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(收稿日期:2003-05-19)
(本文编辑:王立明)
胆汁酸合成及转运载体研究进展
东南大学附属中大医院普外科(210009)尤承忠综述汤文浩审校
摘要胆汁酸反馈调节包括合成和转运调节,胆汁酸和胆汁酸受体结合,一方面通过抑制7A-羟化酶调节合成,另一方面通过肝细胞基侧细胞膜和毛细胆管侧细胞膜上的载体调节转运。本文就调节途径中的核受体和载体进行综述。
关键词7A-羟化酶胆汁酸核受体Na+-牛磺胆酸协同转运多肽胆盐排泌泵
胆汁酸池中一部分是新合成的胆汁酸,一部分是经肠肝循环重新吸收的胆汁酸。胆汁酸通过5个核受体调节自身合成和肠肝循环,其调节可通过以下两个途径:(1)胆汁酸通过调节7A-羟化酶反馈调节自身合成;(2)胆汁酸通过位于肝细胞基侧细胞膜(sinusoidal or basolateral plasma membrane)和毛细胆管侧细胞膜上的载体对自身的转运进行调节[1]。1胆汁酸对7A-羟化酶的调节
胆汁酸是胆固醇分解的终产物,能刺激肝内过多胆固醇进入胆汁,促使饮食中胆固醇和脂溶性维生素吸收。7A-羟化酶是胆汁酸合成的限速酶,胆固醇和胆汁酸通过对7A-羟化酶调节达到对胆汁酸合成的调节。动物实验证明,增加饮食中胆固醇可刺激编码7A-羟化酶基因(CYP7A1)转录,提高7A-羟化酶活性,胆汁酸合成增加。胆汁酸池过大时则反馈抑制CYP7A1,使胆汁酸合成减少[2]。最近对胆汁酸代谢调节研究发现,至少需要5种核受体方可构成胆汁酸代谢调节环路:(1)肝X受体(liver X re-ceptor,LXR);(2)肝同系受体-1(liver receptor ho-molog-1,LRH-1);(3)胆汁酸受体(farnesoid X re-ceptor,FXR);(4)类维生素A受体(retinoid X recep-tor,RXR);(5)小异二聚体参与者(small heterodimer parter,SHP)[2~5]。
1.1LXR
LXR在肝内表达丰富,包括LXR A和LXR B,两者表达方式不同,但有部分重叠。LXR需与另一核受体RXR结合形成二聚体后发挥功能。LXR的配体为氧化固醇(oxystrol),配体对LXR的激活不但取决于氧化固醇的羟基的精确定位,更取决于羟基的立体化学构成。对LXR的激活能力从大到小依次为22R-羟化胆固醇(22R-hydrocholesterol)、20S-羟化胆固醇、24-羟化胆固醇、25-羟化胆固醇[3]。Peet等[2]研究发现,增加LXR基因敲除鼠饲料中胆固醇的含量,7A-羟化酶表达不能相应增加,胆汁酸
合成受阻,结果肝内胆固醇堆积,肝细胞受损。对CYP7A1启动子序列分析发现,启动子上有LXR反应元件(LXR response element),该元件直接与LXR/RXR结合,以配体依赖方式激活CYP7A1转录。培养的原代鼠肝细胞(primary rat hepatocytes) CYP7A1启动子上LXR反应元件突变,配体依赖方式的CYP7A1不能激活。CYP7A1启动子LXR反应元件的上游还有LRH-1反应元件,氧化固醇与LXR结合诱导CYP7A1表达需要在LRH-1存在的前提下[5]。
1.2LRH-1
LRH-1属于核受体超家族,亦称之为NR5A2,以单体形式结合到DNA,是胆汁酸合成限速酶CYP7A1表达的基本调节因子。同时也是胆汁酸合成酶系下游12A-羟化酶(CYP8B1)表达所必需。另外SHP表达同样需要LRH-1。LRH-1作为一个活性因子(com petence factor)允许LXR激活CYP7A1[5~6]。
1.3FXR
M akishima等[3]发现核受体FXR同LXR一样,需与RXR结合形成二聚体才能发挥作用。胆汁酸对FXR激活是特异性的,与FXR结合后的胆汁酸能有效地抑制CYP7A1表达。激活FXR的主要是初级胆汁酸中的鹅脱氧胆酸(CDCA),另外是次级胆汁酸中脱氧胆酸(DCA)和石胆酸(LCA)。次级胆汁酸中的三羟胆汁酸熊脱氧胆酸(UDCA)对FXR 几乎没有激活作用。在HepG2细胞中证实对FXR 作用最强的是CDCA,其对FXR激活的半数有效浓度(hal-f maximal effective concentration,EC50)为10L M,属人体生理浓度范围。FXR通过一个直接或间接的机制调节靶基因功能,其诱导靶基因表达需结合到靶基因上一个FXR反应元件(IR-molifo)。但del Castillo-Olivare s等[7]对CYP7A1的启动子上的胆汁酸反应元件研究发现其缺乏FXR结合点。研究表明FXR通过诱导SHP表达,来抑制LRH-1从而达到抑制CYP7A1[5]。另外FXR也调节与胆汁酸合成和转运有关的其他几个蛋白活性:12A-羟化酶、肠胆汁酸结合蛋白(intestinal bile acid binding protein)、磷脂转运蛋白[7]。
1.4SHP
胆汁酸与FXR结合诱导SH P表达,SHP是核受体超家族中的一个比较特殊的受体,缺乏DNA 结合区,并不具备传统意义上的受体功能,主要在多个核受体信号途径中起抑制作用,通过抑制DNA 结合和转录发挥调节作用。SH P抑制作用大小取决于本身的相对含量[4,7]。Lu等[5]在HEK293细胞中进行研究发现,SH P对CYP7A1转录抑制呈量效依赖性,SHP含量越大,抑制作用越强。对SHP 启动子研究发现,其上有5个固醇生成因子-1 (stero idogenic factor-1,SF-1)结合点。肝脏并不表达SF-1,但肝脏表达SF-1的/近亲0LRH-1。SHP 对CYP7A1抑制作用是通过抑制LRH-1转录实现的。SHP特异性作用于LRH-1基因AF2激活区,但AF2激活区也是其他复合激活因子(coactiver)作用部位,SHP与其他复合激活因子如p160竞争性地和LRH-1结合。SH P蛋白的N端是受体相互作用区,C端是一个自主的抑制区,N端与受体相互作用产生抑制。SHP的C端突变后仍能保持与LRH-1结合能力,并抑制LRH-1转录,但抑制能力下降[6]。
1.5RXR
核受体RXR与FXR或LXR形成二聚体,被类维生素A激活后可减少胆固醇吸收。机制有二: (1)激活的FXR/RXR诱导产生SHP,进一步通过LRH-1抑制CYP7A1使胆汁酸合成减少;(2)激活的LXR/RXR调节ABC1(AT P-binding cassette transporter1)表达。ABC1是位于细胞膜上细胞内未酯化胆固醇外向转运的能量依赖性载体,促进小肠排出胆固醇[8]。
1.6其他
Davis等[9]发现除胆汁酸以配体依赖方式激活FXR通过SHP抑制CYP7A1基因表达途径外,尚有FXR/SH P非依赖途径。胆汁酸尤其是疏水胆汁酸可激活肝内枯否细胞,枯否细胞表达及分泌细胞因子,其中肿瘤坏死因子-A(TNF-A)和白细胞介素-1B(IL-1B)作用于肝实质细胞引起快速的CYP7A1抑制。胆汁酸对CYP7A1的反馈抑制能通过JNK (c-Jun N-term inal kinase)级联反应信号途径(一种炎症信号途径)调节。Gupta等[10]发现JNK级联反应途径也能被胆汁酸快速激活,而且激活呈时间浓度依赖性。其大体调节模式为:胆汁酸进入肝细胞同时激活JNK和FXR,FXR和JNK结合到SHP基因的不同区域,均导致SHP表达,SH P通过LRH-1抑制CYP7A1。JNK级联反应途径可能与炎症致胆汁淤积情况下胆汁酸合成调节有关。
2胆汁酸对肝细胞膜上载体的调节
门静脉血中重吸收的胆汁酸分泌到胆汁中需经过肝细胞基侧细胞膜摄取和毛细胆管侧细胞膜分
泌。肝细胞基侧细胞膜摄取胆汁酸需Na+-牛磺胆酸协同转运多肽(Na+-taurocholic cotransporting polypeptide,NTCP)和有机阴离子转运蛋白(organic anion-transporting protein,OAT P)两个载体。毛细胆管侧细胞膜分泌胆汁酸需经过胆盐排泌泵(bile salt ex cretory pump,BSEP)[1]。Wolters等[11]发现这些载体能适应大范围的胆汁酸流变化,在胆汁酸流增加3.5倍或减少50%的情况下,不影响NTCP 和BSEP表达。
2.1肝细胞基膜侧的两个载体
肝细胞从门静脉血中摄取胆汁酸是一个非常有效的过程,CDCA、DCA首过消除达到75%~80%。肝细胞对胆汁酸摄取分为NTCP介导的Na+依赖性摄取和OATP介导的Na+非依赖性摄取。NTCP 是主要的摄入系统,OAT P是次要的摄入系统[1]。2.2Na+-牛磺胆酸协同转运多肽
肝细胞通过NT CP摄取胆汁酸是一种可饱和的Na+-胆汁酸同向转运过程。在转运过程中,胆汁酸逆电化学梯度由细胞外向内依靠Na+梯度推动而被摄取。Na+梯度则由位于基膜侧上的Na+-K+-AT P酶维持,因此是一个耗能的主动转运过程。鼠NTCP是一个51kD糖蛋白,高度选择性表达于肝的基膜侧,在毛细胆管侧不表达。NT CP优先调节Na+依赖性的胆汁酸摄入,同时也能摄入胆汁酸结构类似物。NT CP在部分肝切后表达下降,在产后大鼠表达增加[1]。NTCP表达主要受胆汁酸调节。动物实验证明:大鼠胆总管结扎或喂以高胆酸盐饲料,肝细胞内胆汁酸浓度增高,结果NTCP表达下降。胆汁酸的去污剂样作用易损伤生物膜,肝细胞内高浓度胆汁酸可引起细胞内各种膜相结构功能失常,导致肝细胞损伤。NTCP表达下降是一种自身保护机制,可避免肝细胞内胆汁酸浓度过高。这一机制被Sinal等[12]通过FXR缺乏大鼠实验证实,缺乏FXR的大鼠,不能下调NT CP,饮食中胆酸盐浓度过高导致肝细胞损伤。RXR/RAR是NTCP 基因表达重要的激活因子。胆汁酸激活FXR抑制NT CP启动子不是通过直接结合NT CP基因的RXR/RAR元件,而是通过表达SH P间接抑制NT CP表达。RXR/RAR能被SHP通过一个直接的蛋白-蛋白反应抑制[13]。Denson等[14]发现在HepG2细胞中NT CP的RXR/RAR元件突变虽能完全终止TCA和TCDCA经FXR引起的NTCP启动子抑制,但只能减少TU DCA引起的NTCD启动子抑制的50%,提示可能存在另外的非FXR依赖调节机制。
除胆汁酸对NTCP抑制外,经内毒素处理的动物或IL-1B处理的肝细胞中的NTCP转运功能、蛋白表达、mRNA水平、转录起始及启动子活性下降, NTCP启动子转录的活化因子肝核因子-1(HNF-1)和RXR/RAR浓度下降。在H epG2细胞,IL-1B下调NTCP启动子是通过削弱RXR/RAR功能和DNA结合力。对NTCP启动子分析发现,其表达需HNF-1和足迹结合蛋白B(footprint B-binding pro-tein,FPB)存在,NTCP启动子活性需要3个顺式作用元件:(1)TATA元件;(2)H NF-1结合点;(3)FPB 结合点。内毒素使HNF-1下降机制可能发生于转录后调节,包括蛋白修饰,增加降解,产生抑制因子或胞浆捕获。IL-1B引起的RXR/RAR的核结合力下降机制是诱导JNK磷酸化,从而调节RXR磷酸化来实现抑制,这一作用可被JNK特异性抑制剂姜黄素阻断,姜黄素可使IL-1B对NTCP的抑制作用消失[14]。
上述细胞因子与胆汁酸对肝细胞NT CP调节是否有联系尚有争议。Gupta等[10]认为JNK途径可诱导SHP产生,后者下调NTCP基因。但Li 等[15]发现IL-1B对NT CP抑制并不伴有SHP上调。
2.3有机阴离子转运蛋白
有机阴离子转运蛋白转运多种双歧性复合物,能调节Na+-非依赖性胆汁酸转运,属于溶质载体基因SLC21A超家族(人类基因命名委员会数据,Hu-man Gene Nomenclature Committee Data Base)。OATP家族不是主要的胆汁酸摄入系统,包括大鼠的oatp和人的OATP。大鼠的oatp有oatp1、oatp2、oatp3、oatp4及OAT-K1,其中与胆汁酸转运相关的是oatp1,除肝以外在脑和肾中也有表达,在肝细胞基膜侧摄入Na+-非依赖性胆汁酸和一些非胆汁酸的双歧性阴离子,如溴磺汰钠、白三烯C4等。另外oatp1还是基侧膜上的/过流0(overflow)系统,可避免肝内有毒性胆汁酸和其他双歧性复合物堆积[1]。
人OATP家族中第1个OATP称为OAT P-A (SLC21A3),首先从肝中分离,但在血脑屏障中表达最高,有670个氨基酸,与大鼠的oatp有67%~ 73%一致性,其底物特导性与大鼠的oatp1、oatp2、oatp3有部分重叠,与人OATP-2参与Na+-非依赖性胆汁酸转运,具有独特的转运N-甲基奎宁功能。OATP-C(SLC21A6)也称之为肝特异性载体1或人类OAT P-2,有691个氨基酸,与OATP-A有44%的
一致性,限于肝基膜侧表达,转运胆汁酸,是主要的Na+-非依赖性胆汁酸转运载体[16]。OATP-8 (SLC21A8),有702个氨基酸,与人OATP-2有80%的一致性,编码基因含14个外显子,剪接时经13次拼接,是肝细胞基膜侧新发现的一个载体。OATP-8表达受FXR调节,与NTCP不同,胆汁酸激活FXR,FXR与OATP-8启动子胆汁酸反应元件(IR-1)结合,诱导OATP-8表达。OAT P-8功能上类似大鼠oatp1的/过流0系统,在肝内淤胆时可排出亲胆固醇的物质,呈现保护机制。3个新发现的OATP-B、OAT P-D、OATP-E的表达组织特异性低,功能上需进一步研究[17]。
2.4肝细胞毛细胆管侧载体
BSEP/SPGP(sister of p-glycoprotein)是肝细胞毛细胆管侧主要的胆汁酸载体。BSEP的变化,与肝对药物消除、肝内胆汁酸水平、胆汁流量的变化、胆结石形成敏感性有关。C57L鼠是易于诱发胆石品系,肝表达BSEP/SPGP增高。而另一胆石不敏感品系,AKR-抵抗鼠,肝表达BSEP/SPGP较低。BSEP基因突变会导致遗传病,ò型进行性家族性肝内胆汁淤积缺乏BSEP,胆汁酸分泌只有正常人的1%[18]。BSEP/SPGP缺乏可导致:(1)血中胆汁酸升高;(2)胆汁中磷脂成分增高,与胆汁酸上调mdr2(drug and phospholipid transporter)有关;(3)胆汁酸羟化增加,水溶性增强,即胆汁酸通过孕烷受体X(pregnane X receptor,PXR)途径使四羟胆酸生成增加,羟基越多胆汁酸水溶性越大。后两种改变和机体的代偿有关[19]。
Ananthanarayanan等[20]发现在培养的肝细胞中,CDCA和DCA可诱导BSEP表达,诱导能力从大到小依次为CDCA、DCA、LCA,与胆汁酸激活FXR的能力一致。FXR在BSEP表达中的作用通过FXR-/-鼠得到证实,FXR-/-鼠不能有效地调节胆汁酸合成和BSEP表达,其BSEP的mRNA只有正常鼠的70%,高胆酸喂食不能诱导BSEP表达。新近对BSEP启动子克隆研究发现,BSEP启动子有一个高度保守的IR-1序列,IR-1是一个公认的FXR/ RXR的结合点,FXR/RXR结合IR-1元件后激活BSEP启动子。在HepG2细胞中,用LXR、RAR及其他的核受体与其本身的配体结合,均不能诱导BSEP启动子表达,只有FXR和胆汁酸的结合,才能诱导BSEP启动子表达。FXR的胆汁酸结合区突变时,FXR不能激活BSEP启动子。
3结语
在胆汁酸代谢调节中,FXR起着一个中心作用,FXR通过对CYP7A1、NT CP的抑制来抑制胆汁酸合成及肝细胞对胆汁酸的摄取,FXR对BSEP的激活加速了胆汁酸分泌,避免肝内胆汁酸堆积。研究FXR的激动剂或抑制剂,将用于高脂血症和胆汁淤积的治疗。
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(收稿日期:2003-03-21)
(本文编辑:郑晓英)
细胞膜对物质转运形式 （一）单纯扩散 单纯扩散是指某些脂溶性小分子物质由膜的高浓度一侧向低浓度一侧的扩散过程。扩散量的多少，既取决于膜两侧该物质的浓度梯度（浓度差），也取决于膜对该物质通过的阻力或难易程度，即膜对该物质的通透性。浓度梯度大、通透性大，则扩散量就多；反之就少。由于细胞膜是以液态的脂质双分子层为基架，因而仅有脂溶性强的物质（如O2 和CO2）才真正依靠单纯扩散通过细胞膜。 （二）易化扩散 非脂溶性或脂溶性很小的物质，借助于细胞膜上的运载蛋白或通道蛋白的帮助，顺浓度梯度和（或）顺电位梯度（电位差）通过细胞膜的转运过程，称为易化扩散。根据细胞膜蛋白质特性不同，易化扩散一般可分为两种类型： 1.载体转运这是以载体为中介的易化扩散。载体是指膜上运载蛋白，它在细胞膜的高浓度一侧能与被转运的物质相结合，然后可能通过其本身构型的变化而将该物质运至膜的另一侧。某些小分子亲水性物质 如葡萄糖、氨基酸就是靠载体转运进出细胞的。载体转运的特点是：①特异性。即一种载体只转运某一种物质，如葡萄糖载体只转运葡萄糖而不能转运氨基酸。②饱和性。即载体转运物质的能力有一定的限度，当转运某一物质的载体已被充分利用时，转运量不再随转运物质的浓度增高而增加。③竞争性抑制。即当一种载体同时转运两种结构类似的物质时，一种物质浓度的增加，将会减弱对另一种物质的转运。 2.通道转运这是以通道为中介的易化扩散。通道是指通道蛋白，它像贯通细胞膜的一条管道，开放时，被转运的物质顺浓度梯度通过管道进行扩散；关闭时，该物质不能通过细胞膜。当膜电位改变或膜受到某些化学物质的作用时，通道蛋白的构型可发生改变，于是出现通道的开放或关闭。由膜电位改变引起开或关的通道称为电压依从性通道；由化学物质引起开或关的通道称为化学依从性通道。通道对被转运的物质也具有一定的特异性，K+、Na+、Ca2+等都借助于专用通道即钾通道、钠通道、钙通道等进行顺浓度梯度转运。易化扩散和单纯扩散一样，物质转运过程所需能量主要来自浓度梯度所包含的势能转运的当时不需细胞另外供给能量，属于被动转运。 （三）主动转运 小分子物质在膜上泵蛋白的作用下，从低浓度一侧向高浓度一侧耗能性跨膜转运的过程，称为主动转运或泵转运。泵有多种，如钠-钾泵（简称钠泵）、钙泵、负离子泵、氢泵和碘泵等，其中最重要的和研究得最充分的是钠泵。钠泵是细胞膜上的一种Na+－K+依赖式ATP酶，当细胞内Na+或细胞外K+增加时，钠泵就被激活，于是分解ATP，释放能量，并利用此能量逆浓度梯度将细胞内的Na+移出膜外，同时将细胞外的K+移入膜内从而形成和维持了细胞内外Na+、K+的不均匀分布和一定的浓度差。如静息状态时的神经和骨胳肌，其细胞内K+浓度约为细胞外的30 倍，细胞外Na+浓度约为细胞内的12 倍。此浓度差即是一种势能贮备，它对于保持细胞的正常兴奋能力和葡萄糖、氨基酸的吸收等都是非常必的。主动转运是人体最重要的物质转运形式。 （四）出胞与入胞 出胞与入胞是细胞膜对某些大分子物质或团块的耗能性转运过程。 1.出胞又称胞吐，是指物质由细胞排出的过程。如各种细胞的分泌活动，其分泌物大都在内质网形成，经高尔基复合体加工，形成分泌颗粒或分泌囊泡，渐渐向胞膜移动，贴靠以后膜融合并出现裂孔，于是将内容物一次性全部排空。 2.入胞又称内吞，是指物质进入细胞的过程。如进入的物质是固体，称为吞噬；进入的是液体，则称吞饮。入胞进行时，首先是细胞膜伸出伪足，将物质包围，然后发生膜的融合和断裂，异物进入细胞内。
一.刷状缘膜囊的制备：（方法参照Kessler(1978),Shirazi-Beechey(1991)和Bauer （2001b）修正） 所有操作过程需在冰上或者4℃下进行。将冷冻样品进行称重，并在冷烧杯中用缓冲剂（100mM 甘露醇，2mM HEPES/Tris 缓冲剂，pH7.1）解冻。解冻后，在冷的有盖培养皿中用剪刀和镊子将组织样剪为1cm小块，将小块组织样重放入冷烧杯，然后将组织块悬液振动2次(设定为No.80)，每次一分钟。用布氏漏斗过滤振动后溶液，溶液转入250mL量筒，记录滤液体积后转移至400mL烧杯中。将烧杯放置冰上，搅拌溶液。制作多个平行样以备进一步分析，这些处理后样品为匀浆液。已知浓度的氯化镁溶液加入到匀浆液中以达到10mM的终浓度，温和搅拌溶液20分钟，然后进行两种离心：5min，3000*g；30min，30000*g。利用20-G型检测针对剩余的颗粒进行再悬浮，缓冲液为100mM甘露醇+20mM HEPES/Tris，pH7.5。悬浮颗粒在组织研磨机（Potter-Elvehjam; Teflon/glass）中均匀搅拌十次后在30000*g离心30min。最终颗粒用23-G型检测针在500μL缓冲液中（300mM甘露醇，0.1mM硫酸镁，20mM HEPES/Tris，pH7.5）再次悬浮。悬浮颗粒（囊泡）由反复流过27-G型检测针10次的溶液制备均匀，避免出现气泡。将试样等分入冷冻管后-80℃保存。 二.检测 利用BSA(牛血清白蛋白)作为匀浆蛋白浓度和囊泡浓度的标准。麦芽糖酶是刷状缘膜富集度的标记酶，Truner 和Moran（1982）的方法测定麦芽糖酶活，使用25mM磷酸盐缓冲液（pH6.3）和30mM麦芽糖。释放的葡萄糖通过COBAS FaraⅡ（全自动生化仪）（Roche，Montclair，NJ）测定麦芽糖酶活表达为μmol product/min*mg of protein。囊泡中麦芽糖酶活的富集（enrichment）表示为囊泡麦芽糖酶活/匀浆麦芽糖酶活。 37℃下将5μL（50μg of protein）的小囊泡置于预热的微量离心管中，预热的培养基中包含100mM硫氰酸钠或硫氰酸钾、99.8mM甘露醇、20mM HEPES/Tris （pH7.5），再加入200μM葡萄糖（1.0μCi【U-14C】-D-glucose）。加入1mL冰冻终止溶液（150mL氯化钠，250μM根皮苷）3s后葡萄糖吸收被终止。移取0.9mL上述溶液，迅速通过0.45μm圆形纤维素薄膜。整个薄膜用终止溶液（5*1mL）清洗。将薄膜置于20mL 闪烁计数瓶中，瓶中加入12mL scintillation cocktail（Scintisafe Plus 50%LSC Cocktail）。样品通过Quantasmart软件用于放射性测定（闪仪Tri-Carb 2900TR/SL）。在Na+和K+存在的前提下，葡萄糖吸收的测定重复五次。钠依赖性葡萄糖的吸收通过硫氰酸钠孵化值减去硫氰酸钾孵化值得到。 三.免疫印迹
广西大学课程论文 论文标题：抗癌药物紫杉醇研究进展 课程名称：发酵生理学 学生姓名：于凯 学号：1108391006 专业：生物工程 学院：生命科学与技术学院 导师姓名：何勇强 学期：2011-2012/上 任课老师：庞宗文
抗癌药物紫杉醇研究展望 于凯 （生命科学与技术学院生物工程专业2011级；学号：1108391006） 摘要：紫杉醇是从红豆杉属植物中提取分离的一种次级代谢产物，是治疗乳腺癌、卵巢癌的特效新药。作为一种广谱、高效、低毒的抗癌药物，市场上紫杉醇供不应求。目前，有望通过化学合成、内生真菌发酵、植物组织培养、微生物发酵等方法工业化生产紫杉醇，达到缓解红豆杉资源短缺、市场药源紧张等现状。本文通过对红豆杉、紫杉醇发现、作用机理、生产现状等介绍，着重分析各种生产方法的利弊，并对紫杉醇的研究的市场前景作出展望。 关键字：红豆杉；紫杉醇；抗癌作用；研究展望 1红豆杉简介 红豆杉为红豆杉科红豆杉属，是一种濒临灭绝的天然抗癌植物，由于在自然条件下生长缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。 红豆杉在全球共有十一种，分布于北半球温带至亚热带地区。全球资源总量及其有限，且常常散生分布于天然林中。目前我国共有四种和一个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）[1]。东北红豆杉主要分布在分布于中国的东北三省，在中国境内的红豆杉中，东北红豆杉紫杉醇含量最高，可达万分之三。 另外，我国还引种了曼地亚红豆杉，是于20世纪90年代中期从加拿大引种而来，原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉。引种的曼地亚红豆杉生物特性稳定，没有发生变异，紫杉醇含量接近甚至高于原产地。 2 紫杉醇简介 2.1 紫杉醇的发现
基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准
植物细胞中氨基酸转运蛋白的一些已知或未知的功能 膜蛋白对于氨基酸在细胞和细胞器之间的进出是非常必要的。虽然很多推定的氨基酸转运蛋白已经被识别，但仅仅只有一些蛋白对植物细胞氮元素的转运功能起作用。那些研究证实内流系统在细胞和整个植物水平的氨基酸分离中有着基础性的作用。生理学的数据进一步表明氨基酸转运蛋白是植物新陈代谢的主要调节者，它们的活性会影响到植物的生长和发展。相反地，氨基酸外排系统和细胞之间的转运载体的分子机制的研究还很少。同样地，氨基酸转运蛋白的功能和参与氨基酸信号的转运蛋白的调控也是知之甚少。未来的研究需要确认缺失的部分，阐明对整个植物生理和生产能力具有重要作用的氨基酸转运蛋白。 引言 植物中的氨基酸有着高度不同，扮演着必要的角色。通过构建酶和蛋白的模块，它们为植物的新陈代谢和结构提供了重要的成分。此外，它们还是对植物起重要作用复合物的前体或者氮元素的提供者，这些复合物包括核苷酸、叶绿素、激素和次级代谢物。植物可以从土壤中直接吸收氨基酸或者将无机氮（硝酸盐和铵）合成氨基酸。20 种氨基酸中很多是在根部和叶子中的质体中合成，但它们也会在细胞内其他细胞器中合成，包括线粒体、细胞质和过氧化物体。依据合成，氨基酸会被用于新陈代谢，瞬时贮存，或者转运到韧皮部进行营养生长和生殖生长。氨基酸在细胞或者细胞器，以及从源到汇器官的运输在细胞或亚细胞膜中都需要有外排或内流转运功能的蛋白。 不同转运蛋白家族对于氨基酸在植物细胞中的内流作用已 经被识别 至少在18年前，第一个植物氨基酸转运蛋白AAP1/NAT2（氨基酸透性酶1）在拟南芥中被识别。AAP1属于这个家族的8大成员之一（AAP1-8），它们分别转运酸性、中性和碱性的氨基酸。截止到现在，建立在不同的互补实验和序列同源性的基础上，有超过60种的可推测的氨基酸转运体已经在拟南芥中被识别出来了。转运体在不同系统中通过功能分析表达和局部研究，进一步表征，大部分参与了植物细胞吸收氨基酸的过程，它们属于AAP（氨基酸透性酶）、LHT（类似赖氨酸和组氨酸转运蛋白）、ProT（脯氨酸转运蛋白）、ANT1-like
class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 10281 6 Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):1385213911 7 Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):2451224581 8 Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):6073260761 9 Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:54725581 10 Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:91729241 11 Navarro F,Bollman B,Chen H,et https://www.doczj.com/doc/2016708568.html,plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 37423861 12 Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J]. Nat Med,2003,11:1398214031 13 Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:1404214071 14 Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:113982114071 15 Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2 plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:2861228661 16 Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:2867228721 17 Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:1056210601 18 Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:272391 19 G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):281 20 Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 20811 21 Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acid substi2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):5652256571 22 Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):3927239321 23 Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回) 第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述 蔡荣钱程审阅 【摘要】 由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high2capacity or gutted or help2dependent Adenovirus,HD2AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。 【关键词】 第三代腺病毒载体;辅助病毒;Cre/loxP 作者单位:310018浙江理工大学生命科学院 第一代腺病毒载体具有稳定、滴度高、高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而
第32卷第5期2010年10月 大连医科大学学报 J o u r n a l o f D a l i a n Me d i c a l U n i v e r s i t y V o l.32N o.5 O c t.2010腺病毒及其研究进展 陈娜娜,向冬喜,郑丛龙 (大连大学医学院病原生物学教研室,辽宁大连116622) 摘要:本文从腺病毒的分类、结构和受体等方面对腺病毒进行了介绍,同时对腺病毒的感染和致病性做了综述,并进一步介绍了抗腺病毒治疗研究进展和腺病毒载体的应用。对腺病毒多方面进行较全面的了解,有助于促进抗腺病毒药物的研发和加强腺病毒载体在基因治疗中得到更好的应用。 关键词:腺病毒;感染性;致病性;治疗;载体 中图分类号:R373.1 文献标志码:A 文章编号:1671-7295(2010)05-0586-05 A d e n o v i r u s a n d i t s r e s e a r c h p r o g r e s s C H E NN a-n a,X I A N G D o n g-x i,Z H E N GC o n g-l o n g (D e p a r t m e n t o f P a t h o g e n y B i o l o g y o f M e d i c a l C o l l e g e,D a l i a n U n i v e r s i t y,D a l i a n116622,C h i n a) A b s t r a c t:T h e c a t e g o r y,s t r u c t u r e a n dr e c e p t o r o f a d e n o v i r u s a r e i n t r o d u c e di nt h i s a r t i c l e.I t a l s o d e s c r i b e st h ei n f e c t i o n a n d p a t h o g e n i c i t y o f a d e n o v i r u s.F u r t h e r m o r e,t h e r e s e a r c hp r o g r e s s o f a n t i-a d e n o v i r u s t h e r a p y a n dt h e a p p l i c a t i o no f a d e-n o v i r u s v e c t o r a r e r e v i e w e d.W i t h t h e c o m p r e h e n s i v e u n d e r s t a n d i n g o f a d e n o v i r u s,i t i s h e l p f u l t o p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f a n t i-a d e n o v i r u s m e d i c i n e a n dt h ea p p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s v e c t o r i n g e n e t h e r a p y. K e yw o r d s:a d e n o v i r u s;i n f e c t i o n;p a t h o g e n i c i t y;t h e r a p y;v e c t o r 腺病毒(A d e n o v i r u s)是从手术切除的扁桃体组织分离培养得到的一种D N A病毒,主要在细胞核内繁殖,常引起人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中,免疫功能低下的病人感染腺病毒的机率较大,在居住密集的人群,如军队人员中可引起急性发热性呼吸道疾病的暴发流行[1]。随着免疫学、分子生物学、分子病毒学等各个学科的发展和相互渗透,腺病毒在分子水平上的应用越来越广泛,特别是有关腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治疗和腺病毒载体的应用已成为研究的热点。因腺病毒结构简单,宿主范围广,感染率高,易于培养和纯化,使腺病毒作为载体的基因治疗迅速发展。本文就腺病毒及其相关研究进展做一综述。 1 腺病毒的特征 1.1 腺病毒的分类 根据宿主范围不同,腺病毒分为哺乳动物腺病毒属(M a s t a d e n o v i r u s)和禽类腺病毒属(A v i a d e n o v i r-u s)。人腺病毒(H u m a n a d e n o v i r u s e s,H A d V)属于腺病毒科(A d e n o v i r i d a e),根据免疫学、生物学、生物化学特性不同,将其分为A～G7个亚种,共有52个血清型[2],不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30870681) 收稿日期:2010-06-27;修回日期:2010-07-12 作者简介:陈娜娜(1986-),女,河北邢台人,硕士研究生。E-m a i l:c h e n n a n a20080@163.c o m 通信作者:郑丛龙,教授。E-m a i l:z c l9812@y a h o o.c o m.c n
氨基酸转运载体的研究 摘要:氨基酸转运载体是介导氨基酸跨膜转运的膜蛋白,在氨基酸营养机体细胞和神经调节过程中起着重要作用;而且,其功能异常会导致严重的氨基酸吸收和代谢障碍性疾病,也具有重要的病理学意义。本文就近年来关于中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸转运载体家族成员及其组织分布、分子生物学特征、生理功能和病理学意义等研究进展进行了综述。 关键词:氨基酸转运载体;中性氨基酸;酸性氨基酸;碱性氨基酸 早在20世纪60年代,人们就开始通过制备膜泡和培养艾氏(Ｅｈｒｌｉｃｈ)腹水瘤细胞、红细胞等手段陆续发现了Ａ型、Ｌ型和β型等多种氨基酸转运载体[1]。虽然大多数氨基酸转运系统尚未在分子水平上阐明,但是通过克隆编码特定转运载体蛋白的ｃＤＮＡ,极大地加深了人们对氨基酸转运载体生理功能和病理学意义的了解。研究表明,氨基酸转运载体既是氨基酸作为营养素从机体胞外进入胞内的通道,也是氨基酸进出胞内完成神经细胞兴奋、抑制等重要细胞功能的通道。氨基酸转运载体也与胱氨酸尿症、范科尼(Ｆａｎｃｏｎｉ)综合症、哈氏遗传性疾病(Ｈａｒｔｎｕｐｄｉｓｏｒｄｅｒ)和家族性肾原性亚甘氨酸尿症等氨基酸吸收障碍病密切相关[2,3]。ｃＤＮＡ克隆技术是研究和认识氨基酸转运系统的有效手段,最初用于研究哺乳动物Ｎａ+依赖性高亲和性谷氨酸转运系统,即Ｘ-ＡＧ型酸性氨基酸转运载体[4],并基于与谷氨酸转运蛋白序列相似性,发现了转运丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的Ｎａ+依赖性转运蛋白,即ＡＳＣ型中性氨基酸转运载体[5]。最终,发现了中性和酸性氨基酸转运载体家族。迄今,已经形成了庞大的中性、酸性和碱性氨基酸转运载体家族。以下就各转运载体系统的研究进展做一综述 1 氨基酸转运载体系统分类 氨基酸转运载体系统一般以其底物分为中性酸性和碱性氨基酸转运载体系统,或者以对Ｎａ+的依赖性分为Ｎａ+依赖性和Ｎａ+非依赖性转运系统(见表1)[3,6]。Ｎａ+依赖性转运系统利用质膜上以Ｎａ+电化学势梯度形式储存的自由能逆浓度梯度从胞外转运氨基酸底物进入胞内,因此,这些转运载体具有强大的动力从胞外转运氨基酸至胞内[3]。Ｎａ+依赖性氨基酸转运系统包括Ａ型、Ａ
紫杉醇载体的研究进展 （20150932140 张焕乐） 摘要：紫杉醇作为一种抗肿瘤的化疗药物，在卵巢癌、乳腺癌等方面有良好的治疗作用，但其水溶性差，毒副作用大，临床使用受到限制。本文通过查阅文献，总结了一些紫杉醇脂质纳米粒、脂质体、微球、自微乳、胶束、凝胶等载体的新剂型，这些新剂型的研究为今后的临床应用提供了依据。 关键词：紫杉醇脂质纳米粒脂质体微球 紫杉醇（paclitaxel，PTX）是红豆杉属植物中提取的一种具有抗癌活性的二萜类化合物。能抑制微管蛋白解聚，保持其稳定，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂，最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。基于紫杉醇对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的活性，人们开始将紫杉醇应用于抗肿瘤治疗的研究，并于1992年获得批准上市。目前，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈部癌症以及难治愈的前列腺癌等的都有良好的治疗作用[1,2]。 紫杉醇药代动力学非线性，在整个6h或24h滴注过程中血药浓度增加，输液一旦停止，血药浓度即开始下降；紫杉醇会出现严重的急性过敏反应，少量病人出现明显的心血管不良反应，包括心肌梗塞、房颤、轻度充血性心衰、室性和室上性心动过速、室性心律不齐等，此外几乎所有病人全部脱发，1.4%-30%的病人发生3或4级粘膜炎，最主要的是轻度恶心、呕吐和局部静脉炎(4%-64%)。年龄、以往的治疗或接受紫杉醇的总累积剂量似乎对该药的耐受性无影响[3]。 随着近年药物代谢动力学的发展，人们通过将紫杉醇依附于脂质纳米粒、脂质体、微球、自微乳、胶束、凝胶、水溶性前体药物、混悬剂、纳米晶等载体制备成新的剂型，研究紫杉醇在体内代谢的情况，取得良好效果。现就依据近几年的文献报道，将部分紫衫醇载体的研究情况总结如下。 1.紫衫醇脂质纳米粒 纳米粒是一种粒径在10 ～1000 nm 的固态胶体颗粒，包括纳米囊、纳米球、纳米脂质体、纳米胶束、纳米乳、纳米凝胶等多种类型。具有物理稳定性好、粒径小、被动靶向等诸多优点，可改变药物在体内的药动学特征，增加药物在靶器官的分布，利于药物吸收和提高生物利用度，从而提高疗效、减轻毒副作用。 由美国生物科学公司研制的新型紫杉醇制剂ABI-007（Abraxane，Capxol），以人血白蛋白作为共聚物形成紫杉醇白蛋白纳米悬浮液。ABI-007 将紫杉醇和人血白蛋白经高压振动技术制成纳米微粒紫杉醇冻干粉剂，由于无助溶剂Cremophor EL，滴注时间缩短，用药前不需要考虑做预防过敏反应的预处理治疗[4]。脂质纳米粒作为抗癌药物载体，能增加与肿瘤组织的亲和性，增加药物被肿瘤细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效和降低不良反应。刘丹等[5]利用体外释放度实验研究紫杉醇脂质纳米粒溶液与市售普通紫杉醇注射液释放速度，结果脂质纳米粒溶液明显降低，且在初始突释阶段（0.5h内）的释放量比普通制剂高。 2.紫杉醇脂质体 脂质体是利用磷脂将药物包裹，从而实现药物的缓慢释放，降低药物毒性，提高细胞亲和性和靶向性的目的。根据功能、靶向的手段等不同，脂质体也衍生出很多不同的类型，如长循环脂质体、p H 敏感脂质体、免疫脂质体、磁靶向脂质体等，不断向多功能化和精细靶向方向发展。紫杉醇多是由于靶向性不强，导致药物在正常组织的蓄积，从而对正常细胞产生损害。因此，提高药物对肿瘤细胞的靶向性，能够降低紫杉醇的毒性作用。崔红丽等[6]的临床结果表明，紫杉醇脂质体与紫杉醇治疗效果相当，但前者相关毒性及某些过敏反应的
葡萄糖与氨基酸的跨膜转运机制 物质的跨膜运输是高考的一个高频考点，统计发现：近5年在新课标全国卷中出现的频率为0.8，刚好最近正在指导学生的“物质跨膜方式”的相关复习，感觉学生对这方面的理解没有一个很好的逻辑，判断跨膜输运方式纯粹靠背诵记忆，非常机械，不能站在生命系统的范围去理解，缺乏生命观念和科学思维。为了让学生在复习后对跨膜运输有个清晰的认识和理解，彻底突破瓶颈，备课时我特意查阅了一些知网上的文献。先说一下我的总体思路： 生物膜的成分——生物膜的结构（流动镶嵌模型）——物质的跨膜运输。 一、举例分析： ①氧气、二氧化碳、氮气、水、乙醇（共性：比磷脂分子的缝隙小，自由穿过） ②苯、甘油（共性：脂溶性，与磷脂互溶，也自由穿过） ③氨基酸、葡萄糖、核苷酸（较大（比缝隙大）：需借助蛋白质） ④钠离子、钾离子（离子很小，但溶液中水合离子较大（比缝隙大）：需借助蛋白质） ⑤大分子物质（大过膜蛋白：需借助囊泡） 二、归纳： 1.很小的分子和脂溶性物质：自由扩散。比如①② 2.不大不小的：借助蛋白质（载体蛋白和通道蛋白），比如③④ 3.很大很大的：借助囊泡（胞吞和胞吐），比如⑤ 提示：水分子跨膜运输的方式：自由扩散和水通道蛋白介导的协助扩散（做题时，如题干没有信息提示，一般认为水分子跨膜运输的方式是自由扩散）。 三、摆事实（资料） 小肠上皮细胞靠近肠腔一端的细胞膜呈“刷”状，这大大增加了细胞膜的表面积，有人经过计算，发现小肠的吸收面积如果全部展开，足有400平方米之大。这么大的吸收面积，足以导致食物分解后在局部形成的葡萄糖浓度比小肠上皮细胞中的要低。还有肾小管上皮细胞对葡萄糖的重吸收也是如此。（方式：主动运输） 由于主动运输的原因，小肠上皮细胞的葡萄糖浓度明显大于组织液中的葡萄糖浓
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
紫杉醇及其类似物的研究进展 摘要：紫杉醇(Taxol)是近40年从红豆杉属植物中发现的最著名的天然抗肿瘤药物，在过去30年多年间紫杉醇因其独特的结构、新颖的作用机制和显著的抗癌活性成为化学家、药理学家和生物学家的研究热点。本文对紫杉醇及其类似物的基本结构、作用机理、开发利用以及合成方法方面进行了总结。 关键词：紫杉醇作用制剂合成 正文：紫杉醇是一种从红豆杉属植物中提取的四环二萜化合物（结构式如图1所示）。美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）于1963 年首次从一种生长在美国西部的名为太平洋杉（Pacific Yew）的树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。直至1979年分子药理学家Dr. Horw itz 阐明了紫杉醇的独特作用机制：紫杉醇能与微管蛋白结合，并促进其聚合，抑制癌细胞的有丝分裂，有效阻止癌细胞的增殖。 图-1 紫杉醇的抗肿瘤作用机制 1 阻滞肿瘤细胞有丝分裂 微管是真核细胞的一种组成成分，它由两条类似的多肽为单位构成的微管蛋白二聚体形成。微管具有构成细胞网状支架，维持细胞形态，参与细胞运动，参加细胞器的位移及胞内物质运输等功能，尤为重要的是染色体的分裂和位移，均需在微管的帮助下进行。正常情况下，微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体存在动态平衡。紫杉醇可使二者之间失去动态平衡,导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，使癌细胞停止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗癌作用。 2 诱导细胞凋亡 Fas /Fasl信号传导系统是细胞凋亡信号传导的重要途径之一。用Fasl抗体可以抑制紫杉醇诱导的凋亡, 表明紫杉醇诱导细胞凋亡与Fas/Fasl相关。实验中发现, 紫杉醇作用于人肉瘤细胞Saos-2后Fas的表达持续升高, Fasl的表达也增高了3倍。 Bcl-2家族中一些成员促进凋亡，如Bax基因；另一些则阻碍凋亡，如Bcl-2基因。有研究表明紫杉醇诱导MCF-7细胞凋亡，使Bcl-2降低、Bax增加，同时Bcl-2/Bax的比率亦随时间延长及剂量的增加而逐渐下降，呈现出明显的时间及剂量依赖性。
紫杉醇的研究进展 1.概述 紫杉醇是从紫杉(Taxus brevifolia)树皮中所提得，是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物。1971年由Wani 等首先从短叶红豆杉中提取分离出来。于1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物。已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。它的作用方式和药理及临床特性均具有独特之处,被称癌症化疗上的新突破。 紫杉醇，英文名称Paclitaxel，别名泰素，紫素，特素，化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量853.92，分子式C47H51NO14。熔点为213~216℃。紫杉醇具有高度亲脂性,不溶于水,血浆蛋白结合率89%~98%,终末半衰期平均值为 5.3~l7.4h, 主要经肝脏代谢,肾脏清除仅5%。[1] 结构式如下： 2紫杉醇的药用植物资源及药源植物中有效含量研究 红豆杉为红豆杉科植物,也称紫杉,全世界约有11种,主要分布于北半球,我国有4种1变种,主要分布于甘肃、陕西、安徽、湖北、湖南、广西、贵州、四川、云南等省区[2-3]。研究表明[4],植物中紫杉醇含量在万分之二以下,极其低微。短叶红豆杉树皮中紫杉醇含量最高,其次为中间红豆杉树皮;东亚产四种红豆杉中,云南红豆杉枝叶中紫杉醇含量最高东北红豆杉和美丽红豆杉次之,短叶醇含量则
生物制药与研究 2018·01 168 Chenmical Intermediate 当代化工研究 天然药物紫杉醇的研究进展 ＊王俊松 （大连市第十一中学 辽宁 116031） 摘要：紫杉醇作为天然植物化学抗癌药物，被称为“晚期癌症的最后一道防线”。目前紫杉醇的研究合成工作已经取得较大进展，生物 合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等现代生物技术手段逐渐进入大众的视野。它复杂的化学结构，显著的生物活性，独特的作用机理，匮乏的自然资源等受到了各个研究行业的普遍关注。关键词：紫杉醇；天然药物；抗癌 中图分类号：R 文献标识码：A Research Progress of Natural Medicine Paclitaxel Wang Junsong (No.11 Middle School of Dalian City, Liaoning, 116031) Abstract ：As a natural phytochemical anticancer drug, paclitaxel is called as "the last line of defense for advanced cancer". At present, paclitaxel research and synthesis work has made great progress. Biosynthesis, fungal fermentation, plant tissue cell culture and other modern biological technology have gradually entered the public field of vision. Its complex chemical structure, remarkable biological activity, unique mechanism of action, scarce natural resources have been widely concerned by various research industries. Key words ：paclitaxel ；natural medicine ；anticancer 1.紫杉醇的结构特点 紫杉醇（taxol），又称作红豆杉醇，泰素，紫素，特素，是从红豆杉的树皮、树根和枝叶中提取出的一种化合物，是第一个获得FDA批准的第一个天然植物化学药物，被认为是已发现的功效最显著的天然抗癌药物。 紫杉醇为白色结晶性粉末，具有高度的亲脂性，不溶于水，易溶于甲醇、丙酮等有机溶剂。如图1所示，紫杉醇的分子式为C 47H 51NO 14，基本骨架为三环二萜，有11个手性中 心、高度官能团化的6-8-6-4四环结构和一个异丝氨酸侧链。 图1 紫杉醇分子结构式 目前，从植物中提取的抗肿瘤要素有4种：紫杉醇、长春花碱、喜树碱和秋水仙素。后三者在抗癌作用机制中，主要是起到了阻止微管聚集的作用，而紫杉醇却恰恰相反，它能够加速微管蛋白合成微管的过程，并会结合到微管上起稳定和防止微管解聚的作用。因此，紫杉醇的抗癌活性主要表现在两个方面：紫杉醇可以迅速“冻结”癌细胞中有丝分裂的纺锤体。从而使肿瘤细胞停止无限分裂；另外，紫杉醇会促使巨噬细胞释放能够杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞迁移的有效因子。临床研究表明，紫杉醇作为抗癌药物治疗卵巢癌，其有效率可以达到36%；治疗乳腺癌，其有效率甚至高达65%。因此有人认为紫杉醇的第一适应症是转移性卵巢癌,而第二适应症是难治性的转移性乳腺癌。 2.紫杉醇的获取方法 天然紫杉醇主要是从新鲜的红豆杉树皮中提取，然而红豆杉的数量很少，生长极其缓慢，且不易繁殖。30吨的树皮中大概只能获得100g的紫杉醇，因此自然获取紫杉醇不仅会破坏野生资源和生态环境，还会耗费非常多的人力物力财力。为了解决这一难题，科学家们作出了巨大的努力，目前已经探索出化学全合成法、化学半合成法、植物细胞培养、内生菌培养以及生物合成等多种方法来获取紫杉醇。 目前，从植物中直接提取依旧是获取紫杉醇的主要方式。目前主要通过有机溶剂萃取法、固相萃取法和超临界流体萃取法来进行提取分离。有机溶剂萃取法主要是采取乙醇、甲醇或二氯甲烷等溶剂来进行萃取，提取效率较高，方法较简单，能耗也比较少。近几年来，超临界流体萃取技术逐渐兴起，它可以快速地从树皮中提取出紫杉醇，收率较为理想。但由于天然紫杉醇面临着资源不足的困境，目前各国科学家都投入到紫杉醇的合成研究中。 3.化学合成法 (1)化学全合成法 从紫杉醇的结构式我们可以得知，紫杉醇具有高度官能团化的6-8-6骨架结构、众多的手性中心和复杂的含氧取代基。因此，关于它的有机全合成，一度被认为是有机化学全合成领域最有难度的挑战之一，但依旧有众多的科学家致力于它的全合成。合成过程通常主要分为三个部分：合成紫杉烷环母核的骨架结构，接下来对骨架结构进行修饰，进行官能团反应，最后在官能团化后的结构上引入苯基异丝氨酸侧链。 全世界一共约有30多个科研项目组先后投身其中，经过 20多年的努力，美国的R.A.Holton教授课题组和K.C.Nico laou教授课题组在1994年同时完成了紫杉醇的全合成工作。之后，陆陆续续有新的合成路线被报道。截至目前，一共有6条全合成路线。虽然目前紫杉醇的全合成依旧由于产率低