HuH-7 人肝癌细胞
Catalogue No.: C165
Product Format: a T25 flask
Culture Properties：贴壁
Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Application:Cells and cancer research
NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY.
Components
Operation steps for cell culture
1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞；
2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶
浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化；
（细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。）
3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀；
4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基
重悬37度培养箱继续培养；
传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。
Cell cryopreservation
1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择）
2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
Tips：
1.细胞经过运输后，部分细胞由于温度变化及剧烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正常现
象。贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。加5ml PBS重悬细胞，再900-1000rpm(约150g)离心3min，用新鲜的完全培养基重悬接种到新的培养瓶。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS 多洗几次。
2.细胞生长不均时，可以将细胞消化吹散后加入新的培养基重新接种或传代。
3.细胞生长缓慢时，可以选择提高血清浓度培养（最高不超过20%），也可以根据细
胞生长状态，选择传代细胞到新的培养瓶中继续培养。
4.不同细胞贴壁性差异比较大，所以消化时间差别较大，20s-10min均有可能，具体
以细胞消化到相互分离但未脱落，并可以轻轻吹下为准，严禁消化到细胞完全漂浮。
客户消化过度导致细胞死亡、漂浮、生长缓慢，不提供免费售后服务。
5.干冰发货均为两支，客户先复苏一支，若复苏失败及时联系我方并在我方指导下复
苏第二支。若客户同时复苏两支均状态不佳，我方不提供免费售后服务。
6.细胞状态正常时，应尽快冻存细胞保种，冻存后应随机抽取一支检测冻存效果。我
方不对客户冻存细胞导致死亡负责，客户冻存细胞死亡不提供免费售后服务。Notice：
客户收到细胞有任何疑问请及时致电我们，细胞收到后1周内没有任何电话，或其他形式回访，默认为细胞质量没问题，之后出了任何问题不给予免费售后。细胞免费售后只提供一次，若重发后再次培养死亡不再免费补发，细胞收货时已经死亡或密度不足的除外。
HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
慢性乙型病毒性肝炎与原发性肝癌的关系 原发性肝癌为肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿,为我国常见的恶性肿瘤之一。病因有黄曲霉菌,酒精性、病毒性肝炎等,其中最常见为病毒性肝炎,尤为乙型病毒(HBV)感染与肝癌的关系密切，HBV感染是原发性肝癌的首要病因。国外资料表明,原发性肝癌的发生与HBV 在染色体上的整合及整合后染色体的重排有关[1]。HBV在染色体上的整合是随机的,整合于染色体上的HBV - DNA是不完整的,病毒基因组多有一定程度的缺失。HBV - DNA整合后引起肝癌的机制目前尚无定论。HBV - DNA整合后通过激活癌基因或导致抑癌基因失活而引起细胞癌变,通过整合基因片段研究封闭HBV X或Pre - s基因对阻断HBV后肝癌发生尤为重要[2]。 1 ItBV感染与HCC发生的流行病学研究 几项流行病学研究表明，在全球范围内，除了极少例外。慢性HBV感染区与HCC发生区有极大的相似之处[1I ，在低HBV感染的区域HCC的发病率也比较低[3]。还有另外一个证据支持HBV感染与HCC发生之间有密切的关系。那就是80％HCC患者都伴有HBV 的感染，无论这些患者是否生活在高HBV感染的地区，在他们的血液中检测到了HBsAg 和抗一HBc阳性。此现象说明HBV感染与HCC发生之间存在密切的关系[4]。病毒性肝炎是一种世界性的传染性疾病。我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区．大约有60％左右的人群感染过HBV．其中10％的人群为HBV表面抗原(HBsAg)携带者(达1．2亿)，l 200万为慢性肝炎患者。每年有80～100万人患急性肝炎；更为重要的是我国每年有30万人死于与乙肝有关的肝癌及肝硬化[5]。我国肝细胞癌患者的HBV感染指标阳性率很高．近年来呈上升趋势，在我国有70％～90％的PHC病人HBsAg（+），其中约1／3可以PCR 白血清中检出HBV—DNA，提示仍有低水平病毒复制。乙型肝炎病毒与原发性肝癌的相关性可表现在如下几个方面：①原发性肝癌与HBsAg携带者的发生率相平衡；②原发性肝癌患者血液中常有HBV感染抗原抗体之一种和数种，其中以HBsAg与抗一HBc双阳性最为常见．近年发现抗一Hbe阳性亦多见；③原发性肝癌的家族聚集现象亦见于HBV感染聚集的家庭；④HBsAg阳性的原发性肝癌，其癌旁组织的细胞内亦可检出HBsAg；⑤组织培养的人肝癌细胞可分泌HBsAg和AFP；⑥肝癌患者的癌细胞内有HBV—DNA整合。目前，诊断乙型肝炎最常用的指标是HBV血清标志物(俗称“两对半”)，其组合模式多种多样，各项指标不同阳性与HBV复制及疾病不同阶段有关[6]。本文研究资料显示原发性肝癌患者的乙肝病毒标志物阳性率高达98．6％，表明本地区原发性肝癌患者的发生与乙肝病毒感染密切相关，与近期文献报道相似，近年有研究证明感染乙肝病毒的危险度是对照组的1 1．61倍，这说明乙肝病毒感染是肝癌发生的主要危险因素，HBV是部分双链的DNA 病毒，含有S、c、P、x。肝细胞癌患者AFP升高与HBV感染关系密切[7]。肝细胞癌标本进行免疫组化测定,结果显示肝癌细胞中,存在HBsAg、AFP,两者都主要存在于细胞浆中,提示AFP产生与HBV感染直接相关。提示AFP产生与HBV复制无直接关系,可能与HBV - DNA整合有关[8] , HBV - DNA与肝细胞DNA的整合可引起肝细胞遗传特性异常,推测肝细胞遗传特性的改变可能会引起AFP调控基因的改变,在其他因素如肝细胞炎症、坏死等影响下,带有AFP调控基因改变的肝细胞再生,AFP合成再次活跃,从而合成大量AFP。慢性乙型肝炎发生HBeAg 自发血清学转换的确切机制目前仍不清楚, 乙型肝炎病毒前C 区变异可发生在HBeAg 自发血清学转换之前、之中或之后, 但前C 区的变异不是HBeAg 自发血清学转换的必须条件[2]。在乙型肝炎病毒慢性感染的自然病程中, 3岁以前较少出现HBeAg 自发血清学转换, 每年仅有2% ; 3 岁以后, 这种自发转换率逐渐增加到每年
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/2d3654345.html, Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达 作者：刘鼎刘建生 来源：《中国当代医药》2015年第16期 [摘要] 目的检测Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达情况，初步研究Rab27A与Rab27B表达对肝癌细胞生物学特性的影响。方法采用RT-PCR及Western blot技术，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达。结果 Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中存在差异性表达。Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差异。结论 Rab27A与Rab27B与原发性肝癌密切相关，可以为临床采取合理诊断措施提供有效的参考依据。 [关键词] Rab27A；Rab27B；肝细胞癌；RT-PCR；Western blot [中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04 Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma LIU Ding LIU Jian-sheng▲ The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China [Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis. [Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的侵袭性和转移性，出现典型症状时，往往已经为晚期。目前与HCC进展相关的因子包括癌
肝癌与肝硬化的关系 肝癌伴发肝硬化据各地的报告从60-80%不等，差别悬殊，其原因有二： (1)各作者所收集的肝癌类型不尽相同，有些作者将肝细胞肝癌和胆管细胞癌放在一起进行统计，我们知道胆管细胞癌很少伴发肝硬锡故将两者混在一起进行统计，必将降低全组的肝硬化伴发率，如单纯以肝细胞肝澎来进行统计可发现各地肝硬化的伴发率都较接近，多在80%以上； (2)各作者采用的肝硬化诊断标准不一，也是造成统计数字差异的另一因素。在各类肝硬化中以大结节性肝硬化(包括坏死后性肝硬化、肝炎肝硬化或混合性肝硬化)最常伴发肝癌，约占40-60%，而小结节性肝硬化较少，仅占10%左右。在肝癌的高、低发区中常见的肝硬化类型有显著的差别，如东南亚地区以大结节性肝硬化为多见，而欧美地区以小结节性肝硬化为多。日本Shikata和北美Gall对肝硬化的统计具有一定的代表性见下表。 鉴于大结节性肝硬化具有更大的癌变危险性，因而非洲和东南亚地区肝细胞肝癌的发病率较欧美为高是有其病理基础的。
大结节性肝硬化与病毒性肝炎的关系较为密切。据国内某肝癌高发区的调查发现68例肝癌中有77.9%件发肝炎肝硬化，其中98.2%同时有典型的慢性活动性肝炎病变，血清HBAg检出率达64%，至于癌周肝细胞内HBsAg阳性率在我们的56例肝癌中达74.1%，这些结果反映肝癌常伴发的肝硬化与乙型肝炎有密切的关系，其中不少是直接从慢性活动性肝炎发展而来的。Blumberg对84例肝硬化病例进行随访，发现其中有些发展为肝癌，其发生率与HBsAg有关，84例肝硬化中有24例为HBsAg阳性，其中6例(2800)发展成肝癌，而抗-HBs阳性的17例中无一例演变为肝癌，HBsAg和抗-HBs两者都是阳性的14例中仅1例发生癌变。 以上随访结果表明HBAg阳性的肝炎后肝硬化容易发展为肝癌，在肝硬化形成的过程中肝细胞反复遭受损害，发生增 生和间变，显然为肝癌的发生提供了基础。 除了肝硬化之外，不少作者均注意到肝癌也常伴发肝纤维化，Shikata等报告17例肝癌伴有肝纤维化，其中10例呈阳性地衣红染色，显然不少肝纤维化是从乙型肝炎发展而来，在这些病例中肝癌与肝炎的关系除了偶然巧合外，也可 考虑是同一病因所致的两种不同的病变。
综述：肝细胞性肝癌 原发性肝癌以肝细胞性肝癌（HCC）为主。在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在发病率方面排名第六。根据世界卫生组织的年度预测，估计2030年将有100多万患者死于肝癌。 在美国，从2000年到2016年，肝癌的死亡率增加了43%（从7.2人/10万人上升到10.3人/10万人），而5年生存率为18%，肝癌已成为仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。大部分的HCC发生在有基础肝脏疾病的患者当中，主要是HBV或HCV感染或酒精滥用。 普遍接种HBV疫苗和广泛应用针对HCV的直接作用抗病毒药物可能将改变HCC的病因谱。而非酒精性脂肪肝（NAFLD）、代谢综合征和肥胖患者的增加放大了肝癌的发生风险，在西方国家，NAFLD将很快成为肝癌的主要病因。 针对晚期肝癌患者的系统疗法发展迅速，在过去2年，有4种新药在3期临床试验中显示出了临床疗效。本文将主要论述HCC的主要遗传学改变、风险因素、监测和诊断，以及循证治疗方法。 一、发病机制 慢性肝病患者存在持续性肝脏炎症、肝纤维化和肝细胞异常再生。这些异常的生理过程可导致肝硬化，并导致一系列遗传学和表观遗传学事件，最终导致异常增生结节（真正的肿瘤癌前病变）的形成。额外的分子改变能使异常增生细胞获得增殖、侵袭性和生存优势，并完成到成熟HCC的转变（图1）。HCC也可发生于不存在肝硬化或明显炎症的慢性肝病患者（如HBV感染患者）。 图1HCC的主要遗传学改变及分子分型 图中描述了人HCC发生过程中关键的分子和组织学改变，以及HCC两个分子亚型的主要遗
传和临床特征。*表示高水平的DNA扩增。在非增生型中，CTNNB1突变增强了免疫排斥。 二、风险因素 没有基础肝病的患者很少罹患HCC，男性的HCC发病率是女性的两倍。任何原因的肝硬化都会增加HCC的发生风险。 这种风险因病因、地理区域、性别、年龄和肝损伤程度而异。 在世界范围内，HBV感染是HCC的主要病因。尽管乙肝疫苗的广泛接种降低了HCC的发病率，但仍有许多未接种疫苗的人感染HBV（2015年为2.57亿人），有罹患HCC的风险。饮食中接触黄曲霉毒素B1可导致249位TP53的特异性突变（R→S），增加HBV感染患者发生HCC的风险。在西方国家和日本，HCC的主要病因是HCV感染。无论潜在的肝纤维化程度如何，HBV感染都有直接的致癌作用，但在HCV感染者中，若不伴有重度肝纤维化，则HCC很少发生。 全世界范围内，NAFLD相关HCC的发病率呈上升趋势。在美国，从2016年到2030年，该发病率预计将增加122%（从5510例增加到12240例）。 酒精性肝硬化是HCC的另一常见病因。 吸烟合并HIV感染也可能导致HCC的发生。抗病毒治疗在降低HCC的发生率方面是有效的，但不能根除这种风险。 与无应答的患者相比，在对干扰素治疗方案有持续病毒学应答的HCV感染患者中，HCC 的风险从6.2%降低到了1.5%。据报道，使用直接作用抗病毒药物治疗的HCV感染患者发生HCC的风险也会降低。 除了肝病的病因治疗外，尚无任何药物可以降低HCC的发生率。 三、HCC的监测 癌症监测旨在早期发现肿瘤，增加治疗机会，提高生存率。然而，尚无高质量的随机对照试验评估HCC监测对肝硬化患者的临床价值。不过，数学模型、低质量的临床试验（在方法学上有局限性）以及meta分析都显示了监测对患者的生存益处。 HCC监测的目标人群是肝硬化患者，且不考虑肝硬化的病因。 由于重度肝功能不全的肝硬化患者不适合接受根治性治疗，所以没有癌症监测的必要。但因肝功能障碍而等待肝移植的患者则需要进行监测，目的是确保肿瘤不会发展到按照既定标准无法进行移植的程度。 一些没有肝硬化的肝病患者也应该被纳为癌症监测目标。慢乙肝患者发生HCC的风险存在地区差异（非洲和亚洲地区的发生风险高于其他地区），且老年、男性、肝纤维化、病毒复制水平高、基因C型以及HCC家族史都提示着更高的HCC发生风险。 虽然无肝硬化的非酒精性肝病患者可能会发生HCC，但实际风险是未知的，且可能非常低。除非有方法可以识别出风险较高的患者，否则不建议对无肝硬化的NAFLD患者进行癌症监测。 HCC的推荐监测方法为：每6个月进行一次腹部超声检查，联合/不联合血清甲胎蛋白水平检测。结果对操作者的依赖性较高，敏感度为47%-84%，特异度＞90%。对肥胖患者，超声检测的实用性会降低。 四、HCC的诊断 在肝硬化患者中，利用影像学技术就可以诊断HCC（图2）。由于肝细胞在恶性转变期间会发生血管转变：良性病灶（如增生性结节）由门静脉系统分支供血，而恶性病灶由肝动脉分支供血。这种转变转化为一种独特的模式：对比增强CT或MRI可显示动脉后期明显强
乙肝与肝癌的关系 文章目录 乙肝与肝癌的关系 1、乙肝与肝癌的关系 肝癌(原发性肝癌)是我国常见的癌症,据普查资料证明,肝癌年死亡率仅次于胃癌和肺癌,居第三位。而肝脏是人体多种重要物质的代谢中心,同时肝脏还有解毒、分泌、排泄等重要功能,一旦肝脏出现癌肿,对人体的健康危害极大。 临床上注意到肝癌患者有急性肝炎—慢性肝炎—肝硬化—肝癌的病史,可见肝炎与肝癌关系极为密切。国内对肝癌的研究中还注意到:肝癌高发区人群中肝炎比例高,肝癌患者中乙型肝炎表面抗原(HbsAg)阳性者显着高于HbsAg阴性者。慢性肝炎还可不经过肝硬变阶段直接导致肝癌的发生。
2、乙肝怎么检查 ALT及胆红素 反复或持续升高,AST常可升高,部分患者r-谷氨酰转肽酶、精氨酸琥珀酸裂解酶(ASAL)、碱性磷酸酶也升高。胆碱酯酶及胆固醇明显减低时提示肝功严重损害。靛青绿留滞试验及餐后2小时血清胆汁酸测定可较灵敏地反映肝脏病变。 中、重度慢性肝炎 患者清蛋白(A)降低,球蛋白(G)增高,A/G比值倒置,γ球蛋白和IgG亦升高。凝血酶原的半寿期短,可及时反应肝损
害的严重程度,凝血因子V、Ⅶ减少。部分患者可出现自身抗体,如抗核抗体、抗平滑肌抗体,抗线粒体抗体,类风湿因子及狼疮细胞等阳性。 3、乙肝的用药原则 用药不宜过多过杂很多药物经过肝脏解毒,用药过多过杂增加肝脏负担,对肝病不利。 根据慢性乙肝病人的具体情况,针对性用药乙型肝炎病毒复制明显的病人用抗病毒药物;有免疫功能紊乱的用调整免疫功能的药物;有肝细胞损伤的用保护肝细胞的药物;有
肝脏微循环障碍的用活跃微循环的药物。中医在我国历史悠久,其精髓在于辩证论治。通过辩证论治,可改善慢性乙肝病人的临床症状,提高他们的体质,增强抗病能力,促进免疫系统清除病毒,促进疾病恢复。 乙肝如何预防 1、阻断血液传播:了解传染途径后,预防传染就要阻断传染途径。像血液传播,平时生活中就要注意下,如果身体部位流血了,要及时处理。尤其是患有乙肝的朋友们更要注意这点,莫要让自己的血液成为了传染源,从而增加亲朋好友感染病毒的概率。 2、阻断母婴传播:母婴传播这种传播途径是比较广的,但也是可以阻断的。患有乙肝的女性朋友们,在怀孕前要咨询医生,医生或根据你的情况给你制定方案,比如什么时候怀孕最好、什么时候打乙肝免疫球蛋白、孩子出生后多久打乙肝疫苗等等。 3、阻断“性”传播:如果夫妻一方有乙肝的话,那么在过“性”生活的时候就要注意最好防护措施,戴避孕套。
一、原发性肝癌 【病理与临床】 原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在消化系统恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食管而居第三位，在部分地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。由于依靠血清甲胎蛋白（AFP）检测结合超声成像对高危人群的监测，使肝癌在亚临床阶段即可作出诊断，早期切除的远期效果尤为显著。加之积极综合治=治疗，使肝癌的五年生存率有了显著提高。原发性肝癌发病年龄多在中年以上，男多于女。原发性肝癌发病隐匿，早期无临床症状，有症状时多已属中晚期，表现为中上腹不适、腹胀、疼痛、食欲缺乏、乏力、消瘦等，其他可有发热、腹泻、黄疸、腹水、出血倾向以及转移至其他脏器而引起的相应症状。 原发性肝癌按组织学类型分为肝细胞、胆管细胞和肝细胞与胆管细胞混合型肝癌三类，其中肝细胞肝癌最多见，占90%以上。按病理形态来分肝癌分为三型： 1、块状型癌结节直径>5cm，其中>10cm者为巨块型，块状型肝癌有膨胀性生长的特点，邻近肝组织和较大的血管、胆管被推移或受压变窄形成假包膜，巨块型肝癌内部多伴出血、坏死。 2、结节型癌结节直径<5cm，可单发或多个，多伴有肝硬化。 3、弥漫型癌结节小，呈弥漫性分布，该型肝癌多伴有明显肝硬化，癌结节与周围肝组织境界不清，易与肝硬化混淆。 另外，将肝内出现单个癌结节且直径<3cm者，或肝内癌结节不超过2个且2个癌结节直径之和<3cm者称作小肝癌。近年来提出将单个肿瘤直径≤2cm肝癌定为微小肝癌。原发性肝癌极易侵犯门静脉分支，癌栓可经门静脉系统形成肝内播散，甚至阻塞门静脉主干引起门静脉高压的表现；经淋巴转移可出现肝门淋巴结肿大，其次为胰周、腹膜后、主动脉旁及锁骨上淋巴结。此外，还可出现膈肌及附近脏器直接蔓延和腹腔种植性转移。 【超声表现】 1、二维超声肝癌结节形态多呈圆形或类圆形，结节内部回声较复杂、大致可分为低回声型、等回声型、混合型，而以低回声型和混合回声型较多见。癌结节内部回声多不均匀，部分肝癌具有周围暗环，有较高的诊断特异性。癌结节后方回声常可呈轻度增强变化，尤其是小肝癌。此外，大部分肝癌具肝硬化背景。不同病理类型肝癌的超声表现也不尽相同，具有各自的特征。
网络出版时间：2014-02-17 09:02 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/2d3654345.html,/kcms/detail/64.1008.R.20140217.0902.004.html 人肝癌细胞株中FOXM1 及NF-κB的表达及意义 王琦1，柴磊2，蒋少青3，马丽4 ，金栋5 ，殷利军5，张桂香5，谢岩青5 （1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川 750004；2.宁夏回族自治区第三人民外科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院药剂科，银川 750004；5.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院血管外/普外科，银川750004）1 [摘要] 目的探讨不同肝癌细胞株中转录因子FOXM1（Forkhead Box M1）及核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa B）的表达强度及意义。方法采用Western blot、RT-PCR法，检测不同肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721）中FOXM1及NF-κ B 在蛋白及mRNA 水平的表达情况。结果在3株肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的表达无论是mRNA水平还是蛋白水平均存在显著差异，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高表达于细胞株SMMC-7721。结论肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达与NF-κB表达趋势一致，提示FOXM的表达可能与NF-κB的活化有关。 [关键词] FOXM1；NF-κB；肝细胞肝癌 [中图分类号]R735.7 [文献标识码]A Expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells WANG Qi1，CHAI Lei2，JIANG Shao-qing 3，MA Li4，JIN Dong5，YIN Li-jun5 ,ZHANG Gui-xiang5，XIE Yan-qing5，（1. Dept.of Hepatobiliarysurgery，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；2. Dept.of Surgical， the Third People′s Hospital of Ningxia. Yinchuan 750004；3. Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；4. Dept.of Pharmacy，the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；5. Dept.of Vascular/General Surgery， the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ.Yinchuan 750004） ABSTRACT Objective（1）To investigate the expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells. Methods The expression of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B protein and micro-RNA in hepatocellular carcinoma cell lines(QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721)were detected with the application of Western blot analysis and RT-PCR analysis，respectively. Results The expression 基金项目：宁夏自然科学基金（项目编号：NZ1236） 作者简介：王琦(1983-),硕士，主任医师，肝癌复发相关分子机制的研究。 通作者：谢岩青，Email：xie-yanqing@https://www.doczj.com/doc/2d3654345.html,
原发性肝癌与炎症关系的研究进展 摘要原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，与炎症密切相关。在我国，肝癌患者中约大多数有慢性乙型病毒性肝炎感染病史；在欧美及日本，肝癌与丙型病毒性肝炎有关。本文总结原发性肝癌与炎症关系的最新研究进展，探讨多种炎症介质对肝癌发生、转移的促进机制，通过阻断相关炎症介质作用，探索出抑制原发性肝癌的发生、发展，减少复发、转移的新治疗途径。 原发性肝癌（primary hepatic carcinoma PHC）是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一，全世界每年新发及死亡病例约占所有恶性肿瘤的5.4%。最新的流行病学调查结果显示，其发病率及死亡率均有上升趋势。原发性肝癌是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤，炎症在肝癌的发生和转移过程中具有促进作用[1][2]。本文就原发性肝癌与炎症关系的研究作一综述。 概述 Rudolph Virchow[3]第一次提出炎症在恶性肿瘤进展中起一定的作用，认为慢性炎症可促进肿瘤的生长；随后Wiemann B[4]证明：通过给患者注射化脓性链球菌和粘质沙雷菌引起的急性炎症可使部分患者的恶性肿瘤退化。目前炎症与肿瘤关系的研究成为热点。 大量流行病学调查提示：炎症是导致肿瘤发生或促进肿瘤发展的最主要因素之一，约20%的恶性肿瘤由炎症诱发或促进[1] [2] [5]。炎症与肿瘤发展的多个环节相关，包括肿瘤细胞形成、进展、逃逸、增生、浸润、血管生成、转移。炎症引起恶性肿瘤的分子和细胞机制尚未完全明确，有研究认为：炎症发生后，炎性细胞在迁入炎症部位的过程中产生大量的活性氧、活性氮物质，而且在慢性炎症过程中，内生抗氧化机制的抑制作用也可以产生超负荷的活性物质，这些活性物质诱导DNA损伤，破坏增生细胞的基因稳定性，最终在炎症和活性物质的反复破坏下，细胞基因改变，包括点突变、基因缺失、基因重组[6]。 在我国，原发性肝癌患者中约1/3有明确的乙型病毒性肝炎病史，欧美及日本，肝癌主要与丙型肝炎病毒感染及酒精性肝病有关。肝癌与肝炎病毒、酒精性肝病的关系，国内外已有大量研究，部分机制已经阐明。研究证实：乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，它可以整合插入宿主基因组，改变宿主体细胞基因的表达，导致宿主细胞基因组的不稳定，易发生基因改变，从而转化为肝癌细胞[7]；丙型肝炎病毒（HCV）为单链RNA病毒，可以和多种细胞蛋白作用，促进肝细胞向肝癌细胞转化[8]；酒精性肝病诱导肝癌形成过程中，酒精产物乙醛可直接损伤肝细胞或乙醇代谢产生的反应性氧化剂和脂质过氧化物直接造成DNA损伤[9]。原发性肝癌通常发生在慢性肝损伤的基础上，包括慢性肝炎、肝硬化，这些被认为是癌前病变。慢性肝损伤引起的炎症反应促进肝硬化的发展，并且激活了肝细胞的再生能力[10]。肝脏的修复机制若被短暂的激活，肝脏的结构和功能可迅速恢复，修复机制的持续激活可促进肝癌的形成和发展，肝炎病毒感染和长期饮酒可激活先天性免疫功能，维持持久的炎症反应，从而促进肝癌的形成和发展[11]。 目前研究已证明，在炎症与癌症的关系中，许多炎症介质具有重要作用。炎症介质产生于炎症反应过程中，也可以由肿瘤细胞产生，其中起关键作用的炎症介质包括环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）、核转录因子—kappaB（NF-kB）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、补体系统。. 原发性肝癌与Cox-2 环氧化酶（cyclooxygenase，Cox）是花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶，又称前列腺素内过氧化物合成酶，是一种完整的膜结合蛋白，至少有三种形式：Cox-1位于内质网，属于结构型基因，多种正常组织
BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌细胞培养过程 器材： 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、 倒置显微镜、超净工作台、一次性吸管若干个、带塞培养瓶（不定个）、试管架、酒精灯、G6型号细菌过滤漏斗、无菌冻存管、液 氮瓶。 试剂： RPMI l640培养液，胎牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，70%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，胎牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 器皿的消毒及准备： 清洗灭菌（浓硫酸、蒸馏水）： （1）浸泡（酸浸）:新使用或重复使用的玻璃器皿须经浓硫酸 溶液浸泡过夜，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷 等物质，并消除其弱碱性。操作过程需戴防护用具。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后 经行烘干。 （3）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器 皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能 残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。 实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消 毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线 照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须 快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应 马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然 后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解 冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培 养液。
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称Hep G2 [HepG2]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS其它因子1%NEAA 传代方法1:4~1：6传代；每周2次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SMMC-7721 [SMMC7721]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS 其它因子无 传代方法1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-） 国内还有，： 小鼠肝癌细胞Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株H22 人肝癌细胞HHCC 人肝癌细胞PLC/PRF/5 人肝癌细胞HB611 人肝癌细胞BEL-7402 人肝癌细胞QGY-7701 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞QGY-7703 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞BEL-7404 人肝癌细胞BEL-7405
肝炎和酗酒是诱发肝癌的主要因素 安普先生 据世界卫生组织统计，在世界范围内肝癌死亡率列第五位。我国普查每十万人口中有15~46人罹患肝癌。在我国，原发性肝癌更为常见，每年新发患者40万人以上，死亡人数超过37万。“原发性肝癌恶性程度如此之高，但大多数患者在就诊时已处于中晚期，丧失了最佳治疗时机，因此对于肝癌的预防和早期检查就显得相当重要。” 两千多年前，我国的《黄帝内经》就提出“上医治未病，中医治欲病，下医治已病”，而对于肝癌三级预防中的一级预防就是预防各种肝癌易感因素。肿瘤专家认为：“虽然肝癌的病因尚未完全清楚，但已经证实与肝炎病毒感染、长期大量饮酒、环境以及饮食因素密切相关。”因此，肝癌的预防就要从规避这些高危因素做起。 1控制乙肝病毒感染 流行病结果显示，乙肝感染率高的地区也是肝癌高发地区，如东南沿海地区，其中乙肝病毒与肝癌关系更为密切。人感染乙肝病毒之后，病毒在体内复制、活跃，对肝脏造成损害。长期的这种损害导致肝硬化，进而引发肝癌。 预防乙肝，在某种程度上说也预防了肝癌发生；对于已感染乙肝病毒且处于慢性肝炎者，采用恰当的抗病毒治疗，可减少肝癌的发生。
2戒酒或者限量饮酒 长期酗酒也会导致肝癌。因为酒中的乙醇需要通过肝脏来完成体内代谢过程。而乙醇代谢的中间产物乙醛对肝脏细胞有直接性毒害作用。同时乙醇的代谢还会干扰脂肪代谢、激素代谢等体内多种物质的代谢过程。乙醇代谢不仅破坏肝脏细胞，造成肝脏损害；还会加重肝脏解毒和代谢的负担，导致肝细胞脂肪病变，进而发展成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。最后发展成肝癌。 3健康饮食 长期食用霉变、含亚硝胺食物，卫生条件差等也是促发肝癌的重要因素。多种研究均表明，黄曲霉毒素是最强的化学致癌物，在诱发肝癌的能力上，它比已知的二甲基亚硝胺致癌性强约75倍。其中黄曲霉素B致癌性最强，而其中的黄曲霉毒素B1又和肝癌密切相关。 安普先生提醒大家，注重饮食健康，尤其是已霉变食物，坚决不碰。少饮酒，坚决不酗酒，浅尝辄止。按时入睡，少熬夜保持充沛的体力，平衡膳食、适当参加体育运动、定期进行身体检查，对肝癌的预防有非常积极的作用。 备注：部分资料摘自凤凰网
第六章原发性肝癌 【概述】 据统计，原发性肝癌是城市人口恶性肿瘤死亡的第二位，其死亡率在一些城市为 19.65 / 10 万，在农村为人口恶性肿瘤死亡的第一位，其死亡率在一些农村为22。 65 / 10 万。 我国原发性肝癌的病因主要有乙型肝炎病毒（HBV ）、黄曲霉毒素、饮水污染（藻类毒素等）、丙型肝炎病毒（HCV ）、某些微量元素（如硒）缺乏、酒精性肝硬化和遗 传因素、HBV 和黄曲霉毒素协同作用等。 我国肝癌病理协作组提出将原发性肝癌分为：①块状型：单块状、融合块状、多块状；②结节型；单结节、融合结节、多结节；③小癌型；④弥漫型。原发性肝癌组织学分型为：①肝细胞性肝癌；②胆管细胞性肝癌；③混合型肝癌。纤维板层型肝癌（fibrolamellar carcinoma of liver ）是肝细胞性肝癌的特殊组织学亚型。 高危人群的健康普查（应用AFP 检测和B 超）是发现小肝癌和亚临床肝癌的重要方法。 【临床表现】 1.症状肝癌无明显的早期临床表现，肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦、腹部肿块等多为肝癌常见的中晚期症状。长时间的发热，上腹部肿块；右上腹突然剧痛而未能证实为胆囊炎、胆结石者；右肩痛按关节炎治疗无效者及不明原因的腹泻等等，应该引起注意。 对高危人群，即乙肝病毒携带者、慢性肝炎和肝硬化者,40岁以上的男性，应及时检测AFP、超声显像、CT等。有条件者应半年左右重复一次。 2.体征 (1)肝肿大：90％以上有肝肿大，质地坚硬，表面及边缘不规则，可触及大小不等的结节或巨块，大多伴有明显压痛，右上部肝癌常可致肝上界上移。左叶肝癌常在剑突下们及肿块。小肝癌常无明显体征。 (2)黄疽：由于肝细胞损害或由于癌块压迫或侵犯胆总管所致。一旦出现黄疽，表明病情已属晚期。 (3)腹水：门静脉主干癌栓引起，因肝癌结节破裂引起的常是血性腹水。在腹水较多时或右上肝癌浸润横隔时可出现右侧胸水。 3.分期肝癌的临床分期按1977年国内制定的分期标准简单明了，易于执行。，－ Ⅰ期：无明显肝癌症状和体征。 Ⅱ期：超过工期标准而无Ⅲ期证据。 Ⅲ期：有明显的恶病质、黄疽、腹水或远处转移者。 国际抗癌联盟(UICC)1997年第5版原发性肝癌TNM分期如下：T1单个结节≤2 cm，无血管侵犯 T2单个≤2 cm，侵犯血管；或多个，局限一叶＜2cm,未侵犯血管；或单个＞2cm，未侵犯血管
*国家自然科学基金资助项目（编号：8106016），广西科学基金资助项目（编号：2010GXNSFD013048） △通信作者。E －mail ：gwongluo@yahoo．com 肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌 细胞株的筛选 * 蒋日婷，晁耐霞，马平，李金平，罗国容△ 广西医科大学组织胚胎学教研室（南宁530021） 【摘要】目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的 可能作用奠定基础。方法 选择4种人肝癌细胞株（BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721和QGY －7703）及1种成人正常肝细胞株（HL －7702），培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后，采用免疫细胞染色技术和Western blot 的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株。结果 免疫细胞染色显示， GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达。GCF2蛋白在肝癌细胞BEL －7404、HepG2、SMMC －7721和QGY －7703的表达要强于正常肝细胞HL －7702，其中以BEL －7404的表达量最高。通过Western blot 检测，BEL －7404的GCF2相对表达量为0.875?0.134，较其他细胞株高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 BEL －7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高，可以作为下 一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料。 【关键词】肿瘤相关抗原；GCF2；肝癌；蛋白表达 GCF2（GC binding factor 2）是一个转录抑制因子，能 够抑制多个下游基因，比如EGFR 、TNF －α、PDGF －A 链和Igf2等的转录，参与细胞增殖、周期和凋亡等进 程 ［1－6］ 。本课题组前期用SEREX 技术筛选人肝癌组织构建的cDNA 文库，发现2个克隆与GCF2的片段同 源，提示GCF2可能是肝癌相关抗原［7］ 。目前，尚未见文献报道GCF2基因在肝癌中的作用的研究，因此，2010年11月至2011年3月，本实验将采用免疫细胞化学技术检测4种人肝癌细胞和1种成人正常肝细胞中GCF2的表达情况，并且通过Western blot 筛选出GCF2高水平表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用奠定基础。1材料与方法 1．1 材料人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人肝细胞株HL －7702，均购于上海细胞生物学研究所。实验仪器均由广西医科大学基础实验中心提供：CO 2恒温培养箱（Thermo ）、倒置显微镜（OLYMPUS ）、台式高速冷冻离心机（SIGMA ）、紫外分光光度计（UV2000I Tanon ）、电泳仪（北京六一仪器厂）、半干式转膜仪（BIO －RAD ）。细胞培养基高糖DMEM 及RPMI 1640均购于HyClnoe 公司。磷酸缓冲液（PBS ）、 DAB 显色试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。GCF2抗体购自美国Santa 公司。辣根过氧化物酶（HRP ）标记的山羊抗鼠IgG 购自上海长岛生物试 剂有限公司。GAPDH 抗体、ECL 发光试剂购于碧云天生物技术研究所。 1．2 细胞培养 将4种肝癌细胞分别培养在含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培养液中，将成人正常肝细胞 株HL －7702培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培 养液中，并置于37?、 5%CO 2及饱和湿度的恒温培养箱中培养， 隔天更换培养液。1．3细胞爬片的制作及免疫组织化学检测 将生长 状态良好的人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人正常肝细胞株HL －7702接 种于置有圆形盖玻片的12孔培养板内，接种密度为1?104个细胞/孔，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 及RPMI 1640培养液在37?、5%CO 2条件下培养。待细胞长到60% 70%融合时，用0.01mol /L PBS 洗涤1次，加入4%多聚甲醛室温固定15min 。将盖玻片取出，粘贴在载玻片上，按照常规免疫组织化学方法，加 入1?100稀释的GCF2抗体， 4?湿盒内温育过夜。PBS 洗片后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ，室温 下孵育30min ， PBS 洗片后进行DAB 显色2 3min 。常规50% 100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，香柏油 封片，显微镜下观察并拍照记录结果。以PBS 替代一抗作为阴性对照。采用Image －Pro Plus version 6.0软件分析阳性着色光密度。1．4 总蛋白的提取及Western blot 的检测常规细胞培养，当细胞贴壁生长达90%时，按蛋白提取试剂盒 操作方法提取细胞总蛋白， 分装后置于－80?保存。取4个细胞株的蛋白20μg 与1/4体积的5?SDS 上样缓冲液混合，100?沸水浴5min ，冷却后点样进行 SDS －PAGE 电泳分离。电泳完毕，按照半干转移仪公司提供的说明进行印迹操作，将电泳分离蛋白转移到PVDF 膜上。转移膜用含50g /L 脱脂牛奶的PBST （0.01mol /L PBS +0.5%Tween －20）室温封闭5h 。GCF2抗体1?200稀释液4?孵育过夜；按1?5000稀 · 1551·广东医学2012年6月第33卷第11期Guangdong Medical Journal June．2012，Vol．33，No．11