一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定
1、实验技术及原理：
运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型
（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：
2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠
2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM
2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗
3、细胞培养的方法与步骤：
3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：
3.2.1操作步骤
a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。
d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
e．接种培养：每10cm2的培养瓶接种1ml的细胞悬液，再添加4ml的培养液，盖紧瓶塞。标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。
3.2.2 观察
每天对接种培养的细胞做常规性检查。观察的主要内容：污染与否、细胞生长状态和pH（培养液颜色变化）等情况。如发现培养液变为柠檬黄色有浑浊，表明已被污染，细胞也就不易贴壁生长而逐渐死亡。如培养液颜色变为紫色，可能系培养瓶有裂口或瓶塞漏气，CO2逸出或由于细胞生长不良有大量死亡。如培养液为橘红色，一般说明细胞生长状态良好。
在没有发生污染，接种24h后，可见到许多细胞贴壁（由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状），24小时后第一次换液，以后3天换液一次。培养3-4天时，细胞生长繁殖，细胞数量增加，并可见细胞形成孤立小片（细胞岛），逐渐扩展，细胞透明，颗粒啥，界线清晰。7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，（80%融合后）可进行传代培养。
3.3细胞传代培养
3.3.1操作步骤
a．取一瓶脂肪干细胞在倒置相差显微镜下观察，培养细胞如长成致密的单层，即可进行传代。
b．将培养瓶带人超净工作台，倒去细胞培养液，吸取2ml-3ml PBS加入培养瓶中，轻轻振荡后倾去，可重复进行一次。
c．加入5-8滴0.25% Trypsin,0.02%EDTA，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，置于室温下笑话2-3min。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔大小空隙时即可倒去消化液。如见消化程度不够时可再延长消化1-2min。如见细胞大片脱落，表明已消化过头，则不能倒去消化液而直接进行下一步操作。
d．加入3ml培养液于培养瓶中终止消化。吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。取样计数，调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。吸取1ml细胞悬液加到另一培养瓶中，原瓶留下1ml细胞悬液，弃去多余悬液（可分别提取1ml接种分配到多个培养瓶中），并向每瓶中加4ml培养液。盖好瓶盖，标上名称、组号和日期，在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后，置于37℃5%CO2孵箱培养。
3.3.2观察
细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等情况
消化传代。此过程中所做处理同原代培养。注意观察细胞五个时期的特点（游离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。
细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。
4细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞
免疫表型（CD29/CD44）的鉴定
4.1在细胞镜下作形态学观察，与正常形态比较（原代培养后，传代2-3次，ACSs呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在25-30um，待细胞达到汇合时，它们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞）
4.2细胞周期分析
分别取生长融合达30%-40%和90%以上的第三代细胞，以4°C预冷的70%冰乙醇固定，4°C放置24小时；用PBS洗涤2次；加入RNA酶10ug和碘化丙啶（PI）0.3ml重悬细胞（4°C，30分钟）。用流式细胞仪以FL2红色荧光条件检测。应用Modfit LT 2.0 软件分析细胞周期。
取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
4.2细胞表面分子免疫标记的鉴定
a.方法：直接免疫荧光法
b．试剂及材料：单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE,及同型对照抗体；细胞洗液：含2%BSA、0.1%NaN3的PBS；固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）；4、流式细胞仪。
c．操作方法：
每个样品取2只，分别标记同型抗体作为阴性对照、待测，分别加入106 个/100ul待测细胞。对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体 CD29 、CD44 对照抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE为实验管，各20ul，混匀。置于于室温避光孵育 30分钟，加入2ml 的PBS，1200r/min 离心 10min，弃上清，控干，加入固定液0.5ml（染色缓冲剂）。先测同型对照，再测实验管。软件采集数据，分析阳性细胞比例。
二、携带PTN表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定
1、实验技术及原理：运用基因转染技术，将带PTN基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞。
2、具体操作：
2.1材料及试剂：
2.2 脂肪干细胞的准备：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。
2.3将带PTN基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，带有PTN基因混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
2.4用抗生素G418和流式细胞仪筛选，得到PTN高表达的脂肪干细胞
G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul 加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半
流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬
液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识 脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。 大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。 目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。 1 脂肪组织采集 1.1 脂肪组织采集机构要求 脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应在层流手术室内进行无菌操作，最大限度地减少污染和交叉感染的发生。 1.2 脂肪组织供者要求 对供者健康状况进行全面检查(如一般信息、既往病史和家族性遗传病等)及病原微生物的感染筛查和在危险疫区停留情况的调查。身体状态良好、有完整体检报告、无遗传性家族病史、无恶性肿瘤、无急慢性传染病及血液系统疾病；血常规及分类、肝肾功能正常；人源性特定病毒(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)阴性、梅毒螺旋体阴性(提供脂肪组织的同时，另需提供不少于8ml外周血用于复检，ABO血型、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分型检查，以备追溯性查询)。若供者HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV检查结果为阳性，实验室应具有处理感染性样本的独立物理空间、独立的空调系统，能做到使用后的器具和相关物品可经过灭活处理后再移出该区域。感染性样本与非感染性样本的处理及制备不使用同一设备，方可进行脂肪组织的采集，但必须使供者知情，同时通知接收、制备、质控及医护人员等做好防护措施。当实验室不具备上述相对应病原体阳性制备/培养区时，不得采集上述阳性供者的脂肪组织。若供者HIV、梅毒螺旋体检查结果为阳性时，不得采集供者的脂肪组织。高度怀疑HIV感染或者考虑HIV感染窗口期的供者不予采集。 1.3 采集方式、采集部位和采集量 1.3.1 采集方式 用肿胀液(生理盐水250ml＋2%利多卡因10~15ml＋肾上腺素0.25mg)局部浸润麻醉供脂肪组织区域，以20ml注射器配备口径1.5~3.5mm、侧孔3.0~5.0mm的吸脂针，进入供区，形成负压，呈扇形手动均匀吸取脂肪组织，吸出3~5mm3脂肪组织颗粒，若脂肪组织颗粒
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
一、背景知识 临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的重大难题之一。脂肪组织瓣、胶原注射剂、真皮移植、人工合成材料以及游离脂肪组织移植虽已被广泛应用于临床工作中，但人工合成材料易产生异物排斥反应，而自体组织移植又带来供区的继发畸形，临床最常采用的游离脂肪组织移植也面临着移植物再吸收，纤维组织替代和油脂囊肿形成等问题。通常移植物体积减少40一60%的现象，究其原因，游离移植后数以万计或十万计脂肪细胞团块无法从受区获得足够的营养供应，导致移植后的脂肪细胞大量坏死。即使幸运得以存活的脂肪细胞也丧失继续增殖的能力，极易褪化，移植后数月逐渐丧失脂肪细胞特性，逐渐被成纤维细胞所替代。因此，如何有效保证游离移植物的血液供应，以保持其旺盛增殖状态，维持其脂肪细胞特性，是脂肪组织移植成功的关键。组织工程技术的出现为临床上彻底解决组织缺损等难题提供了一条革命性的途径。它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合，修复较大的组织或器官缺损，重建缺损部位的生理功能。为最终实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新途径。 继骨髓基质细胞之后，抽脂来源的人脂肪组织干细胞成为当今干细胞研究领域的又一热点。脂肪组织作为干细胞来源的原因之一是由于从脂肪组织提取干细胞取材容易、量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰老等优点，且可以把抽脂术中过去弃之的脂肪组织悬液变为人干细胞库的重要来源，可作为多种组织工程的种子细胞，具有非常重要的科学研究和应用价值。 据报道全球每年约完成一百万个吸脂手术，吸脂术能产生大量的脂肪抽吸物，脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增，对供区的损伤也小，可以反复进行。抽吸物中包含脂质和液体两部分，脂质的部分包括抽吸的脂肪组织碎片，这些碎片是由于吸脂管的相互运动和真空压力作用使脂肪组织变成了碎片。液体部分其基本组成包括：(l)麻醉药肿胀液中的生理盐水；(2)外周血液；(3)来源于脂肪组织的细胞和组织碎片。目前有关脂肪抽吸物的脂质部分已经被证实可以分离出具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化能力的干细胞，而液态部分中有报道也包含类似的干细胞。我们可以同时富集脂质部分和液体部分来源的干细胞，以增加干细胞的数量，从而提高移植脂肪组织的成活率。
人脂肪来源间充质干细胞库的初步建立 徐潇，张旭毅，闫俊灵，陈冲，赵欣，李明辉，汤苏阳 【摘要】［摘要］目的探讨建立生物学性状稳定的人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)库的可行性，旨在为组织工程种子细胞提供更多来源。方法对分离得到的hADSCs采用液氮低温冻存,并在一定时间复苏培养,以流式细胞仪检测其表面抗原Z在诱导培养基中对其进行成脂和成骨诱导培养,光镜下观察细胞形态Z 免疫组织化学方法检测成骨诱导的特异标志物碱性磷酸酶(ALP)的表达, 观察hADSCs在复苏前后的分化能力。结果从脂肪组织中分离培养扩增获得数目稳定的hADSCs ,经冻存并复苏后的hADSCs形态和表面抗原保持不变Z可继续扩增10代以上，倍增时间为48h o复苏后第2、第6、第10代hADSCs 均保持了较强的成脂及成骨分化能力。结论初步建立hADSCs库,可为再生医学修复重建组织工程提供较好的种子细胞。 【期刊名称】解放军医学杂志 【年(卷),期］2016(041)012 【总页数】6 【关键词】［关键词］脂肪来源间质干细胞；干细胞库；低温保存；可行性研究近年来，再生医学的迅速发展为组织工程修复组织缺损提供了种子细胞和可利用的细胞基质，其中脂肪干细胞与其他干细胞相比具有来源丰富、取材简单、便于培养、无组织配型及免疫排斥问题、可跨胚层多向分化、增殖速度快等显著优点Z是优秀的组织工程种子细胞［1-3］O人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived Stem CeIlS , hADSCs)是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞［4］,是极具前景的组织工程和基因治
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理： 运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型 （CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，置于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min 10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min 离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
收稿日期：2009-05-22 作者简介：韩铮(1982-)，硕士，E-mail:allenhz520@https://www.doczj.com/doc/317648605.html, 脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究 韩铮，姜平，高建华，鲁峰，付冰川，陈晓炜（南方医科大学南方医院整形外科，广东广州510515） 摘要：目的探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性，以及ADSCs 在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用。方法将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs 混合培养48h 后加入CCK-8试剂，并用酶标仪检测OD 值；在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间，并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察。结果家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs 混合培养后用酶标仪检测OD 值分别为（1.527±0.402）和（1.615±0.351），两组OD 值差异无统计学意义；家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs 的移植皮片的坏死时间为（7.170±1.472）d ，未注射ADSCs 的对照组移植皮片的坏死时间为（5.830±1.169）d ，两组皮片坏死时间差异具有统计学意义；术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。结论脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低，对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用。关键词：脂肪来源干细胞；免疫原性；免疫调节；组织工程中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)10-2144-03 脂肪来源干细胞(ADSCs)是成体干细胞的一种，自Zuk 等［1］报道以来，以其来源广泛、取材简便的特点和可多向分化的潜能，成为干细胞及组织工程研究领域的热点［2］。近年来有关ADSCs 的研究主要集中于其多向分化潜能［3-6］，而对其免疫学特性仍未展开较深入的研究。本实验以家兔作为动物模型，对家兔 ADSCs 的体外免疫原性及体内的免疫调节作用开展 初步探讨，试为扩充组织工程种子细胞的来源及拓展ADSCs 的应用领域提供实验基础。1材料和方法 1.1实验动物与试剂 健康新西兰大白兔10只，雌雄兼有，体质量 2.0~2.5kg ，由南方医科大学SPF 级动物实验中心提供并饲养。DMEM 高糖培养基，RPMI 1640培养基， 胰酶，FBS （Hyclone ），Ⅰ型胶原酶，CCK-8试剂盒， Percoll 淋巴细胞分离液，PHA （植物凝集素）。1.2方法 1.2.1家兔ADSCs 的分离及体外培养取家兔腹股 沟皮下脂肪5ml ，PBS 缓冲液反复冲洗后剪成约1 mm 3大小的脂肪颗粒，0.1%胶原酶在37℃条件下消化30min 左右。使用等量完全培养基（含10%FBS 的DMEM 高糖培养基）中和，离心（1200r/min ）5min 后 去除上清，沉淀混悬后尼龙网过滤并接种于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO 2孵箱培养。于24h 后更换培养液，此后每3d 换液1次。观察细胞生长情况，待 6~7d 细胞生长融合达80%~90%后，0.1%胰酶消化后按1∶3进行传代培养。1.2.2体外实验 1.2.2.1家兔淋巴细胞的刺激增殖实验取家兔耳缘静脉血5ml ，用Percoll 淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，计数后与PHA 混 合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和PHA （100μg/ml ，20μl/孔）混合培养；对照组：单独家兔淋巴细胞培养组（1× 104/孔）。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶 标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.2.2家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验通过前 述方法分离出家兔淋巴细胞，将其分别与自体 ADSCs 和同种异体ADSCs 混合培养于96孔培养 板，具体实验分组如下，对照组：家兔淋巴细胞（1× 104/孔）和自体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养；实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和同种异体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续 混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.3体内实验家兔10只，随机分成5组（记为A 、B 、C 、D 、E 组），每组2只互为同种异体皮片移植对象。在每只家兔的两侧臀部设计直径为3cm 的圆形 皮片，切取后组内、同侧之间交互移植。实验组（左侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射含自体ADSCs （1×106/kg ）的完全培养基2ml ；对照组（右侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射不含自体ADSCs 的完全培养基2ml 。术后每天观察各组家兔臀部移植皮片的存活情况并记录移植皮片的坏死时间（移植皮片红润，质地柔软，视为皮片存活良好；若皮片变为暗褐色且质地坚硬的面积>2/3，视为皮片坏死），于术后第7日将C 组和E 组两组家兔的实验组及对照组移 南方医科大学学报(J South Med Univ)2009;29(10) 2144··
脂肪干细胞-是一种从脂肪组织中分离提取出的能够贴壁生长 脂肪干细胞-是一种从脂肪组织中分离提取出的能够贴壁生长、具有可塑性、黏附性和多向分化潜能的中胚层来源的成体干细胞。 学术术语来源--- 脂肪干细胞成骨分化及与复合支架结合：在修复骨质疏松症骨缺损中的应用文章亮点： 1 此问题已知的信息：脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，已有较多临床及基础研究证实其成骨能力。 2 文章增加的新信息：文章的特点在于从骨质疏松症的发病机制及其对骨缺损修复的影响、信号通路调控脂肪干细胞成骨分化的机制、脂肪干细胞修复骨质疏松症骨缺损的可行性进行分析，发现脂肪干细胞在修复骨质疏松症骨缺损方面具有广阔应用前景，值得进一步研究。 3 临床应用的意义：随着再生医学的发展，脂肪干细胞应用于骨再生的基础研究已取得了一定的进展，为临床修复骨质疏松症骨缺损提供了更加广阔的思路。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；骨质疏松症；骨缺损；修复；成骨分化；骨再生；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；脂肪组织；骨质疏松；骨再生 摘要 背景：针对骨质疏松症伴发骨缺损疾病的传统治疗方法，诸如自体骨移植、异体骨移植、生物材料植入均有明显的局限性。以脂肪干细胞为种子细胞，采用再生医学的方法，为骨质疏松症骨缺损的修复提供了一种新的途径。 目的：就骨质疏松症的发病机制及其对骨缺损修复的影响、信号通路对脂肪干细胞成骨分化的调控、脂肪干细胞修复骨质疏松症骨缺损的可行性等方面作一总结。 方法：应用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI)和PubMed数据库中1998年1月至2014年9月相关文献。在标题和摘要中以“脂肪干细胞，骨质疏松症，骨缺损，成骨分化，骨再生”或“adipose-derived stem cells, osteoporosis, bone defect, osteogenic differentiation, bone regeneration”为检索词进行检索，重点对77篇文章进行分析。
?综 述? 人脂肪组织来源的干细胞在骨组织工程中的应用 冯 林综述 张锡庆审校 中图分类号 R687 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2005)08-0620-02 作者单位:苏州大学附属儿童医院骨科, 215003 作者简介:冯林,女,河南郑州人,在读博士。研究方向:小儿矫形。 1987年,美国国家科学基金会(NSF )在加利福尼亚举行的专家讨论会上,首次提出了“组织工程”的概念,其定义为[1]:组织工程就是运用工程学和生命科学的原则和方法,研究哺乳类动物正常和病理组织的结构与功能的相互关系,并发展可恢复、保留或改善组织功能的生物替代品。骨组织工程是组织工程的一个重要分支,并且被认为是目前最具有前途和可行性的一个领域。骨组织工程学的研究中种子细胞、支架材料和细胞与材料的相互作用是研究重点。其中种子细胞是组织工程研究中最基本也是首要的环节。 脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一群多能干细胞,具有向多种组织分化的潜能。2001年,Zuk 等[2]从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第一次分离取得了多向分化干细胞,命名为Pr ocessed L i poas p irate (P LA )。研究发现这些P LA 细胞可以在体外稳定的增殖且衰亡率低。免疫荧光和流式细胞仪检测表明P LA 细胞中的大部分来源于中胚层或间质。因为脂肪组织取材容易,因此虽然发现较晚,但研究非常迅速深入,目前已证实脂肪组织来源的干细胞能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向转化,可作为组织工程的种子细胞,有很重要的研究价值。 1 人脂肪组织来源干细胞的多向分化能力1.1 向成骨细胞的定向分化 Zuk 等 [2] 通过实验发现:在向成骨方向诱导4d 后,P LA 细胞的结构开始发生变化,由一个狭长的类成纤维细胞形态转变为一种圆形、立体的形状。7d 后,这些细胞开始分泌出岛状的细胞外基质。2周后内源性碱性磷酸酶染色阳性并形成矿化结节。从第2～4周,培养孔中钙化的细胞外基质的量明显增加,具有统计学意义。而且,P LA 细胞向成骨细胞分化的能力可以维持相当长的时间,其表达碱性磷酸酶活性最迟可达培养的175d 。研究证明了P LA 细胞向成骨细胞分化的能力。 1.2 向软骨方向诱导 Huang 、Zuk [3] 等应用组织学和分子生物学的方法证实在 高密度的培养条件下,培养基中加入TGF 2 β、胰岛素、干扰素和抗坏血酸,48h 内可以诱导P LA 细胞形成明显的软骨结节并表达软骨特异性标记Ⅱ型胶原,硫酸软骨素-4和硫酸角质素。逆转录多聚酶链反应分析也确认了Ⅱ型胶原和软骨 特异性蛋白聚糖—聚集蛋白聚糖的表达。因此认为这种多能干细胞确实具有向软骨方向转化的能力。尽管P LA 细胞不是真正的软骨细胞,但是它们所显示出来的原始软骨组织的特征使得其有望成为软骨组织工程的种子细胞。国内的余方圆等[4]从新西兰大白兔体内切取的脂肪组织进行一系列处理后,将获得的脂肪组织干细胞向软骨方向进行了诱导分化,结果发现细胞逐渐变圆,并聚集形成软骨样结节,Ⅱ型胶原呈强阳性、聚集蛋白聚糖表达阳性、番红0、阿利新蓝染色阳性,也说明了干细胞向软骨的定向分化。 1.3 向肌肉方向诱导 M izuno 等 [5] 将P LA 细胞置于肌源性诱导条件下6周后通 过结构学、组织学和逆转录多聚酶链反映观察到肌源性标记 MyoD1和肌球蛋白重链的表达。研究者发现,诱导3周后,P LA 细胞形成多核巨细胞并提示有肌管形成。另外;MyoD1 和肌球蛋白重链表达的时间不同,在P LA 细胞分化的过程中 MyoD1的表达先于肌球蛋白重链。研究结果揭示:大约有15%的P LA 细胞在诱导6周后向肌肉方向分化。目前,骨骼 肌组织工程主要用来治疗原发性的骨骼肌病变和因创伤和缺血继发的骨骼肌的丧失。对于这些疾病现今尚无有效的治疗,尽管P LA 细胞向肌肉方向分化与其向脂肪组织和成骨方向分化的水平相比较低,但通过应用一些外源性的因素进行干扰以及改善培养条件有希望提高P LA 的分化水平,提高其临床应用价值。 1.4 向非中胚层组织的分化 P LA 细胞为多能干细胞,它可以分化成为多种中胚层来 源的组织,如骨、软骨、脂肪和肌肉。A shjian 等[6]则通过研究发现P LA 细胞可以诱导分化为外胚层来源的早期神经祖细胞。未分化的P LA 细胞本身就表达一些特征性的神经细胞标记,如神经原特异性烯醇化酶(NSE )、波形蛋白和神经原特异性核蛋白(Neu N )。在用异丁基甲基黄嘌呤(I B MX )吲哚美辛和胰岛素诱导2周后,大约20%～25%的P LA 分化形成具有典型神经细胞形态特征的细胞;同时伴随着NSE 、波形蛋白和神经生长因子受体tr12A 表达增加。但是,诱导后的 P LA 细胞并没有表达成熟神经原标记MAP 或成熟星型细胞标 记GF AP 。而且向神经原方向诱导的P LA 细胞出现了一个延迟的整流器即K +电流(一种早期发育的离子通道),同时伴有形态学的改变和神经原特异性标记表达的增加。研究结果揭示,尽管向神经原方向诱导的P LA 细胞并未表现出成熟神经原细胞和神经胶质的特异性标记,但其表现出的早期神经
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910335143.0 (22)申请日 2019.04.24 (71)申请人 朗姿赛尔生物科技（广州）有限公司 地址 510000 广东省广州市白云区机场路 131号四楼D09房 (72)发明人 陈忠平 (74)专利代理机构 广州一锐专利代理有限公司 44369 代理人 杨昕昕 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方 法 (57)摘要 本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一 种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，包含 人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞 的培养扩增步骤；人体脂肪干细胞的提取通过人 脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：胆 酸、甘氨酸、α1-抗胰蛋白酶、二甲基亚砜、0.9% 生理盐水、氯化镁、氯化胆碱、Trypsin -EDTA；人 体脂肪干细胞的培养扩增通过脂肪干细胞培养 基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/ F12基础培养基、甲状腺素、胰岛素、谷氨酰胺、葡 萄酸铁、硒酸钠、维生素C、成纤维细胞生长因子、 L -脯氨酸、氯化胆碱、青霉素；本发明所述人体脂 肪干细胞的提取及培养扩增方法，可显著提高所 获得的干细胞的数量、 成活率和活性。权利要求书2页 说明书5页 附图1页CN 110343661 A 2019.10.18 C N 110343661 A
1.一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，包含如下步骤：人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞的培养扩增步骤。 2.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.3~0.8 mg/ml 胆酸、0.5~1.5 mg/ml甘氨酸、0.5~2.5 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、3~25μl/ml二甲基亚砜、175~220mg/mL 0.9% 生理盐水、60~85 mg/ml氯化镁、10~30mg/mL氯化胆碱、2.5~7.5mg/ml Trypsin -EDTA。 3.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.5~0.7 mg/ml 胆酸、0.8~1.2 mg/ml甘氨酸、1~2 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、10~18μl/ml二甲基亚砜、200~210mg/mL 0.9%生理盐水、70~80 mg/ml氯化镁、15~25 mg/mL氯化胆碱、4~6mg/ml Trypsin -EDTA。 4.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.6 mg/ml胆酸、1 mg/ml甘氨酸、1.5mg/ml α1-抗胰蛋白酶、15μl/ml二甲基亚砜、205 mg/mL 0.9%生理盐水、75 mg/ml氯化镁、20 mg/mL氯化胆碱、5 mg/ml Trypsin -EDTA。 5.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、8~20μg/ml甲状腺素、5~10μg/ml胰岛素、8~12mmol/L谷氨酰胺、100~300ng/ml葡萄酸铁、10~25mg/ml硒酸钠、5~18mg/ml维生素C、20~30mg/ml成纤维细胞生长因子、5~13mg/ml L -脯氨酸、0.5~4.5mg/ml氯化胆碱、1~2mg/ml青霉素。 6.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、12~16μg/ml甲状腺素、6~9μg/ml胰岛素、9~11mmol/L谷氨酰胺、150~250ng/ml葡萄酸铁、15~20mg/ml硒酸钠、10~15mg/ml维生素C、22~28mg/ml成纤维细胞生长因子、7~10mg/ml L -脯氨酸、1~3.5mg/ml氯化胆碱、1.2~1.8mg/ml青霉素。 7.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、14μg/ml甲状腺素、8μg/ml胰岛素、10 mmol/L谷氨酰胺、200 ng/ml葡萄酸铁、18mg/ml硒酸钠、12mg/ml维生素C、25mg/ml成纤维细胞生长因子、9mg/ml L -脯氨酸、2.5mg/ml氯化胆碱、1.5 mg/ml青霉素。 8.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，人体脂肪干细胞的提取通过包含如下步骤的方法实现： 将人脂肪组织置于入离心分离装置中，再加入生理盐水置完全浸没后充分搅拌均匀，使用离心装置分离人体脂肪组织，得上层油层、中层脂肪层、下层沉积层；将中层脂肪层置于离心分离装置中，添加等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心分离后去浮游脂肪并取上层液体，再向上层液体中加入Dulbecco ’s磷酸盐缓冲液，然后离心，取下层沉积细胞，使用Dulbecco ’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；将下层沉积层置于离心分离装置中，加入等体积的脂肪组织消化剂混合均匀，离心后的下层沉积细 权 利 要 求 书1/2页2CN 110343661 A
中国组织工程研究与临床康复第14卷第36期 2010–09–03出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2010 Vol.14, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6685 1Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; 2Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China Cai Zhen☆, Doctor, Attending physician, Department of Plastic Surgery, Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China caizhen1976@126. com Correspondence to: Jiang Hai-yue, Professor, Doctoral supervisor, Seventh Department of Plastic Surgery, Plastic Surgery Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China jianghaiyue@sohu. com Received:2010-05-28 Accepted:2010-06-24 脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型☆ 蔡震1，潘博2，林琳2，蒋海越2，庄洪兴2 Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells Cai Zhen1, Pan Bo2, Lin Lin2, Jiang Hai-yue2, Zhuang Hong-xing2 Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of multi-directional differentiation and exist in human processed lipoaspirate. However, no in-depth studies have addressed biological characteristics of adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) in vitro, and there are some disputes on the results from phenotype studies. OBJECTIVE: To investigate biological characteristics and phenotypes of human ADSCs. METHODS: Human adipose tissue was collected from persons undergoing fat extraction. The ADSCs were digested with collagenase, cultured and subcultured in vitro. Cell morphology was observed and growth curves were drawn. The phenotypes of ADSCs were identified by immunohistochemistry and flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION: ADSCs grew well, presented fibroblast-like growth. No significant change in cell morphology was detected within passage 15. The results from immunohistochemistry showed that cells were positive for CD29, CD44, CD105, but negative for CD34, CD45. Flow cytometry results have shown that cells were positive for CD29, CD44, CD105, MHC-Ⅰ, but negative for CD3, CD14, CD19, CD31, CD33, CD34, CD45, CD106, CD117, CD184. Results have suggested that ADSCs can be abundantly harvested and have stable proliferation in poorly differentiated status in vitro. Stem cell-related antigens were highly expressed in ADSCs. Cai Z, Pan B, Lin L, Jiang HY, Zhuang HX. Biological characteristics and phenotypes of adipose tissue-derived stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(36): 6685-6688. [https://www.doczj.com/doc/317648605.html, https://www.doczj.com/doc/317648605.html,] 摘要 背景：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪来源的干细胞，并表现出多向分化的潜能，但是关于其体外的生物学特性研究不够深入，其细胞表型的研究结果存在一定争议。 目的：观察脂肪来源的干细胞的生物学特性与细胞免疫表型。 方法：取吸脂手术中废弃的人脂肪组织，胶原酶消化法获得脂肪来源的干细胞，体外传代培养，并进行细胞形态学观察，细胞生长曲线测定，免疫组织化学及流式细胞仪检测其细胞表型。 结果与结论：脂肪来源的干细胞生长旺盛，呈成纤维细胞样生长，15代以内细胞形态未见明显变化；免疫组织化学染色显示，细胞表面标记CD29，CD44，CD105表达阳性，CD34，CD45表达阴性；流式细胞仪检测显示，CD29，CD44，CD105，MHC-Ⅰ为阳性，CD3，CD14，CD19，CD31，CD33，CD34，CD45，CD106，CD117，CD184为阴性。结果说明脂肪来源的干细胞体外生长能力旺盛，高表达干细胞相关抗原，可长期传代且保持低分化状态。 关键词：表型；脂肪来源的干细胞；流式细胞仪；生物学特性；干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.36.008 蔡震，潘博，林琳，蒋海越，庄洪兴.脂肪来源干细胞的生物学特性及细胞表型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(36):6685-6688. [https://www.doczj.com/doc/317648605.html, https://www.doczj.com/doc/317648605.html,] 0 引言 间充质干细胞是一群存在于身体各个组织内较原始的细胞，具有自我更新及多向分化潜能[1]，基于这些能力，间充质干细胞在其临床应用上有很大的潜力。自2001年Zuk证实了经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后[2]，脂肪来源的干细胞(adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)的概念得以明确，ADSCs因为其取材容易也被广泛研究。有研究表明ADSCs在体外培养中能迅速增长，累积细胞倍增数在第13代时仍无明显的下降趋势；更为重要的是细胞传至第10代时，仅有5%的细胞进入了细胞衰老期。因此ADSCs可以作为组织工程的种子细胞，成为具有广阔治疗应用前景。关于ADSCs的细胞表型研究，目前的研究结果没有得到统一的认定。本课题通过对ADSCs进行体外培养及对其体外生长的生物学性状及其细胞免疫表型做初步研究，为以后深入进行细胞组织工程的应用研究奠定了实验室基础。 1 材料和方法 设计：细胞体外培养与鉴定。 时间及地点：于2008-01/2008-06在中国医学科学院整形外科医院中心实验室完成。 材料： 实验标本：来自中国医学科学院整形外科医
红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是疑问的地方，希望老师解答下谢谢 一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定 1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液， 0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。 2、实验用品： 2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠 2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM 2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒臵显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤： 3.1无菌操作的要领和要求。（前两周重点学习） 3.2细胞原代培养： 3.2.1操作步骤 a．培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。 b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。 c. 消化：将漂洗后的组织至于平皿中,加入胶原酶（0.075%II型胶原酶, PH），用量（0.1-0.3ug/ml或200U/ml），再用移液管移至烧瓶中，臵于37℃水浴或恒温箱中30分钟），每隔5-10min振荡一次。30min后，生理盐水终止胶原酶的消化。 d. 离心和计数：将离心管做好标记，平衡后以（1200g,1200r/min？10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，将收集的细胞悬液经200目铜网过滤，1200r/min？离心10分钟（先后顺序），得到单个核细胞。加入培养液吹打混匀后取样计数。根据计数结果调整细胞浓度为10⒋个细胞/ml。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。 1材料与方法 1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。 1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。 1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。室温下离心（1200r/min）10min。离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。吸取上、中层丢弃。加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。48h后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每3天换液1次，待细胞融合80％~90％时进行下一次传代。在传代过程中采用差速贴壁法纯化ADSCs，即加入胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，经吹打、离心后，以细胞密度1.0×105mL-1接种在培养瓶内，置于孵箱内培养，4h后弃掉培养皿内DMEM培养基，细胞换液1次，继续在37℃、5%CO2条件下培养。 1.4ADSCs的鉴定 1.4.1细胞形态观察（HE染色）取第3代细胞，以细胞密度5.0×104mL-1接种于12孔细胞培养板上，用细胞爬片法使细胞生长到盖玻片上，培养一段时间，待细胞长满盖玻片，取出，用PBS冲洗3次，将长有细胞的盖玻片放入95%乙醇中固定15min；PBS冲洗2次，每次1min；浸入到苏木紫中染色5~10min；用自来水冲洗干净，浸入到稀盐酸乙醇溶液中进行分色，数秒钟即可；再用自来水浸洗，然后侵入到淡氨水中，使细胞核蓝化3~5min；自来水冲洗，浸入伊红染液中染色3~5min；自来水冲洗，然后经70%、80%、90%乙醇脱水各1次，95%乙醇2次和100%乙醇3次逐级脱水，各1min；二甲苯透明3次，每次1min。然后用中性树胶封 人上睑眶隔脂肪来源的脂肪干细胞的分离培养及鉴定 范开防，王国栋，刘兴龙，杨彪炳（潍坊医学院整形外科研究所，山东潍坊261041） 【摘要】目的探讨人上睑眶隔来源的脂肪提取脂肪干细胞（ADSCs）的可行性，并进行分离、培养及鉴定。方法取健康成年人上睑眶隔脂肪组织，用胰酶进行消化后收集细胞接种于培养瓶内，采用差速贴壁法纯化细胞。用HE染色、免疫荧光进行细胞鉴定，并进行成脂、成软骨诱导。结果HE染色显示细胞形态为长梭形，呈漩涡状生长。免疫荧光鉴定结果显示细胞表面抗原CD44、CD29阳性表达，CD106、CD34阴性表达，说明分离培养的细胞是脂肪干细胞。成脂、成骨诱导实验证明所得细胞有多向分化的能力。结论可以从人上睑眶隔脂肪组织提取出ADSCs，并有多向分化能力，为今后ADSCs的取材提供了新的路径。 【关键词】干细胞；脂细胞；脂肪组织；眼睑；细胞，培养的；分离；鉴定 文章编号：1009-5519（2012）19-2881-02中图法分类号：R457.7文献标识码：A Isolation culture and identification of adipose-derived stem cells separated from upper eyelid orbit septum fat of human beings Fan Kaifang，Wang Guodong，Liu Xinglong，Yang Biaobing（Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College，Weifang，Shandong261041，China） 【Abstract】Objective To investigate the feasibility of extracting adipose-derived stem cells（ADSCs）from the human upper eyelid orbital fat tissue and to perform the isolation，culture and identification.Methods The upper eyelid orbital fat tis-sues of healthy adults were collected.After digestion by trypsin，the collected cells were seeded in culture flask and purified by differential adherence method.These cells were identified by HE staining and immunofluorescence，and performed the adipose and cartilage induction.Results These cells were long fusiform shape and swirling growth by HE staining.The immunofluores-cence showed that these cells were positive for CD44and CD29and negative for CD106and CD34.Adipogenic and cartilage in-duction experiments indicated that these cells were capable of multilineage differentiation.Conclusion It is feasible that ex-tracting ADSCs from the human upper eyelid or bital fat tissue and ADSCs have the multipotent differentiation ability，which provides a new approach to obtain ADSCs in the future. 【Key words】Stem cells；Adipocytes；Adipose tissue；Eyelids；Cells，cultured；Isolation；Identification 基金项目：山东省高等学校科技计划资助项目（J09LF20）。 通讯作者：杨彪炳（E-mail：Ybiaobing@https://www.doczj.com/doc/317648605.html,）。