。将显微镜放回显微镜箱中锁好，并放入指定的显微镜柜内。
第二节微生物形态观察
一、仪器和材料
1、显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯。
2、示范片：大肠杆菌（杆状）、小球菌（球状）、硫酸盐还原菌（弧形）、枯草
芽孢杆菌、放线菌、颤藻、鱼腥藻或念珠藻等。
二、试验内容和操作方法
1、严格按照光学显微镜操作方法，依低倍、高倍和油镜的次序观察杆状、球状、
弧状和丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细菌的形态图。
2、同法逐个观察放线菌的示范片，分别绘出其形态图。
3、同法逐个观察颤藻、鱼腥藻或念珠藻的示范片，分别绘出其形态图。
问题与思考
1、使用显微镜的油镜时，为什么必须使用镜头油？
2、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不直接用高倍镜或油镜观察？
实验二培养基的配制
一、实验目的
1. 学习制备培养基的基本技术。
2. 制备牛肉膏蛋白琼脂培养基。
二、实验基本原理
培养基是将微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的各种营养基质。培养基为微生物的生长提供营养物质和生存空间。它具有微生物正常生活所需的各种养料和适宜的环境条件；（1）适当组分和比例的营养物质；（2）适宜的pH值；（3）合适的渗透压；（4）保持无菌状态。所以培养基是培养微生物所必需的最主要材料。培养基的配制是微生物学工作者的主要技术操作之一。
培养基的种类：
根据培养基的组成成分，可将培养基分为三类：
合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
半合成培养基：由一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。
天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成的。
从培养基的物理状态来分：
液体培养基：不加凝固剂的液态状培养基。
固体培养基：在液体培养基中加入2％左右的凝固剂的固体状培养基或固体状农副产品培养基。
半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％-0.5％凝固剂而成的半固体状培养基。
微生物最常用的凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。它不是一种营养物质，只能被极少数种类的细菌分解利用。琼脂是从海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一种多糖类化合物，主要成分是复杂的多糖硫酸酯钙盐，琼脂是一种可逆性胶体，在常规浓度下加热到96C以上即成溶胶状态，融化的琼脂，当温度下降到42℃以下，又凝固为固体。
牛肉膏蛋白培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供作繁殖之用，制作固体培养基时须加2%琼脂，培养细菌时，应用稀酸或稀碱将PH调至中性或微碱性。牛肉膏蛋白培养基的配方：
牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。
三、材料与仪器
1. 试剂牛肉膏，蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。
2. 其它：试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，漏斗，乳胶管，弹簧夹，纱布，棉花，牛皮纸，线绳，pH试纸，电炉，台秤。
四、实验步骤
1.称量根据用量按比例依次称取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。
2. 溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。
3. 调PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH调至所需范围。
4. 过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。
5. 分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三解瓶内分装时注意，勿使培养基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。
1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。
2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2（图1）。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。
3）半固体分装装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
图1 灭菌的试管培养基趁热摆成斜面
6. 加棉塞分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。
7. 包扎棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。
8. 保存灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。
问题与思考：
1．培养基配制时应注意什么问题？为什么？
2．分装培养基时为什么要使用弹簧夹？
3．培养基配好后，为什么要立即灭菌？
实验三消毒和灭菌
一、实验目的
了解干热灭菌及高压蒸汽灭菌的操作方法。
二、实验原理
灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。
灭菌的方法，通常可以分为四大类：（1）加热灭菌：包括直接灼烧灭菌、干热灭菌、加压蒸汽灭菌、间歇灭菌和煮沸消毒；（2）过滤去菌；（3）射线灭菌和消毒；（4）化学药剂灭菌和消毒。
在本实验中，介绍与培养基和玻璃器材灭菌有关的部份灭菌方法。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白凝固变性而达到灭菌的目的，细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放入一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾产生蒸汽，水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
一般培养基用0.1MPa、121.1℃.
15～30min可达到彻底灭菌,灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变.
三、材料与仪器
吸管、培养皿、试管、电热干燥箱，手提试高压蒸汽灭锅，牛肉膏蛋白胨培养基、蒸馏水。
四、实验步骤
（一）干热灭菌法适用于空的、干燥的玻璃器皿的灭菌。培养基不适用。
1．将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱（注意留有一定的间隙），关好箱门。
2．接通电源，打开排气孔，使箱内湿空气能逸出，旋动恒温调节器，保持加热升温状态，至箱内达到100℃时关闭排气孔。
3．当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。
4．切断电源，冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品（未降至70度以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂）。
（二）高压蒸汽灭菌
1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。
2．放回内层锅，并装入待灭菌物品（内装培养基或小的三角瓶），不要装得太挤，以免妨碍汽流通影响灭菌效果，三角瓶口不要与桶壁接触，以免冷凝水
淋温包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个棉栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3．用电炉或其他方法加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气排尽后，关上排气阀让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内达到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
4．停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
注意：当压力不为零时，不能开盖取物否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼伤操作者。
5．高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。问题与思考
1．干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2．为什么干热灭菌所需温度要比湿热灭菌高？
3．高压蒸汽灭菌时，为什么要排尽锅内的空气？
实验四、微生物接种技术
一、实验目的
1. 掌握微生物各种接种方法。
2. 掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理
在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须把它们分离出来。将一种微生物移到另一种灭菌的培养基上称为接种。在接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过火焰灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料与仪器
（一）菌种
大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌
（二）缓冲葡萄糖肉汤培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤半固体培养基试管垂直；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基试管斜面；缓冲葡萄糖肉汤固体培养基平板；察氏培养基试管斜面；察氏培养基平板。
（三）接种环、接种针、接种钩。镊子、酒精灯、火柴、酒精棉、试管架、浆糊、标签纸、恒温培养箱等。
四、实验步骤
1．接种前的准备工作
（1）检查接种工具。
（2）在欲接种的培养基试管或平板上贴好标签，标上接咱的菌名、操作者、接种日期等。
（3）将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。
2．接种方法
（1）试管接种方法
①将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出棉塞并挟出。
②置试管口于酒精火焰附近；
③将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后再放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。
④用接种工具取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
⑤取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
⑥重新塞上棉塞。
⑦烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种工具放回原处。
（2）试管菌种接到平板培养基的方法
①左手持平板和试管菌种，右手松动试管试管棉塞，烧接种工具。
②右手小指与四指取下棉塞，取菌，打开平皿。
③将菌种接种到平皿上，立即盖上平皿。
④酒精灯火焰上烧接种工具灭菌
⑤棉塞过火，重新塞上试管。
3. 培养
1）将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后观察。
2）将接种分离后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒温箱内，酵母菌培养48h，霉菌培养72h后观察。
3）平板培养基置于恒温箱内倒置培养。
问题与思考
1．为什么从事微生物实验工作的最基本要求是无菌操作？
2．大肠杆菌接种于葡萄糖肉汤培养基内培养24小时后，会出现什么情况？
实验五、细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。
Ⅰ、细菌简单染色法
一、实验原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。例如，美蓝(亚甲蓝)实际上是氯化亚甲蓝盐(methylene blue chloride，缩写为M B C)；它可被电离成正、负离子：
M B C→methylene blue++chloride-
带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫(crystal violet)、碱性复红(basic fuchsin)、番红(又称沙黄，safranine)等。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
二、实验器材
1、菌种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus
cereus)；
2、仪器显微镜；
3、材料接种环，酒精灯，火柴，载玻片，洗瓶，废液缸，擦镜纸，吸水
纸；
4、染料草酸铵结晶紫或石碳酸复红。
三、操作步骤
1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2、干燥将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。
3、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)。待玻片冷却后，再加染料；
4、染色玻片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)于菌膜部位，染l-2min。
5、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。
7、镜检用油镜观察并绘出细菌形态图。
8、清理实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。
四、注意事项
1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。
Ⅱ、革兰氏染色法
一、实验原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成
红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
二、实验器材
1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜
面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus
subtilis)斜面菌种；
2、仪器显微镜；
3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红
染色液；
三、操作步骤
1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大
肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。
2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过
热，以载玻片不烫手为宜。
3、染色
⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜
为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。
⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。
⑶脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。
⑷复染滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。
4、镜检干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G+)；
被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。
四、注意事项
1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。
2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
问题与思考
（1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
（2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验六、藻类的培养、观察、计数
一、实验目的：
1、通过实验了解藻类生长的基本条件和方法，掌握淡水微藻的基本培养方法；
2、显微镜下观察并识别几种常见淡水微藻；
3、了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。
二、实验材料：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻；
三、主要实验仪器和器皿
１．显微镜，血球计数板，计数器２．培养瓶（三角瓶），量筒；
四、试剂
１．培养液：BG11 培养液２．碘固定液
五、培养条件：
光照强度：1200Lux、温度：20-25℃、光照时间：24h连续光照
六、方法和步骤
1、前期准备：各种器皿的消毒、培养液的配制、准备并培养3 种不同的淡水微藻：斜生栅藻、小球藻、铜绿微囊藻；
2、接种：将不同的实验藻种分别接种到盛有培养液的不同三角瓶(100ml)中,接种的藻容量和新培养液之间的比例为1：2～1：3。培养量与总容量的比小于2/3；
3、培养：按上述培养条件进行培养，在培养的过程中，每天摇瓶3 次，使藻类充分见接触氧气和光照；
4、换代：5-7 天换代1 次，换代浓度同上；
5、固定：将藻液摇匀，用小三角瓶分别倒取一定量(20-30ml)的上述3种藻液加入几滴碘液，摇匀杀死细胞；
6、取样：摇匀后，用吸管吸取上述不同的藻液分别滴到盖有盖玻片的血球计数板的边缘，使藻液慢慢进入盖有盖玻片的区域，避免盖玻片浮起，用吸水纸轻轻吸走多余的藻液，每种藻液取样2 次；
7、观察计数：显微镜下观察不同的藻种并分别计数。
1）血球计数板计数原理血球计数板是一块特制的载玻片，板的中部一“H”型的凹槽，横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网。每个大格：边长为１ｍｍ，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。中间大方格为计数室以计数室为中心，对角线两端各有一个有16 个中格组成的大格。
2）计算藻细胞密度数出对角线上的4 个大方格中的总藻数A，若藻液的稀释倍数为B，则计算公式如下：细胞密度＝A÷4×B×104（个／ml）（单位：个／ml）
七、实验结果
按下表记录实验数据。
八、问题与思考
用此法计数的结果是活藻体还是死、活菌体的总和？
实验七土壤细菌、放线菌、霉菌及纤维素降解菌的分离及提纯
一、目的要求
通过平板涂布法学习土壤中一般异养性细菌、放线菌、霉菌及纤维素降解菌的分离以及纯化方法
二、基本原理
微生物分离培养的基本原理是：选用不同成分和酸碱度的培养基，在不同的湿度和不同的通气条件下进行培养，使只有适合该条件的微生物得以生长。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。由于土壤中菌数高，常需进行一定量稀释，使微生物能在培养基上长成单个菌落，以达到分离的目的。本实验将采用四种不同的培养基从土壤中分离不用的微生物
三、器材
1、培养基：牛肉蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、马丁培养基、赫奇逊培养基
2、土壤悬液、无菌玻璃棒、无菌吸管、盛有9ml无菌水的试管、无菌试管
四、操作步骤
1、选定采土地点后，铲去表涂层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g。称取土样1g，
加入盛有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使土壤中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10－3……10－7顺序编号，放置在试管架上。取移液管一支，准确吸取0.5ml10－2土壤稀释液，此为10－3稀释度的土壤稀释液，依次操作，制成10－4、10－5、10－6、10－7的土壤稀释液。
2、用无菌吸管分别吸取适宜浓度的土壤稀释液0.1ml，接种于相应的培养基平板上。
每一稀释度至少有两个平板重复。接种时每一稀释度用一支无菌吸管，菌液注入平板后，应立即用无菌涂棒将该菌液均匀地涂布于平板表面，注意勿刮破琼脂。
通常，细菌采用10-4、10-5、10-6三种稀释液接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37°C培养；放线菌采用10-3、10-4、10-5三种稀释液接种于高氏一号培养基。28°C培养；霉菌则采用10-2、10-3、10-4三种稀释度接种于马丁培养基，28°C培养；纤维素降解菌采用10-2、10-3、10-4三种稀释度接种于赫奇逊培养基，28°C。
3、当单菌落长出时，用接种环挑菌落接到相应的斜面培养基上，在相应的温度下培养
五、问题与思考
1、你所涂布的平板是否较好的得到了单菌落？
2、在四种不同的平板上你得到了哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征？
实验八、微生物实验常用玻璃器皿清洗
一、实验目的
二、 1.熟悉实验所需各种常用玻璃器皿的名称和规格
三、 2.掌握玻璃器皿等器材的清洗、包扎技术
二、实验原理
为确保实验顺利地进行，要求把实验所用的玻璃器皿清洗干净。为保持灭菌后和无菌状
态，需要对培养皿、吸管等进行包扎，对试管和三角瓶等加塞棉塞。这些工作看起来很普通简单，但如操作不当或不安操作规定去做，则会影响实验结果，甚至会导致试验的失败。
三、试剂和仪器
1.高压蒸汽灭菌锅、试管、三角瓶、培养皿和吸管、棉线、纱布、棉花、牛皮纸、报纸等
2.洗涤工具、去污粉和相应洗涤液
四、实验内容
（一）玻璃器皿的清洗：
新购的玻璃器皿的洗涤
将器皿放入２％盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。
对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上晾干，即可使用。
常用旧玻璃器皿的洗涤
确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗衣粉水进行刷洗；
吸取过化学试剂的吸管，先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。
带菌玻璃器皿的洗涤
凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗：
1.带菌培养皿、试管、三角瓶等物品，做完实验后放入消毒桶内，用0.1MPa灭菌20～30 min 后再刷洗。含菌培养皿的灭菌，底盖要分开放入不同的桶中，再进行高压灭菌。
2.带菌的吸管、滴管，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，再经0.1MPa灭菌20 min后，取出冲洗。
3.带菌载玻片及盖玻片，使用后不得放在桌子上，立即分别放入盛有3～5%来苏尔或5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液的玻璃缸（筒）内消毒24h后，用夹子取出经清水冲干净。
新购置的载片，先用2%盐酸浸泡数小时，冲去盐酸。再放浓洗液中浸泡过液，用自来水冲净洗液，浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。
如用于细菌染色的载玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然后用肥皂水洗，再用清水洗干净。
最后将载玻片浸入95%酒精中片刻，取出用软布擦干，或晾干，保存备用。
若用皂液不能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。
4.含油脂带菌器材的清洗
一）单独高压灭菌：
用0.1MPa灭菌20～30 min→趁热倒去污物→倒放在铺有吸水纸的篮子上→用100 ℃烘烤0.5h→用5%的碳酸氢钠水煮两次→再用肥皂水刷洗干净。
（二）玻璃器材的晾干或烘干
不急用的玻璃器材：可放在实验室中自然晾干；
急用的玻璃器材：把器材放在托盘中（大件的器材可直接放入烘箱中），再放入烘箱内，用80～120℃烘干，当温度下降到60℃以下再打开取出器材使用。
（三）器皿的包扎：
要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。
1.培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。
2.吸管：洗净、烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4~5cm
的纸条，以30~50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌。使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出试管。
3.试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。
目前，国内已开始采用塑料试管塞，可根据所用的试管的规格和试验要求来选择和采用合适的塑料试管塞。
若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用油纸包扎。
问题与思考：
叙述常用玻璃器皿清洗方法及步骤
实验一光学显微镜的使用与微生物观察 第一节普通光学显微镜的使用 一、实验目的 1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。 2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。 3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。 二、基本原理 （一）普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。 1、机械系统 机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。 （1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。 （2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。 （3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。镜筒长度一般固定，通常是160mm。有些显微镜的镜筒长度可以调节。
（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。转动物镜转换器可以选用合适的物镜。转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。 （5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。 （6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。 图1-1 普通光学显微镜的构造 1. 镜座 2. 镜臂 3. 镜筒 4. 转换器 5. 载物台 6. 压片夹 7. 标本移动器 8. 粗调螺旋 9. 细调螺旋 10. 目镜 11. 物镜 12. 虹彩光阑（光圈）13. 聚光器14. 反光镜 2、光学系统 光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。 （1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。目镜一般由两块透镜组成。上面一块称接目透镜，下面一块称场镜。在两块透镜之间或在场镜下方有一光阑。由于光阑的大小决定着视野的大小，故它又称为视野光阑。标本成像于光阑限定的
“生命科学领域教学理论与实践研究”教学设计 《显微镜下的水中微生物》 自贡市东方小学何燕（一）科学教育理论指导 通过三年半的科学课学习，学生已对身边世界的许多物质及现象有了一定的认识。本课中，将进一步拓展学生的视野，指导学生认识较微观的世界。通过系列化的探究活动，较全面地收集证据。对各种证据进行处理，尤其是对资料进行分析整理。学习对现象进行科学解释，获得概念性理解。加深对探究的理解。在活动过程中体验科学探究的乐趣，保持和发展探究周围事物的兴趣和好奇心。学生的探究能力、情感态度价值观也将得到进一步的发展。 （二）生命科学领域教学内容与教学方法梳理 《显微镜下的水中微生物》即《用显微镜观察身边的生命世界(三)》是小学科学六年级下册第一单元“微小世界”第七课内容。。在前面两课使用显微镜观察生物细胞的基础上，本课以一滴水为载体，指导学生使用显微镜观察、识别几种生活在水中的常见微生物。本课分为两部分，第一部分是采集、培养微生物；第二部分是识别显微镜下的微生物。本课重点活动是用显微镜观察水中活着的微生物，内容分为“制作微生物装片”“观察微生物”两个主要活动。活动的难点是追踪观察活的微生物，并记录它们的形态和行为。 本课隶属生命科学领域范畴，结合这一特性，老师采用交流互动；分层观察；画图、文字记录；资料卡的引用，来更好地完成教学内容。 （三）学情分析 学生在前面两课的学习中，已能较为准确地使用显微镜，并借助显微镜观察生物细胞。对微生物应该有一定的间接了解，但缺少亲身体验。通过本课的教学，试图使学生进一步感受到观察工具的发展，拓展了人类的观察能力，同时认识到生命体都是由细胞组成的，微生物同样具有生命的特征。并力求发展学生对微生物的研究兴趣。 （四）教学目标 科学概念： 1、用显微镜能看到肉眼不能看到的微小生物。 2、在水中生活着很多形态各异的微生物。 3、微生物通常都有特殊的构造和功能，以适应周围的环境。 4、微生物具有生物的特征，如：对环境有一定的需求、对外界的刺激有反应、能繁殖等。 过程与方法： 1、在显微镜下观察水中活着的微生物，用图文方式记录它们的形态和行为特征。 2、发现微生物的生物特征。 3、对照资料识别微生物的种类。
第 7讲利用显微镜观察身边的微生物 【学习目标】 1. 说出显微镜的各部分结构名称及作用 2. 能说出低倍显微镜观察的主要步骤 2. 尝试利用高倍显微镜观察水体中的微生物 【学习内容】 一显微镜的基本结构: 【目镜】靠近人眼睛 , 用眼睛直接观察的镜头。一般有放大倍数 5倍、 10倍、 15倍等类型 , 其上面分别标有 5X 、 10X 、 15X 等字样 , 放大倍数越大的目镜越。 【物镜】固定于转换器上 , 靠近玻片的镜头。分低倍物镜、高倍物镜和油镜几种类型 , 普通物镜的放大倍数一般为 10倍、 40 倍、 45倍 ,其上面分别标有 10X 、 40X 、 45X 的字样 , 放大倍数越大的物镜越。 【准焦螺旋】准焦螺旋是固定在镜臂上用于调节焦距的旋钮 , 分调节幅度较大的粗准焦螺旋和调节幅度较小的细准焦螺旋两
种。 【转换器】位于显微镜镜筒下方可以自由 转动的圆盘 , 圆盘的上面有三个有螺纹的 圆孔 ,用于安装低倍物镜、高倍物镜和油 镜 (一般不装。根据实验需要可通过转动 转换器换用不同的物镜。 【遮光器】位于载物台下方的可转动的圆盘 , 有多个大小不同的圆孔 , 每一个圆孔称为一个光圈。可通过转动遮光器选择大小不同的光圈 , 以保证合适的进光量。有的遮光器上没有大小不同的圆孔 , 而有一个可调节光圈大小的结构。 【通光孔】载物台中央的圆孔 , 位置、大小都固定 , 无法改变。是光线进入视野的通道。 【反光镜】位于遮光器的下面 , 分凹面和平面两个反射镜面。反光镜的作用是将来自外部光源的光线进行反射,使光线经光圈、通光孔、 玻片、物镜、目镜,到达人的眼睛。凹面镜具有会聚光线的作用, 一般在较暗环境使用; 平面镜没有会聚光线的作用, 在明亮环境使用。 二高倍显微镜的基本操作:
实验一微生物的形态和结构观察 一、实验目的 1、掌握普通光学显微镜的正确使用方法； 2、掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤； 3、在显微镜下观察细菌、酵母菌等的个体形态和结构。 《 二、基本原理 普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。 普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。 机械系统包括镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒及调节器等。镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上；镜台又称载物台，是放置标本的地方，镜台上有压片夹用以固定被检标本，标本移动器可使标本前后和左右移动，有的标本移动器带有游标尺，
可指明标本所在位置；镜臂用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位；镜筒是连接目镜和物镜的金属筒，镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接；物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3~5个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器随意选用合适的物镜；调节器安装在镜臂基部，是调节物镜与被检标本距离的装置，通过调节粗、细螺旋便可清晰地观察到标本。 光学系统主要包括目镜、物镜、聚光镜和反光镜等，较好的显微镜有内光源。目镜一般由两块透镜组成，不同的目镜上刻有5×、10×和15×等字符以表示该目镜的放大倍数；物镜是显微镜中很重要的光学部件，由多块透镜组成，根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜（4×、10×和20×）、高倍物镜（40×和45×）和油镜（90×、95×和100×）等。被检物体经显微镜的目镜和物镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。 形态观察主要包括群体形态和个体形态观察两方面。细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，在显微镜下用油镜进行观察。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为简单染色、鉴别染色和特殊染色。本实验主要观察微生物的个体形态，掌握在细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法——革兰氏染色法；通过此染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色有着重要的理论与实践意义，其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈紫色。而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联疏松，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被脱色，再经蕃红复染后细胞呈红色。 《 三、仪器和药品 仪器：显微镜酒精灯接种柄接种环洗瓶载玻片滤纸镜油擦镜纸无菌水烧杯药品：结晶紫95%乙醇草酸铵碘碘化钾蕃红二甲苯降酚细菌（培养18~24小时的斜面菌种）细菌酵母菌等标本片。 草酸铵结晶紫染液：A液结晶紫2.0g，95%乙醇20mL；B液草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。将A和B充分溶解后混合静止24小时过滤使用。 革氏染液：碘1g ，碘化钾2g ，蒸馏水300mL。
实验一光学显微镜的使用及微生物个体形态的观察 一、实验目的和要求 1）了解显微镜的构造及成像原理。 2）掌握显微镜的使用方法和保养方法。 二、显微镜的构造 （一）机械裝置部分： 1）镜座：是显微镜的支架，由底座和镜臂组成。 2）载物台：又称镜台，用于安放载玻片，其上安有玻片夹和玻片移动器，调节移动器上的螺旋可使载玻片前后左右移动。镜台中央有一孔，称通光孔，可使反光镜上的光反射到物镜中来。 3）镜筒：其上端连接目镜，下端连接转换器。 4）转换器：其上安装三个物镜，镜检时旋转转换器即可换物镜头。注意转换物镜时。必须用手按住园盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以免使物镜与转换器之间的螺纹松脱而损坏显微镜。 5）调焦裝置：包括粗细调焦旋钮，是调节镜筒上下移动的裝置。
（二）光学系统部分： 1）物镜：又称为镜头。有三个物镜头，二个干燥系物镜，一个油系物镜。物镜上标有主要参数，其含意是：例如：上排100/1.25是放大倍数为100，数值口径为1.25，下排160/0.17是指镜筒长为160毫米，盖玻片的厚度小于0.17毫米。它是显微镜的最重要的部分。 普通显微镜接物镜的工作原理 2）目镜：供眼睛观察物像用的，它将物镜放大的物像再放大，配有三个目镜，其上标有放大倍数。显微镜的总放大倍数是目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积. 3）聚光器：起聚集光线的作用，它可上下移动以调节最适光度。其下方安装有可变光圈,用以调节光的强度。 4）反光镜：安装在镜座上。它是一个有平凹两个面的双面镜。其作用是采集外来光线，并且送入聚光器，一般采集自然光时用平面镜，采集人工光源时用凹面镜。 三、实验材料和器材 双目显微镜、二甲苯、苯酚、擦镜纸、固定片等 四、实验操作步骤 （一）显微镜的使用方法： 1.准备工作：取出显微镜时，应一手握镜臂,一手托镜座，轻拿轻放，切忌碰撞和猛震。显微镜应放在离桌边60毫米左右的位置。再将登子的高低调节好，不得将显微镜倾斜。 2.采光：将低倍镜与镜筒调节成一条直线，用双眼向下看，同时调节反光镜寻找光源。直至全视野有均匀的明亮度，效果最佳为至。也可同时调节聚光镜和光圈。 3.放置标本：上升镜筒，将标本片放在载物台上，用玻片夹夹住，把标本移动至中央孔的位置。 4.调焦：眼睛看着低倍镜头，缓慢转动粗调旋钮，使低倍物镜头下端接近于玻片。再用
《用显微镜观察身边的生命世界(三)》教案 教学目标： 知识与技能： 1、用显微镜能看到肉眼不能看到的微小生物。 2、在水中生活着很多形态各异的微生物。 3、微生物通常都有特殊的构造和功能，以适应周围的环境。 4、微生物具有生物的特征，如：对环境有一定的需求、对外界的刺激有反应、能繁殖 等。 过程与方法： 1、在显微镜下观察水中活着的微生物，用图文方式记录它们的形态和行为特征。 2、发现微生物的生物特征。 3、对照资料识别微生物的种类。 情感、态度、价值观： 1、发展对微生物进行研究的兴趣。 2、培养微生物具有多样性和复杂性的意识。 教学重点：运用显微镜观察认识一些水中的微生物。 教学难点：记录并识别水中的微生物。 教学准备： 实验器材：显微镜、水中的微生物如草履虫、眼虫等。滴管、载玻片、盖玻片、脱脂棉。演示器材：介绍微生物的图片 教学过程： 一、观察水中的微生物 1、故事导入：罗伯特·胡克最早在显微镜下发现了生物的细胞结构，而列文·虎克用他自制的显微镜发现了曾经不为人知的奇妙的微生物世界，他在他的观察记录里这样描绘：“大量难以相信的各种不同的、极小的‘狄尔肯’……它们活动相当优美，它们来回地转动，也向前和向一旁转动……”“一个粗糙沙粒中有100万个这种小东西；而在一滴水中，‘狄尔肯’不仅能够生长良好，而且能活跃地繁殖——能够寄生大约270多万个‘狄尔肯”。“狄尔肯”（拉丁文中“细小活泼的物体”的意思）就是后来人们常说的微生物。1675年，雨水成了列文虎克的观察对象，他描述到：“我用4天的时间，观察了雨水中的小生物，我很感兴趣的是，这些小生物远比直接用肉眼所看到的东西要小到万分之一……这些小生物在运动的时候，头部会伸出两只小角，并不断地活动……如果把这些小生物放在蛆的旁边，它就好
实验一微生物形态观察 一、实验目的 1．巩固显微镜的使用方法，重点练习油镜的使用； 2．认识细菌、放线菌和霉菌的基本形态特征和特殊结构； 3．练习手绘微生物图片。 二、实验原理 1．细菌基本形态 细菌是单细胞生物，一个细胞就是一个个体。细菌的基本形态有3种：球状，杆状和螺旋状，分别称为球菌、杆菌、螺旋菌。球菌根据细胞分裂后排列方式的不同分为单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。杆菌分为单杆菌、双杆菌、链杆菌等，是细菌中种类最多的。螺旋菌分为弧菌和螺菌。 除此之外，还有一些特殊形态的细菌。 2．细菌特殊结构 细菌的特殊结构包括荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。荚膜是某些细菌向细胞壁表面分泌的一层厚度不定的胶状物质，具有抗干燥、抗吞噬和附着作用。鞭毛是某些细菌表面着生的1至数根由细胞内伸出的细长、波曲的丝状体，具有运动功能，在菌体上的着生位置、数目因菌种而异。菌毛（又称纤毛）是在细菌体表的比鞭毛更细、更短、直硬，且数量较多的丝状体，与细菌吸附或性结合有关。芽孢又称内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段，在菌体内部产生的圆形、椭圆形或圆柱形休眠体，具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等特性。 3．真菌的结构特征 菌丝是构成真菌营养体的基本单位，是一种管状细丝。可伸长并产生许多分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。根据菌丝中是否存在隔膜可分为无隔膜菌丝和有隔膜菌丝。为适应不同的环境条件和更有效地摄取营养满足生长发育地需要，许多真菌的菌丝可以分化成一些特殊的形态，这些特化的形态称为菌丝变态。比如吸器、假根、子实体。 4．放线菌的结构特征 放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞生物。链霉菌是典型的放线菌，其细胞呈丝状分枝，菌丝直径很小，在营养生长阶段，菌丝内无隔，故一般呈多核的细胞状态。当其孢子落在固体基质表面并发芽后，就不断伸长、分支并以放射状向基质表面和内层扩展，形成大量色浅、较细的具有吸收营养和排泄代谢废物功能的基内菌丝，同时在其上又不断向空间方向分化出颜色较深、直径较粗的分枝菌丝，这就是气生菌丝。不久，大部分气生菌丝成熟，分化成孢子丝，并通过横隔分裂方式，产生成串的分生孢子。 5．微生物菌落 菌落是在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态和构造等特征的子细胞集团。细菌的菌落有其自己的特征，一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易调取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态、构造等特征上也有许多明显的反映。 三、实验器材 普通光学显微镜（Nikon YS-100），镜油，镜头纸，擦镜液；
7、用显微镜观察身边的生命世界（三） 【教学目标】 科学概念： 1、用显微镜能看到肉眼不能看到的微小生物。 2、在水中生活着很多形态各异的微生物。 3、微生物通常都有特殊的构造和功能，以适应周围的环境。 4、微生物具有生物的特征，如：对环境有一定的需求、对外界的刺激有反应、能繁殖等。 过程与方法： 1、在显微镜下观察水中活着的微生物，用图文方式记录它们的形态和行为特征。 2、发现微生物的生物特征。 3、对照资料识别微生物的种类。 情感、态度、价值观： 1、发展对微生物进行研究的兴趣。 2、培养微生物具有多样性和复杂性的意识。 【教学重点】运用显微镜观察认识一些水中的微生物。 【教学难点】记录并识别水中的微生物。 【教学准备】 分组实验器材：显微镜、水中的微生物如草履虫、眼虫等。滴管、载玻片、盖玻片、脱脂棉。 教师演示器材：介绍微生物的图片或课件 【教学过程】 一、观察水中的微生物 1、故事导入：罗伯特·胡克最早在显微镜下发现了生物的细胞结构，而列文·虎克用他自制的显微镜发现了曾经不为人知的奇妙的微生物世界，他在他的观察记录里这样描绘：“大量难以相信的各种不同的、极小的‘狄尔肯’……它们活动相当优美，它们来回地转动，也向前和向一旁转动……” “一个粗糙沙粒中有100万个这种小东西；而在一滴水中，‘狄尔肯’不仅能够生长良好，而且能活跃地繁殖——能够寄生大约270多万个‘狄尔肯”。“狄尔肯”（拉丁文中“细小活泼的物体”的意思）就是后来人们常说的微生物。1675年，雨水成了列文虎克的观察对象，他描述到：“我用4天的时间，观察了雨水中的小生物，我很感兴趣的是，这些小生物远比直接用肉眼所看到的东西要小到万分之一……这些小生物在运动的时候，头部会伸出两只小角，并不断地活动……如果把这些小生物放在蛆的旁边，它就好像是一匹高头大马旁边的一只小小的蜜蜂……”。雨水中的小生物其实就是原生动物。1683年，牙垢成了列文虎克关注的对象，他发现人口腔中竟然躲藏着许多“小动物”，它们像蛇一样用优美的弯曲姿势运动。他惊叹地记录道：“在人的口腔的牙垢中生活的动物，比整个荷兰王国的居民还要多。”这就是人类第一次观察到细菌时发出的感叹。 今天我们借助显微镜来观察和认识一些水中的微生物。 2、制作装片 1) 准备好一块载玻片 2) 在玻片中央放少量脱脂棉纤维
（教科版）科学六年级下册第一单元7《用显微镜观察身边的生命世界》（三）习题 一、选择题 1．下列食物中，不是在微生物帮助下生产的是（）。 A．米饭B．臭豆腐C．醋 2．用显微镜观察水中采集到的微生物时，不需要用到的是（）。 A．滴管B．碘酒C．载玻片 3．我们身边生活中形态各异的微生物，下列选项中属于微生物的是（）。 A．草履虫B．七星瓢虫C．千足虫 4．在实验中，我们采集微生物的主要场所是（）。 A．鱼缸、池塘中的水B．盐水C．碘酒 5．对于微生物的特点，下列叙述不正确的是（）。 A．种类繁多B．生长繁殖慢C．分布广泛 6．下列在自然界里肉眼不能直接看见，必须借助显微镜放大才能观察到的微小生物是（）。A．蚜虫B．变形虫C．苍蝇 7．下列是显微镜下观察到的几种微生物，其中草履虫是（）。 A．B．C． 8．衣藻、草履虫是通过（）与外界环境进行物质交换的。 A．细胞膜B．细胞质C．细胞核D．鞭毛和纤毛 9．草履虫、变形虫等原生动物都是由（）细胞组成。 A．一个B．多个C．无数个 10．硅藻种类繁多，约有（）。 A．1100 B．11000 C．2200 D．22000 11．草履虫身体由（）细胞构成。 A．1个B．200个C．1000个D．500个 12．（）生活着大量的微生物，是采集微生物的主要场所。 A．鱼缸、池塘、溪沟的水中B．海洋中 C．花园等土壤中D．植物的根、茎、叶上 13．下列说法错误的是（）。 A．鼓藻每个细胞又两个“半细胞”构成 B．变形虫是一种原生动物
C．鼓藻有一种生殖方式 D．硅藻是鱼、贝、虾类特别是其幼体的主要饵料，它与其他植物一起，构成海洋的初级生产力14．下列哪种不属于微生物（）。 A．蓖麻叶B．草履虫C．变形虫D．蓝藻 15．在显微镜中观察到一个污点，移动玻片标本和转动物镜，污点不动，污点应该在（）。A．目镜上B．物镜上C．玻片标本上。 16．下列生物中不属于微生物的是（）。 A．鼓藻B．海藻C．团藻 17．我们的皮肤表面，每平方厘米含有的细胞数量超过（）。 A．10个B．10万个C．10亿个。 18．下面三种观察方法中，能观察到草履虫的结构的是（）。 A．肉眼观察B．放大镜下C．显微镜下 二、判断题 19．我们喝的桶装矿泉水是经过净化处理的，因此里面没有细菌。（） 20．第一个揭开微生物秘密的人是弗莱明。（） 21．家里饮用的桶装水因为经过净化处理，所以不存在微生物。（） 22．土壤中的微生物吸收了植物所需要的营养物质，不利于植物生长。（） 23．微生物也需要营养，能够繁殖，具有细胞结构。（） 24．微生物几乎无处不在。（） 25．人们用早期的显微镜看不到血液在毛细血管里流动。（） 26．我们可以用干草来培养微生物。（） 27．制作微生物玻片标本时，我们可以通过吸走多余的水分来控制微生物的运动。（）28．建立自然保护区是保护生物多样性的有效方法。（） 29．并不是所有的微生物对人类都是有害的。（） 30．鱼缸、池塘、溪沟的水中生活着大量的微生物，是采集微生物的主要场所。（）31．如果微生物运动迅速，不便于观察，我们可以先在载玻片上放少量脱脂棉纤维，再在上面滴一滴池塘水，盖上盖玻片。（） 32．用显微镜能看到肉眼不能看到的微生物。（） 33．微生物是一种生物，因此也会新陈代谢。（） 34．微生物具有与其他生物共同的特点，都能自己制造食物。（） 35．血液中的红细胞可以运输氧气。（） 36．不同生物的细胞是不同的，同一生物不同器官的细胞是相同的（）。
7.用显微镜观察身边的生命世界（三） 1．判断题。 (1)列文虎克在雨水、河水、井水中都找到了微生物。 ( ) (2)在污浊的水中有微生物，在澄清透明的水中不存在微生物。 ( ) (3)鱼缸里的水变绿是因为水中植物太多。 ( ) (4)池塘里有很多微生物，但取一滴池塘里的水，微生物就很少甚至没有。( ) 2．选择题。 (1)在实验中，我们采集微生物的主要场所是( )。 A．鱼缸、池塘中的水 B．盐水 C．碘酒 (2)取水渠中的水，倒人装有( )的烧杯中，几天后可以发现水面上出现了大量 的霉点。 A．盐水 B．干草 C．酒精 (3)如果水池中有草履虫，那么在( )后培养液中会出现大量的同类生物。 A. 1～2天 B．1～2周 C．1～2个月 3．读图题。 图1 图2 (1)请简单说明图1培养微生物的方法。 (2)图2中的霉点是由什么组成的？说明了什么？ 4．填空题。 (1)在观察微生物时，如果微生物运动迅速，我们可以先在载玻片上放少量，
再在上面滴一滴池塘水，盖上盖玻片。也可以用在盖玻片的边缘吸走多余的水分。（填“吸水纸”或“脱脂棉纤维”） (2)观察微生物装片时，将载玻片标本放在显微镜的载物台上，先用低倍镜观察，必要时再换观察，一边观察一边画图记录微生物的特征。 5．连线题。 请将下面四种微生物与其名称进行连线。 草履虫变形虫鼓藻船形硅藻 6．实验题。 请写出制作微生物载玻片的步骤并排序。 (1)写出简要的制作步骤。 (2)在括号里写出制作顺序。 ( ) ( ) ( ) 7．简答题。 如何判断微生物是不是生物呢？（试写出3条理由） 8．【探究题·选择】如下图，橘子腐烂时，在橘子的表面长出了许多的青霉菌，青霉菌的菌丝已经深入了橘子的内部，这些菌丝会继续导致橘子的内部腐烂，将橘子的营养物质消化掉。
下次仍要带预习报告来，概括的写就可以了，目的、原理、构造、使用操作步骤写写就可以了。本周二督导来查过，下周有可能还要来。 实验三显微镜的使用和微生物鉴定 一、实脸目的 1.了解普通生物显微镜的分类、构造、工作原理及普通生物显微镜的使用、维护方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法，熟悉几种常见微生物的基本形态。 二、基本原理 微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40-45×）和油镜（l.8 mm，95-100×）三种。油镜常在镜筒外标有白圈，它是三者中放大倍数最大的。 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n = 1.52与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图l ）。 图1 接物镜和标本之间不同折射率时的光线通路（A：空气，B ：香柏油）显微镜的分类： 目前，显微镜根据结构和原理不同主要分为光学显微镜和电子显微镜，它们中又分成几种类型。 光学显微镜有明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜和立体显微镜等。 明视野显微镜——普通生物显微镜 暗视野显微镜——利用特殊的集光器，不使被照射物体的光线直接射入物镜，我们看到的是检测物体表面散发的散射光而观察到物体，所以实际是在暗视野中见到明亮的物象。这样可以观察比较透明的活的微生物，省去染色等步骤，能比较清楚的观察微生物的形态。 相差显微镜——人眼能观察物体主要是物体所散发出的光线，光具有波粒二相性。波长对应的是颜色，振幅对应亮度。普通生物显微镜观察物体时的染色就是改变被观察物体的波长。但染色时，通常会破坏微生物内部的结构，如果不染色，它有时无法和它周围环境相区
第7讲利用显微镜观察身边的微生物 【学习目标】 1.说出显微镜的各部分结构名称及作用 2.能说出低倍显微镜观察的主要步骤 2.尝试利用高倍显微镜观察水体中的微生物 【学习内容】 一显微镜的基本结构： 【目镜】靠近人眼睛，用眼睛直接观察的 镜头。一般有放大倍数5倍、10倍、15倍等 类型，其上面分别标有5X、10X、15X等字 样，放大倍数越大的目镜越。 【物镜】固定于转换器上，靠近玻片的镜 头。分低倍物镜、高倍物镜和油镜几种类 型，普通物镜的放大倍数一般为10倍、40 倍、45倍，其上面分别标有10X、40X、45X 的字样，放大倍数越大的物镜越。 【准焦螺旋】准焦螺旋是固定在镜臂上用 于调节焦距的旋钮，分调节幅度较大的粗 准焦螺旋和调节幅度较小的细准焦螺旋两 种。 【转换器】位于显微镜镜筒下方可以自由 转动的圆盘，圆盘的上面有三个有螺纹的 圆孔，用于安装低倍物镜、高倍物镜和油 镜(一般不装)。根据实验需要可通过转动 转换器换用不同的物镜。 【遮光器】位于载物台下方的可转动的圆盘，有多个大小不同的圆孔，每一个圆孔称为一个光圈。可通过转动遮光器选择大小不同的光圈，以保证合适的进光量。有的遮光器上没有大小不同的圆孔，而有一个可调节光圈大小的结构。 【通光孔】载物台中央的圆孔，位置、大小都固定，无法改变。是光线进入视野的通道。 【反光镜】位于遮光器的下面，分凹面和平面两个反射镜面。反光镜的作用是将来自外部光源的光线进行反射，使光线经光圈、通光孔、玻片、物镜、目镜，到达人的眼睛。凹面镜具有会聚光线的作用，一般在较暗环境使用；平面镜没有会聚光线的作用，在明亮环境使用。 二高倍显微镜的基本操作：