r论著r
p38MAPK通路在TNF-A诱导人脐静脉内皮细胞分泌ET-1与e NOS中的作用及通心络干预影响
袁国强1,王玲玲1,杨海涛2,吴士珍1,贾振华1,李娟1,吴以岭1
(1.河北以岭医药研究院络病实验室,河北石家庄050035;2.河北医科大学卫生统计学教研室,河北石家庄050017)
中国图书分类号:R287;R322.123;R329.25;R341; R345.44;R345.57;R342.22
文献标识码:A文章编号:1001-1978(2009)11-1415-06摘要:目的观察p38MA PK信号通路在肿瘤坏死因子-A (TN F-A)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达内皮素-1 (ET-1)与内皮型一氧化氮合酶(e NO S)中的作用及通心络干预影响。方法分别采用放免法及EL IS A法测定不同浓度TNF-A(0、215、5、10、15、20L g#L-1)在不同时间点(0、1、2、4、8、12、24h)干预后HUVEC培养上清液中ET-1和e NO S含量;分别采用W este rn blot和R eal ti m e RT-PCR方法检测TNF-A干预24h后HUVEC中ET-1、eNO S蛋白及mRNA表达;采用W estern blot方法检测TNF-A干预10m i n、30m i n、60m in后HUVEC磷酸化p38M APK蛋白表达。结果不同浓度TN F-A随时间延长均明显增加HUVEC培养上清液中ET-1含量,降低eNOS含量;TNF-A升高细胞中ET-1蛋白及mRNA水平、降低e NO S蛋白及mRNA水平、在各时间点均
收稿日期:2009-07-11,修回日期:2009-08-24
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(No 2005CB523301);国际科技合作资助项目(No
2006DFB32460)
作者简介:袁国强(1977-),男,博士生,主治医师,研究方向:心脑血管病基础与临床,Te:l0311-********,Fax:0311-
85901088,E-m ai:l yuanguoq i ang7508@https://www.doczj.com/doc/2416709452.html,;
吴以岭(1949-),男,教授,主任医师,博士生导师,研究
方向:心脑血管病及糖尿病基础与临床,通讯作者,Te:l
0311-********,Fax:0311-********,E-m ai:l jiatc m@163.
co m 可升高细胞p-p38MA PK蛋白表达。通心络可降低TNF-A 诱导的HUVEC培养上清ET-1含量、降低细胞中ET-1蛋白及mRNA的异常升高;增加HUV EC培养上清中eNOS的表达、增加细胞中e NO S蛋白及mRNA的表达;明显抑制TN F-A诱导的细胞p-p38M APK表达。结论p38MA PK信号通路参与了TNF-A诱导HUECV细胞分泌ET-1和eNOS,通心络对内皮细胞保护作用机制与抑制该通路有关。
关键词:肿瘤坏死因子-A;p38MA PK;内皮素-1;内皮型一氧化氮合酶;信号通路;人脐静脉内皮细胞;通心络
血管内皮功能障碍(vascu lar endothelial dys-functi o n,VED)是多种心脑血管疾病发生发展的共同病理生理改变。作为一种具有多种生物学效应的炎性介质,肿瘤坏死因子-A(tu m o r necrosis factor-A, TNF-A)可直接或间接损伤血管内皮[1],实验证实[2] TNF-A可诱导内皮细胞合成释放内皮素-1(endothe-lin-1,ET-1);同时加速内皮型一氧化氮合酶(endo-the lial n itric ox ide synthase,e NOS)mRNA的降解,减弱基因启动子的活性从而下调e NOS的表达[3]。
p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员,在炎症、应激反应中具有重要作用,有研究表明TNF-A可诱导人肺微血管内皮细胞p38MAPK的磷酸化和活化[4],但是否该信号转导通路参与TNF-A诱导ET-1与e NOS的产生却未见报道。众多研究[5,6]证实通心络(Tongx inluo,TXL)能够降低血浆
R egulati on of S REBPs and its research progress
i n the devel op m ent of nonalcoholic fatty liver
DU R ao1,2,XI E M e-i lin1
(1.D e p t of Pharmaco logy,M ed ical Co llege of Soocho w Uni versity,Suzhou,J iangsu215123,China;
2.T he A ff iliated Chil dren's H osp ital of Soocho w U ni ver sity,Suzhou J iang su215007,China)
Abstrac t:N ona l coho li c fa tty li ve r(NA FL)is characte rized by t he hepatocyte steatosis and li p i d accu mu l a ti on,and i s a c linical syndrom e o f unre l a ted to excess i ve alcoho l consu m pti on.A t present,pa ti ents w ith t he syndrom e obv i ously i ncrease i n t he who le w or l d.Sterol regulatory e l ement-b i nd i ng prote i ns(SREB-Ps)are t he key transcripti on factors of controlling t he b i osynthe-sis of cho lestero,l fatty ac i ds and tr i g lyceri des,and ad i pocyte differentiati on.In this paper,the regu l a ti on of S REBP s and its research prog ress i n t he deve l op m ent of NAFL were rev i ew ed.
K ey w ords:stero l regu latory e le m ent-b i ndi ng prote i ns;nona lco-ho lic fatty li ver;cholestero;l tr i g l y ce ri de;fatt y acid;i nsuli n resi s-t ance
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中国药理学通报Chinese Phar maco log ical Bulleti n2009N ov;25(11):1415~20
ET、增加血浆NO浓度,从而有效改善血管内皮功能,但其相关分子机制不明。本研究拟离体观察p38MAPK信号通路是否在TNF-A诱导人脐静脉内皮细胞(hum an u m b ilical ve i n endothelial cel,l HU-VEC)表达ET-1与e NOS中发挥作用,同时为阐明通心络作用机制提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞HUVEC细胞株(ATCC编号:CRL-1730):中国典型培养物保藏中心。
1.1.2药品及试剂通心络超微粉(由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成,石家庄以岭药业股份有限公司,批号:20080223;溶于无血清D M E M);辛伐他汀原粉(浙江京新药业有限公司,实验前用DM SO溶解,DME M培养液稀释, D M SO终体积浓度为011%,实验证明该体积浓度对细胞无影响);重组人TNF-A(Peprotech);SB203580 (B i o source);ET-1放免试剂盒(北京普尔伟业生物科技公司);e NOS酶免试剂盒(ADL);B-acti n抗体、e NOS抗体、ET-1抗体(Santa Cruz);磷酸化p38 MAPK抗体(C ell S i g na li n g);Real ti m e RT-PCR反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。
1.1.3主要仪器凝胶成像分析仪(B iorad);XD 711酶标分析仪(上海迅达医疗仪器公司);DYY-8C 型电泳仪(北京市六一仪器厂);C O2恒温细胞培养箱(Sanyo);CKX41倒置显微镜(O ly m pus);ABI PR I S M7000型实时定量PCR仪(USA);SN-682型放射免疫C计数器(上海核辐光电仪器有限公司);梯度PCR仪(Eppendorf)。
1.2实验方法
1.2.1HUVEC培养上清液ET-1、e NOS含量测定取对数生长的HUVEC,含体积分数为011的胎牛血清(FBS)DME M调至1@108#L-1,按1m l/孔接种于24孔培养板中。24h后换无血清D M E M继续培养24h。加入终浓度分别为0、215、5、10、15、20 L g#L-1的TNF-A分别干预0、1、2、4、8、12、24h,每个浓度于每个时间点设4个复孔。各时间点分别提取细胞培养上清,放免法测定ET-1含量、EL I SA法测定e NOS含量。
1.2.2内皮细胞ET-1、e NOS蛋白及mRNA表达测定调整细胞密度至1@1010#L-1,按3m l/孔接种于6孔培养板中。24h后换无血清D M E M继续培养18h。实验分组:1正常对照组:细胞不加任何干预;oTNF-A组:加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A;?SB203580组:SB203580(终浓度为25
L m o l#L-1)预孵育细胞1h,加入终浓度为10L g# L-1的TNF-A;?~?通心络组:通心络超微粉(终浓度依次为100、500、1000m g#L-1)预孵育1h,加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A;?~á辛伐他汀组:辛伐他汀(终浓度依次为011、1、10L m o l#L-1)预孵育1h,加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A。每组3个复孔。各组细胞培养12h后终止实验,进行蛋白及RNA的提取。
1.2.2.1细胞蛋白提取药物干预12h后各孔加100L l细胞裂解液(50mm o l#L-1T ris-H C l p H618, 100mm o l#L-1DTT,2%SDS,011%溴酚蓝,10%甘油),冰上裂解5m in,取细胞并移入EP管中,短暂离心后置于PCR仪,100e,5m i n煮样,分装。
1.2.2.2W ester n b l o t检测HUVEC中ET-1与
e NOS蛋白各组分别取30L g蛋白进行SDS-PAGE 电泳;凝胶置于电泳仪中,120V、4e转移3h至P VDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1h,裁膜,分别加入5%脱脂奶粉稀释的ET-1(1B200)、B-acti n(1 B1000)、e NOS(1B200)一抗,4e孵育过夜;分别加入二抗(稀释比例分别为1B1000、1B10000、1B 10000),室温孵育1h。ECL发光显色,凝胶成像系统照相,采用quantity one软件分析,扫描吸收度(A)值,蛋白相对表达量以目的蛋白与内参B-acti n 的比值表示。
1.2.2.3细胞总RNA的提取6孔板各孔加入1 m lTr izo l以裂解细胞,常规提取RNA。按RT试剂盒说明配制10L l体系反应液,置于梯度PCR仪中, 37e、15m in;85e、5sec,将mRNA反转录成c DNA。
1.2.2.4R ea l ti m e RT-PCR检测ET-1、e NOS mR-NA表达水平PCR反应体系为SYB R Pre m i x Ex Taq酶10L l、ROX Re ference Dye014L l、c DNA溶液5L l、e NOS/ET-1/B-actin上、下游引物各014L l、d H2O318L,l总计20L l。e NOS、ET-1、B-actin引物序列设计及合成由上海生工生物科技有限公司完成。e NOS上游:5c-CGGC ATC ACCAGGAAGAAGA-3c,下游:5c-CATGAGC GAGGCGGAGAT-3c;ET-1上游:5c-AAGGCAAGCCCTCC AGAGA-3c,下游:5c-CCCGAAGGTCTGTCACC AAT-3c;B-actin上游:5c-AAATGCTTCTAGGCGGACTATGA-3c,下游:5c-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTTTG-3c。
上述PCR反应液分装于96-w ell FastTher m alCy-cli n g p late中,每孔20L,l实时定量PC R仪反应条件:95e预变性10s;95e变性5s、60e退火/延伸31s,扩增40个循环。反应结束后确认Rea l T i m e PCR的扩增曲线与融解曲线,进行实验结果分析。
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Tab1The ET-1content change of clear s upernatant li quid i n HUVEC of every group i nduced by TNF-A at di fferent ti m e poi nts( x?s,n=4)
T i m e/h0L g#L-12.5L g#L-15L g#L-110L g#L-120L g#L-150L g#L-1 087.9?11.983.1?9.686.9?9.979.5?5.654.6?12.678.6?3.8 1100.1?15.3108.8?9.8109.2?29.5101.3?21.394.6?24.376.0?31.0 2111.8?15.5146.8?47.8v125.2?8.8v117.7?12.1108.4?37.5v109.1?12.5 498.1?21.7141.1?19.8#v152.4?21.1#v192.4?12.9##v v124.1?14.6#v v133.4?18.3#v v 8122.2?15.8195.4?32.8#v v182.3?27.6#v v216.3?35.4##v v210.1?27.4##v v202.3?29.2##v v 12146.6?12.1v266.8?16.5##v v215.4?21.9##v v275.4?33.4##v v279.2?16.8##v v257.6?38.5#v v 24128.9?19.0127.0?27.9&&141.1?17.7v v&&139.8?11.7v&&114.0?12.6v&&124.2?9.6v&& v P<0105,v v P<0101vs0h at d ifferent ti m e poi n ts f or every concen tration;#P<0105,##P<0101v s0L g#L-1for every con cen trati on at d iff er-
en t ti m e points;&&P<0101vs12h ti m e poi n t
Tab2The e NO S content change of clear supernatant li qui d i n HUVEC of every group induced by TNF-A at different ti m e points( x?s,n=4) T i m e/h0L g#L-12.5L g#L-15L g#L-110L g#L-120L g#L-150L g#L-1
01.52?0.121.55?0.03 1.51?0.191.53?0.20 1.47?0.11 1.47?0.08
11.42?0.151.52?0.05 1.37?0.121.45?0.07 1.40?0.07 1.52?0.08
21.53?0.151.44?0.05 1.39?0.181.40?0.08 1.45?0.02 1.45?0.02
41.53?0.021.38?0.07v 1.31?0.10#1.25?0.15#v v 1.03?0.11##v v 1.08?0.05##v v
81.47?0.06v1.30?0.05v v 1.13?0.06##v v1.15?0.03##v v 1.14?0.08##v v 1.18?0.17##v v
121.33?0.05v1.35?0.07v v 1.19?0.01#v v1.20?0.06#v v 1.19?0.06#v v 1.19?0.07#v v 241.27?0.02v v1.26?0.03v v 1.20?0.10v v1.16?0.03v v 1.18?0.12v v 1.24?0.06v v v P<0105,v v P<0101vs0h at d ifferent ti m es for every concentrati on;#P<0105,##P<0101vs0L g#L-1f or every con cen trati on at d ifferent ti m e poi n ts
1.2.3细胞中p-p38MAPK蛋白检测调细胞密度至1@1010#L-1,按3m l/孔接种于6孔培养板中。24h后换无血清DME M继续培养18h。实验分组:1正常对照组:细胞不加任何干预;oTNF-A 组:加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A;?SB203580组:SB203580(终浓度为25L m ol#L-1)预孵育1h,加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A;?通心络组:通心络超微粉(终浓度为500m g#L-1)预孵育1h,加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A;?辛伐他汀组:辛伐他汀(终浓度为10L mo l#L-1)预孵育1h,加入终浓度为10L g#L-1的TNF-A。每组3个复孔。分别于实验10、30、60m i n后进行蛋白提取。各组分别取30L g蛋白进行SDS-PAGE(p-p38 MAPK及B-actin一抗稀释均为1B1000,二抗稀释均为1B10000),检测p-p38MAPK表达。
1.3统计学分析采用SPSS1310统计软件,多个样本均数比较用单因素方差分析(One-W ay ANO-VA),多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(LSD),若方差不齐则采用G a m es-ho w ell检验。所有数据均以
x?s表示。
2结果
2.1不同浓度TNF-A在不同时间内对HUVEC培养上清液中ET-1、e NOS含量的影响从2h开始随时间延长不同浓度的TNF-A均不同程度诱导HUVEC培养上清中ET-1表达增高(P<0105或P <0101),并于12h时间点达到峰值。与正常对照组(0L g#L-1)比较,在4、8、12h不同浓度TNF-A 均可引起上清ET-1含量升高(P<0105或P< 0101),以10L g#L-1浓度最为明显,但各浓度间比较差异无显著性(P>0105),结果见Tab1。
从4h开始随时间延长不同浓度的TNF-A均不同程度诱导HUVEC培养上清e NOS表达降低(P< 0105或P<0101),同一浓度各时间点比较差异无显著性(P>0105);与正常对照组(0L g#L-1)比较,TNF-A(5~50L g#L-1)在4、8、12h时间点均可降低上清e NOS含量(P<0105或P<0101),各浓度间比较差异无显著性(P>0105)。结果见T ab2。
2.2TNF-A对血管内皮细胞ET-1、e NOS蛋白表达的影响及通心络干预作用与正常对照组比较, TNF-A组细胞ET-1蛋白表达增加(P<0105),而e NOS蛋白表达则降低(P<0101);与TNF-A干预组比较,除辛伐他汀011L m o l#L-1组外,p38MAP K 特异性阻断剂SB203580及各用药组均降低细胞ET-1蛋白表达(P<0105);与TNF-A组比较,各用药组细胞e NOS蛋白表达均升高(P<0101)。结果见Fig1、2。
2.3TNF-A对血管内皮细胞ET-1、e NOS mRNA 表达影响及药物干预作用与正常对照组比较, TNF-A组细胞中ET-1mRNA表达明显增加(P< 0101),而e NOS mRNA表达则明显降低(P<0101);与TNF-A组比较,SB203580及各用药组均可明显降低细胞ET-1mRNA表达(P<0101),其中通心络组
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F ig 1 The expres s of ET -1and e NO S protei n in
HUVEC of ev ery group
1:C ontrol group ;2:TNF -A group;3:SB203580group ;4:TXL group (100mg #L -1);5:TXL group (500m g #L -1);6:TXL group (1000m g #L -1);7S i m vastati n group(011L mo l #L -1);8:S i m vast a -ti n group(1L m ol #L -1);9:S i m vas t ati n group(10L m ol #L -1
)
F i g 2 The abs orbab ility of ET -1and e NOS pro tei n expression
i n HUVEC lysate o f every group
**
P <0101v s contro l group ;
#
P <0105,
##
P <0101v s TNF -A
group
1000m g #L -1最为明显,辛伐他汀组10L m o l #L
-1
最为明显;与TNF -A 组比较,SB203580及各用药组均升高细胞e NOS mRNA 表达(P <0101或P <
0105),但各组间比较差异无显著性。结果见F i g 3
。
F ig 3 The ET -1and e NO SmRNA express i n
H UVEC l ysate of every group
**
P <0101v s contro l group ;
#
P <0105,
##
P <0101v s TNF -A
group;&&P <0101v s TXL 100mg #L -1and 500m g #L -1group;v
P <
0105vs S i m vastati n 011L m ol #L -1group
2.4 TNF -A 对内皮细胞p -p38MAP K 影响及通心络干预作用 与正常对照组比较,10L g #L -1
浓度
TNF -A 在各时间点均可升高细胞p-p38MAPK 蛋白
表达(P <0101),但未见时效关系。与TNF-A 组比较,SB203580分别于10、30m i n 时抑制p -p38MAP K
表达(P <0105或P <0101),且于30m i n 时达到峰值,60m i n 时抑制作用不明显;通心络与辛伐他汀在各时间点均可抑制p -p38MAPK 表达(P <0101),以60m i n 时效果最为明显(P <0105)。结果见Fig 4、5
。
F i g 4 The expression of p -p38MAPK i n HUVEC of every group
A :10m i n ;
B :30m i n ;C:60m i n,1:Contro l group ;2:TNF -A group ;3:SB203580group;4:TXL group (500m g #L -1);6:S i m vas t ati n group (10L mo l #L -1
)
F ig 5 The absorbability of p -p38M APK expression i n HUVEC l y s a te of ev ery group a t different ti m e po i nts
**
P <0101vs con trol group;#P <0105,##
P <0101vs TNF -A
group ;
v v
P <0101vs 10m i n and 60m i n ;
&
P <0105vs 10m i n and 30
m i n
3 讨论
内皮素(ET)是调节心血管功能的重要因子,对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。ET 有4种异构体:ET -1、ET -2、ET -3及血管活性肠收缩肽(V I C )。其中ET -1mRNA 主要在血管内皮
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细胞表达,是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质,其引起的血管收缩、心肌缺血、代谢紊乱和细胞增殖是血管疾病的关键致病因素。既往研究证实, TNF-A可诱导内皮细胞合成释放ET-1,引起内皮损伤及冠脉痉挛,应用TNF-A抗体则可阻断其引起的组织器官缺血性损伤[2]。本研究中发现,TNF-A随时间延长均可明显增加HUVEC培养上清液中ET-1表达,且于12h达到峰值,具备一定的时效关系。TNF-A干预12h后,内皮细胞中ET-1mRNA及蛋白表达亦明显升高,这与既往研究的结论相一致。
NO是血管内皮细胞分泌的一种重要的信使分子,其活性主要依赖于NOS的生物活性。在内皮细胞内合成一氧化氮的酶主要有e NOS和诱导型一氧化氮合酶(i N OS)。目前研究表明在正常生理状态下由e NOS合成正常浓度的NO具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集等作用,在体内可有效保护心血管系统,其对维持正常的内皮细胞结构及功能完整起着非常重要的作用[7]。本研究中发现,TNF-A随时间延长可明显降低HUVEC 培养上清中e NOS含量;在降低细胞e NOS蛋白表达的同时,TNF-A亦可降低e NOS mRNA水平,表明其对e NOS的抑制作用发生在基因层面,可能与TNF-A加速e NOS mRNA的降解[3]有关。
可见,TNF-A对ET-1的上调以及对e NOS的下调导致了内皮细胞功能失调[8],而内皮功能失调是导致心血管疾病发生的前体。他汀类药物可以改善血管内皮功能,增加一氧化氮合酶的表达与活性[9],促进损伤内皮的修复[10],本研究中通心络与辛伐他汀均可升高HUVEC中e NOS mRNA及蛋白的表达,降低ET-1mRNA及蛋白的表达,从基因与蛋白水平上有效改善受损血管内皮细胞的功能,且二者作用相当。
目前认为TNF-A对血管的损伤主要由NF-J B 信号通路介导,大部分e NOS的激活是通过细胞内钙浓度增加,形成钙-钙调蛋白复合物,或者是激活依赖于磷脂酰肌醇-3-激酶的Akt这一信号途径来实现的。MAPK通路是细胞应激和损伤反应的主要信号通路,它通过影响基因的转录和调控,调节细胞的生物学行为,如细胞增殖、分化、转化及凋亡等[11]。p38MAPK是MAPK家族中的重要成员,其可被应激刺激、炎性因子(TNF-A、I L-1、FGF)及LPS 和G+细菌细胞壁成分而激活[12],在炎症、应激反应中具有重要作用。致病因素如内毒素、细胞因子、低切应力等作用于VEC,通过p38MAPK启动跨核被膜调控导致其功能紊乱、甚至凋亡、脱落和坏死[13,14],氧化应激也可诱导p38MAP K的活化,引起细胞内钙超载,造成内皮细胞渗透性增加,放大炎症反应[15],因而在信号通路水平阻断和调控p38 MAPK的表达和活性,可以减轻内皮细胞损伤或凋亡。
p38MAPK是通过非磷酸化转化为磷酸化状态,进而促进下游底物的磷酸化来快速实现信号传递的。本研究发现,TNF-A在作用10m i n后即可诱导HUVEC细胞中p-p38MAPK表达增高,p38 MAPK特异性抑制剂SB203580在有效抑制p-p38 MAPK表达的同时,对TNF-A诱导的HUVEC细胞e NOS表达降低、ET-1表达增高均具有拮抗作用,这充分表明p38MAPK通路在TNF-A导致血管内皮细胞功能损伤过程中发挥关键作用。通心络可抑制TNF-A诱导的p38MAPK磷酸化和活化,提示其降低HUVEC中ET-1、增高e NOS,从而改善内皮功能,作用机制与抑制p38MAP K信号转导通路有关。
综上所述,p38MAP K介导的信号通路在TNF-A诱导血管内皮细胞功能失调中发挥关键作用;通心络可有效保护内皮细胞,其机制与抑制p38 MAPK磷酸化和活化,进而影响p38MAP K信号转导通路有关。
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The role of p38MAPK signal pathway i n the course of TNF-A i nduci ng HUVEC to secrete ET-1and e NO S and the effect of Tongxi nl uo YUAN Guo-qiang1,WANG Ling-li n g1,YANG H a-i tao2,WU Sh-i zhen1,JI A Zhen-hua1,LI Juan1,WU Y-i li n g1
(1.T he Luobing Laboratory,H ebei Yiling Phar m aceutical Research Instit u te,Shijiazhuang050035,China;
2.D e p t of H ealt h S tatistics,H ebeiM edical Universit y,Shijiazhuan g050017,Ch i na)
Abst ract:A i m To observe the ro le of p38MAPK sig-nal pa t h w ay wh ich w as in t h e course of TNF-A indu-cing HUVEC to secrete ET-1and e NOS and the effect of Tongx inluo.M et hods The contents o f ET-1and e NOS derived fr o m HUVEC culture super natant after exerti n g into different concentrati o n TNF-A(0,215,5, 10,15,20L g#L-1)i n different ti m e po ints(0,1,2, 4,8,12,24h)w ere detected by the m ethod of radioi m-m un ity and EL I SA,respecti v e l y.The protei n and mR-NA expression o f ET-1/e NOS in HUVEC lysate w ere detected by the m ethod ofW estern blot and R ea l ti m e quantitive RT-PCR after24hours added w ith TNF-A. The expressi o n of HUVEC phosphory l a ti o n p38MAPK pro tein w as detected by the m ethod ofW estern blot a-f ter10m in,30m i n,60m i n i n corporated i n to TNF-A, respecti v e l y.R esults The different concentrations of TNF-A could i n crease the ET-1contents i n HUVEC cu ltural supernatant w ith the ti m e pr o long ing,and de-crease t h e e NOS con tents inversely.M eanw hile,TNF-A
cou l d i n crease the l e vel of ET-1protein and mRNA i n HUVEC l y sate sign ificantly,t h e sa m e th i n g,decrease the leve l of e NOS protein and mRNA.In addtion,it cou l d i n crease p-p38MAPK protei n expression at di-f ferent ti m e po i n ts.Tongx inluo cou l d decrease ET-1i n HUVEC cu ltural supernatant and the expression o fET-1pr o te i n and mRNA in ce ll lysate i n duced by TNF-A, on the contrary,it could i n crease e NOS inHUVEC cu-l tural super natant and the expressi o n of e NOS prote i n and mRNA i n cell l y sate,at the sa m e ti m e,Tongx inluo cou l d restrain p-p38MAPK expression i n HUVEC. Conclusions The p38MAPK signal pathway p lays an i m portant role i n the course o f TNF-A inducing HU-VEC to secrete ET-1and e NOS,the pro tecti v e m echa-n i s m o f Tongx inl u o is re lated to the p38MAPK si g na l pathw ay for endothe lial ce lls.
K ey words:t u m or necr osis factor-A;p38MAPK;endo-the li n-1;endothe lial n itric ox i d e synthase;si g na l pat h-w ay;hum an um bilica l vein endothelial cel;l Tongx i n l u o
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