实验五固定化脲酶活力的测定
一、实验原理
固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂
1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器
2、实验四制备的固定化脲酶
3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏
水并定容至100 ml
4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml
5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶
解并定容至100 ml。此溶液含NH3为40 μM
6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，
冷却后加水定容至1000 ml
7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。另
称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐
注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮
于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤
1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100
mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水
浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1
号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
4、20 min后两管同时加入1 ml 1 M H2SO4溶液终止反应。（V1=12 ml）
5、另取3支试管编号（1号、3号与上对应，2号为标准氨溶液），按下表加
入试剂：（V2=0.1 ml）
摇匀后在30 min内，480 nm波长下比色测定吸光度，分别记为A3（样品），A2（标准），A1（空白）。定义脲酶在30℃，中性条件下，每分钟水解底物产生1 μmol氨的酶量，为1个酶活力单位。
四、结果计算
100 mg脲酶所得到固定化酶的总活力（U）：
（A3—A1）×m1×V1×NH3的摩尔数
U= ×100%
（A2—A1）×m2×V2×t
几种尿素酶法检查幽门螺旋杆菌的比较 幽门螺旋杆菌是寄生在胃粘睽|上皮和粘 液之间的革兰氏阴性细菌，是引起慢性胃炎的主要致病因子，井在消化性溃疡的发生和复发过程中起重要的诱发作用，在慢性胃炎患者中，幽门螺旋杆菌的捻出率为s0嘶～ 7O缅：在胃溃疡患者中的检出率为60 ～80 j 而在十二脂肠溃疡患者中拴瑚率可达7o师一100 。我国的胃病发病率很高，白1985年国内首次分离出此菌以来，不少科研和医疗单位相继开展了此项研究。由于幽门螺旋杆菌能产生大量的尿素酶，分解尿素生成氨和 二氧化碳，因而就使试剂的尿素浓度下降，氯浓度升高，导致试剂pH的改变，使试剂变为红色。 根据幽门螺旋杆菌产生尿素酶的特性， 现已发展了多种对胃内尿素酶检查的方法，以检测患者是否有幽门螺旋杆菌的感染，Marsha]l曾研制出尿素琼脂药盒，当将胃粘膜标本故入药盒内，24小时后那可作出患者是否有幽门螺旋杆菌感染的诊断，Hazet!研 制了尿素液，并加在有孔的反应板上，即微滴法，，当放入胃粘膜后l8小时就可观查患者是否有幽门螺旋杆菌的盛染}随后Arvind 又研制了1分钟尿素酶试验法使反应时间 大为缩短．天律医学院流行病学教研室珊制了尿素酶试纸法，此法能在5 min内测出患 者是否有幽门螺旋杆菌的感染． 目前国内外已有多家生产尿素酶试验药 盒，但如何提高该药盒的敏感度，保持特 异性，使其达到准确，使用方便，反应快速可靠、价廉实用、便于运输和存放，延长有效期更适用于临床、仍然是主要研究课题．虽然橙查幽门螺旋菌的方法很多，如檄氧条件下做细菌培养I胃粘膜病理切片}化验血 清中有无幽门螺旋杆菌抗体I用同位素C 拯测法等，但屎素酶法由于简便易行，而优于其它方法。因此，普遍为临床所采用，是诊断幽门螺旋杆菌感染、筛选药物、观查疗效的理想工具。
大豆制品中脲酶活性的测定 定性法： 酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热； 分析天平； 25ml纳式比色管； 恒温水浴锅； 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液； 结晶尿素； 三、方法： 将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。 空白试验：不加尿素，其他同上。 品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
?0-1min变红，活性非常强（＞1.0）； ?1-2min变红，活性大概0.5-1.0； ?2-5min变红，活性大概0.3-0.5。 四、注意事项： 1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定； 2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差； 3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法 一、原理： 酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。 二、仪器和试剂： 表面皿； 0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水； 1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水； 尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色） 三、方法： 将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。如果红斑面积多于20%，则认为该样品脲酶活性超标，为不合格产品。 四、注意事项： 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，最好将其稍微粉碎，亦不
配方1（用于细菌葡萄糖发酵---半固体穿刺培养）： 蛋白胨2g，NaCl5g，K2HPO40.2g，1%溴酚蓝3ml，葡萄糖10g，琼脂8g，水1000ml。115度灭菌20分钟。 小提示：先将蛋白胨和NaCl溶于热水，调pH至7.4（这时总体积接近1000ml），再加入1%溴酚蓝3ml，再加入糖，溶解均匀后分装。 配方2（用于细菌乳糖发酵---半固体穿刺培养）： 蛋白胨2g，NaCl5g，K2HPO40.2g，1%溴酚蓝3ml，乳糖10g，琼脂8g，水1000ml。115度灭菌20分钟。 小提示：先将蛋白胨和NaCl溶于热水，调pH至7.4（这时总体积接近1000ml），再加入1%溴酚蓝3ml，再加入乳糖，溶解均匀后分装。 配方3:MR与VP试验-------请实验员准备 蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，水1000ml，调pH至7.2-7.4左右，115度灭菌20分钟。甲基红试剂（需新配） 40%KOH，-萘酚（需新配） 配方4:柠檬酸盐利用试验步骤（液体-直接观察现象）-------请实验员准备 NaCl5g，MgSO4.7H2O0.2g，磷酸氢二铵1g，K2HPO41g，柠檬酸钠2g，水1000ml，调pH至6.8-7.0左右后加入1%溴酚蓝10ml。
1%溴酚蓝：称取0.08g溴酚蓝溶于0.5ml95%乙醇中，再加水至总体积到10ml。 以上成分加热溶解后，调pH至6.8，然后加入指示剂，摇匀。制成后为黄绿色，分装试管，121度灭菌20分钟。 配方5:淀粉酶实验 0.2%淀粉2g，蛋白胨1g，1.5%琼脂20g，调pH7.0至7.2，水1000ml。 小提示：可先将琼脂放入水中加热，待完全溶解后，加淀粉。混匀后高压灭菌。 检测用卢戈氏碘液 过氧化氢酶试验 过氧化氢溶液 配方6:吲哚试验------- 胰蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml，调pH至7.2-7.4左右，121度灭菌20分钟。 检测用乙醚及吲哚试剂 配方7:H2S试验：柠檬酸铁铵半固体培养基 1000ml蛋白胨10g，氯化钠5g，Na2S2O3.5H2O0.5g，柠檬酸铁铵0.5g，琼脂8g，pH7.2，121度灭菌20分钟。 配方8:明胶液化实验（穿刺培养）-----不做 明胶15g，牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100mL,将明胶加入肉汤中，水浴加热溶解，调pH7.2-7.4，分装试管，115度高压灭菌20min，取出迅速冷却，使其凝固。
一、H、pylｏrｉ根除指征 【陈述1】不管有无症状与并发症，H、pylori胃炎就是一种感染性疾病。证据质量：高;推荐强度:强；共识水平：100%. 【陈述2】根除Ｈ、pyloｒi得获益在不同个体之间存在差异。 证据质量:中;推荐强度:强；共识水平:１00%. 【陈述３】H、pｙlｏｒi“检测与治疗(ｔest and ｔreaｔ)”策略对未经调查消化不良（uninvｅsｔigated dyｓpeｐsｉa)处理就是适当得.这一策略得实施应取决于当地上消化道肿瘤发病率、成本－效益比与患者意愿等因素.它不适用于年龄＞35岁、有报警症状、有胃癌家族史或胃癌高发区患者. 证据质量：中;推荐强度:条件;共识水平:1００%。 【陈述４】H、ｐylorｉ胃炎可在部分患者中引起消化不良症状. 证据质量：高;推荐强度：强；共识水平：10０%。 【陈述5】在做出可靠得功能性消化不良诊断前，必须排除Ｈ、ｐyｌｏri相关消化不良。 证据质量:高;推荐强度:强；共识水平：100%. 【陈述６】H、pyloｒｉ胃炎伴消化不良症状得患者,根除Ｈ、ｐylｏri后可使部分患者得症状获得长期缓解，就是优选选择。 证据质量：中;推荐强度：强;共识水平：１0０%。 【陈述7】H、pｙlori感染就是消化性溃疡主要病因,不管溃疡就是否活动与就是否有并发症史，均应该检测与根除H、pylori。 证据质量：高;推荐强度：强；共识水平:1０0%。 【陈述8】根除Ｈ、pylｏri就是局部阶段胃（MAＬＴ）淋巴瘤得一线治疗。
证据质量：中;推荐强度：强;共识水平:100％。 【陈述9】服用阿司匹林或NSＡID增加H、pylori感染患者发生消化性溃疡风险。 证据质量：高；推荐强度:强；共识水平:100％。 【陈述10】长期服用ＰＰI会使H、pylori胃炎分布发生改变,增加胃体胃炎发生风险，根除H、pylｏri可降低这种风险. 证据质量：中；推荐强度：强;共识水平:100%。 【陈述1１】有证据显示H、pｙlorｉ感染与不明原因得缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜、维生素B１２缺乏症等疾病相关。在这些疾病中，应检测与根除H、ｐｙloｒｉ。 证据质量:低;推荐强度:条件；共识水平:１０0%。 【陈述１２】Ｈ、pylori胃炎可增加或减少胃酸分泌,根除治疗可逆转或部分逆转这些影响. 证据质量：高；推荐强度；强;共识水平：１00％。 【陈述13】H、pｙloｒi与若干胃十二指肠外疾病呈正相关或负相关，但这些相关得因果关系尚未证实。 证据质量：中;推荐强度：条件；共识水平：90、４%. 【陈述14】根除H、ｐｙlｏri可显著改善胃黏膜炎性反应，阻止或延缓胃黏膜萎缩、肠化生发生与发展,部分逆转萎缩，但难以逆转肠化生。 证据质量：中;推荐强度：强；共识水平:100%。
实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法） 一、实验原理 脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。反应式： (NH 2)2CO+ H 2 O 脲酶 2NH 3 + CO 2 氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。反应式： NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤 将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作： 取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1 H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。 三、结果计算 脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂 1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。 2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷
酸盐缓冲液适当稀释。 3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。 4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.2 5 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。 5 、1 mol·L -1 H 2SO 4 溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容 量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。 6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。此溶液含NH3为40μmol·mL-1。 7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70 mL30% KOH ，不断搅拌，再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀，静置过夜，倾出清液贮于棕色试剂瓶（用橡皮塞）中放置暗处保存。 在有碘化汞情况下，可溶10 g HgI2和7 g KI于少量蒸馏水中，另溶16 gNaOH 于50mL 水中，待冷却后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水定容至100 mL 。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色试剂瓶中。（配置方法之二）
与分解代谢有关的生化实验（二） 1、了解各生化实验的原理 2、能配制相应的培养基，选用合适的指示剂 3、能准确判断结果，并进行表示 1、VP试验 2、硫化氢试验 3、尿素酶试验 4、复合生化试验 ①动力靛基质尿素酶试验 MIU ②克氏双糖铁培养基试验 KIA 克氏双糖铁培养基试验 KIA KIA可能出现的四种颜色所表示的意义 讲授为主 实验报告 反复强调微生物实验操作的注意事项
复习：相关理论知识 引入：不同种类的微生物能产生不同的酶类，因此，不同的微生物能够利用的营养物质是不同的。即使是针对相同的营养物质，不同的微生物有不同的利用方法（导致最终产物不同）。 人为的设计一些培养基和检测方法，可以比较方便的了解微生物的生理过程。 实验二与分解代谢有关的生化试验 5.VP试验 ①培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基（葡胨水） ②指示剂：VP试剂（VP甲液和VP乙液） ③原理： ④结果判断和表示方法 培养基颜色变红—————— + 培养基颜色不变（或变棕色）——————－ 注意： 若滴加甲液和乙液后没有变色，不能马上判断结果为阴性。 乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化需要一段时间。 再放入培养箱培养2—4h以后，判 断结果。
原理： 含硫氨基酸 2S + Fe 2+ ， + Pb 2+ 7. 尿素酶试验 尿素培养基配方： 蛋白胨 1g NaCl 5g 葡萄糖 1g 磷酸二氢钾 2g 尿素 终浓度2% 酚红溶液 3ml 蒸馏水 1000ml ①培养基：尿素培养基（pH6.8） ②指示剂：酚红 ③原理： 尿素3， 指示剂变色，桔黄色红色 ④结果判断和表示方法： 培养基颜色变红———— + 培养基颜色不变（桔黄） ————— — 6、硫化氢试验
豆粕中酶活性测定 尿酶(Urease)：生大豆中含不等量尿酶，尿酶本身无营养意义，但是它与抗胰蛋白酶含量接近，而且遇热失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此以尿酶活性用作豆粕加工适宜度的简单估测指标。但是加工适宜度不仅取决于畜种、年龄和畜禽阶段，也取决于大豆品种及储存状况。严寒损伤的大豆储存6个月以上，则抗胰蛋白酶含量会增加，但是未受损伤的大豆就没有这种现象。 附录A大豆制品中尿素酶活性测定方法 GB/T 8622-1988 A.1 适用范围 本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿酶活性的测定。本法可确认大豆的湿热处理程度。 A.2 定义 本标准所指尿素酶活性定义如下： 在(30±0.5)℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。 A.3 原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。 A.4 仪器设备 A.4.1 样品筛：孔径200mm; A.4.2 酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置;
A.4.3 恒温水浴：可控温(30±0.5)℃; A.4.4 试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子; A.4.5 精密计时器; A.4.6 粉碎机：粉碎时应不生强热(例如球磨机) A.4.7 分析天平：感量0.0001g; A.4.8 移液管：10mL。 A.5 试剂和溶液 A.5.1 尿素：分析纯; A.5.2 磷酸氢二钠：分析纯; A.5.3 磷酸二氢钾：分析纯; A.5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0)：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。 A.5.5 盐酸：分析纯，c(HCL)=0.1mol/L溶液; A.5.6 氢氧化钠：分析纯，c(NaOH)=0.1mol/L标准溶液。 A.6 试样的制备 用粉碎机将10g试样粉碎，使之全部通过样品筛。对特殊试样(水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品)应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。 A.7 测定步骤 称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg，转入试管中(如活性很高只称0.05g试样),移
确诊消化性溃疡首选的检查方法是
1、确诊消化性溃疡首选的检查方法是 A.B超 B. X线 C.幽门螺旋杆菌检测 D.胃镜 E.胃液分析 2、作为幽门螺旋杆菌根除治疗后复查的首选方法是 A.胃组织学检查 B.快速尿素酶试验 C.幽门螺旋杆菌培养 D.C14尿素呼气试验 E.血清学检查 3、引起上消化道出血最常见的原因是 A.胃癌 B.胃十二指肠溃疡 C.肝硬化 D.出血性胃炎 E.胆道出血 4、下列哪项不符合由胃泌素瘤引起的消化性溃疡 A.多发生在球后十二指肠降部和横段,或空肠近端 B.常规胃手术后不易复发 C.易并发出血、穿孔、梗阻 D.基础胃酸分泌过度 E.常伴腹泻 5、下列疾病中，骨髓有核红细胞出现“核老浆幼”现象的是 A.巨幼红细胞性贫血 B.急性红血病 C.缺铁性贫血 D.骨髄增生异常综合症 E.再障 6、结肠癌患者中血清CEA水平高于正常的约占 A. 30% B. 40% C. 50% D. 60% E.70% 7、继发性腹膜炎最常见的病原菌是 A.链球菌 B.葡萄球菌 C.变形杆菌 D.大肠杆菌 E.厌氧菌
B.咳嗽后咯出鲜红色血 C.鲜红色血中含泡沫痰 D.鲜血经酸碱测定呈酸性 E.咯血后3天痰中仍带血 16、溃疡性结肠炎的好发部位是 A.升结肠 B.空肠和回肠 C.直肠和乙状结肠 D.横结肠 E.回盲部 17、右侧结肠癌最多见的大体形态是 A.浸润型 B.溃疡型 C.肿块型 D.浸润溃疡塑 E.弥漫型 18、男性，50岁，腹股沟三角突出半球形包快，易还纳，未进入阴囊，不透光,主要考虑为 A.鞘膜积液 B.隐睾 C.股疝 D.斜疝 E.直疝 19、溃疡病致瘢痕性幽门梗阻最典型的临床表现是 A.呕吐 B.腹胀 C.消痩 D.贫血 E.脱水 20、细菌性痢疾的病理改变的主要部位是 A.盲肠 B.回肠末端 C.直肠和乙状结肠 D.升结肠 E.降结肠 21、肠梗阻病人血清钾检测值为2.9mmol／L，临床上一般不表现为 A、四肢无力 B、ST段降低 C、皮肤苍白
实验五固定化脲酶活力的测定 一、实验原理 固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。故可测定脲酶活力的大小。 二、仪器和试剂 1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器 2、实验四制备的固定化脲酶 3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏 水并定容至100 ml 4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml 5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶 解并定容至100 ml。此溶液含NH3为40 μM 6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中， 冷却后加水定容至1000 ml 7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。另 称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐 注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮 于棕色瓶中，密塞保存。 三、实验步骤 1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取0.3-0.5 g，切碎。 2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100 mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水 浴中保温5 min。
常用细菌的代谢生理实验 实验目的： 掌握一些基本的微生物菌体的鉴别方法： 糖发酵实验应用：观察细菌对糖度的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定。 甲基红实验应用：是肠道杆菌常用的生化反应实验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌。 靛基质实验应用：用于肠道杆菌的鉴定。 尿素酶实验应用：肠杆菌科属间鉴定。 实验原理 糖发酵实验： 代谢途径：多糖－→单糖－→丙酮酸－→酸性产物(或产酸产气)。通过指示剂呈酸性变色或者是气泡的产生情况来判断多糖是否被利用，进而可以对一些菌株进行区分。该实验主要用于肠道杆菌的鉴定。 甲基红实验： 细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红实验阳性。 靛基质实验： 细菌产生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。 尿素酶实验 产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色。 材料、器材与试剂
材料： 实验用菌体1，实验用菌体2。 器材： 试管、烧杯、三角烧瓶、台秤、玻璃棒、灭菌锅、移液管、超净台、酒精灯、镊子。 试剂： 甲基红、尿素、酚红、 培养基：葡萄糖蛋白胨培养基、蛋白胨培养基、尿素培养基。 实验步骤 1、培养基配置。配足够量的培养基，分装后，灭菌。 2、接种。分别向四种培养基中接种菌株1、菌株2，并注明培养基以及所用菌株种类。 3、培养。将接种完的培养基放入培养箱中培养。 4、观察。三天后，取出试管，进行实验结果观察。 糖酵解实验与尿素酶实验不做任何处理，仅观察培养基与空白培养基的不同。 向甲基红实验的试管中加入甲基红试剂观察培养基颜色变化。 向靛基质实验的试管中想加入试剂1，混匀后静置一段时间后再加入试剂2.最后观 察现象。 实验结果及分析 糖酵解实验结果： 接种菌株1的培养基颜色比接种菌株2的培养基颜色浅，但均与空白培养基比并无明显颜色变化，没有酸性颜色产生，也没有气泡产生。 甲基红实验结果：
第十届大学生创新大赛 竞赛作品 作品名称：饲用大豆及其制品中豚酶活性快速检测管学院：生物工程学院 申报者姓名 （集体名称）___________ 类别： □自然科学类学术论文 □哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 □科技制作（投入较大的）
V小发明创造 饲用大豆及其制品中腮酶活性 快速检测管研究报告 摘要：饲用大豆及其制品中含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，动物采食后会出现腹泻、胰腺肿大等症状，导致生产性能下降。胰蛋白酶抑制剂的活性不易测定，但是由于蛋白酶抑制剂是一种蛋白质，对热的敏感性与腺酶相似，且两者共存，因此，本设计通过测定饲用大豆及其制品中麻酶活性来间接反映胰蛋白酶抑制剂的活性。由于麻酶在室温下可将尿素水解生成氨，氨可使酚红指示剂变红且反应时间与腺酶活性具有相关性，因此将尿素缓冲液及酚红指示剂以一定的比例制备反应体系。在比色管反应体系中直接加入待测饲用大豆及其制品，根据反应时间带入拟合方程，计算麻酶活性。应用该检测管可以快速、准确、直观的检测饲用大豆及其制品中腺酶活性，进而对胰蛋白酶活性进行监测，从而判定饲用大豆及其制品的饲用安全性。
关键词：大豆豆粕服酶活性胰蛋白酶抑制剂快速检测管
一、研究背景及意义 饲料工业是现代畜牧业和水产养殖业发展的物质基础，直接关系到农业、农村经济发展和人民生活质量，已经成为国民经济的重要基础产业之一，在促进养殖业健康可持续发展、农民增收方面和改善人民的生活质量等方面发挥了重要的作用。饲料安全问题日趋严重，有效解决饲料安全问题是保证饲料工业可持续发展的关键，也是保证动物源性食品安全的重要措施之一。因此饲料安全检测变得尤为重要，饲料安全的快速检测技术，则为饲料安全的监督和检测提供重要的技术支撑。随着饲料安全问题的相继曝光，由饲料安全问题引发的食品安全问题已经成为民众日常关心的热点和焦点。为此，国家相关部门加大了饲料的监管、监测力度。为了满足饲料安全监督的即时性需要, 迫切需要一些快速、方便、准确的检测技术，尤其是对某种或某类特别物质的快速检测，对提高饲料安全的监督和管理具有重要的作用。 大豆，及其制品是优良的植物性蛋白质饲料，同时含有丰富的矿物质与维生素，是目前世界范围内动物饲料原料中最常用的植物性蛋白饲料。但是，大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消化、吸收和利用的抗营养因子和一些有毒物质，如麻酶、胰蛋白酶抑制剂、植物性红细胞凝集素、皂昔等。当抗营养因子的含量超过动物的耐受范围时会影响到动物的健康和生产性能。大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制剂是影响动物安全食用的重要指标之一，由于其和腺酶都属于水溶性蛋白质，加热处理时都会失去活性，而且失活的速率大致相同，因此他们的活性指
脲酶定性的实验 随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低. 判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2. 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法. 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色. 2.试剂 2.1尿素:GB696,分析纯. 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用. 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中. 3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s. 3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无 同时作空白对照试验. 样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的. 一般企业认为7、8分钟变色较为合适. 二、半固态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色. 2.试剂 2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.
两种脲酶活性定性测定方法及比较 随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强 1～5min 强 5～15min 稍有 15min 无
幽门螺杆菌的根除方法： 方案一、奥美拉唑三联疗法，是根除幽门螺旋杆菌的短程疗法，具体方法为： 奥美拉唑20mg（1粒）； 克拉霉素0.5（0.25/粒×2）； 阿莫西林1.0（0.5/粒×2）； 以上三药，均为每日2次，即早晚各1 次。疗程：短程疗法为一周，也可服用2周。 方案二、奥美拉唑、甲硝唑、克拉霉素三联疗法，为根除幽门螺旋杆菌的短程疗法，时间为一周。 方法为奥美拉唑20mg，替硝唑（甲硝唑）或500mg，克拉霉素250mg，每天2次。 为提高根治效果，可采用枸椽酸铋钾、奥美拉唑、甲硝唑、克拉霉素四联一周疗法，四联疗法可获得较高的Hp根除率,并可提高耐甲硝唑的三联治疗患者的敏感性。 方法为： 枸橼酸铋钾0.22g（2粒）, 奥美拉唑20mg，替硝唑500mg，克拉霉素250mg，每天2次疗程7天。 为避免甲硝唑的副作用，也可用阿莫西林1.0 代替甲硝唑。 补充回答： 抗幽门螺杆菌失败的原因，包括菌株因素、患者因素、再感染与环境因素等。其中，根除失敗的主要原因是抗药性；另外，胃內高含菌量、抽烟等也是造成根除失敗的原因。 建议：调整抗生素药物，选用较少有耐药现象的左旋氧氟沙星、呋喃唑酮等； 治疗方案： 奥美拉唑20mg，枸橼酸铋钾2粒，左旋氧氟沙星0.2，呋喃唑酮0.2，1日两次,疗程1~2周。 为提高疗效，也可用泮托拉唑钠肠溶胶囊，代替奥美拉唑。 如多次治疗失敗，应以胃镜检查取得组织培养抗幽门螺杆菌，再根据抗生素敏感试验结果，选择敏感抗生素治疗。 可以进行四联抗HP治疗。调整抗生素，譬如：奥美拉唑果胶铋阿莫西林左氧氟沙星) 全球半数以上人口感染幽门螺杆菌(H. pylor简称Hp)，zhonguo也是Hp感染率较高的国家，所以Hp感染的治疗是Hp研究领域中的重点。 选择治疗适应证可参考专家共识 并非所有Hp感染者都需要治疗，哪些人需要治疗？虽然各国都有自己制定的标准，但原则大体相同。迄今为止，我国已发布了3次关于Hp感染处理中若干问题的共识意见，即1999年海南共识，2003年桐城共识以及2007年庐山共识。 第一，桐城共识提到，“有明显异常的慢性胃炎”(指合并糜烂、中-重度萎缩、中-重度肠化或轻-重度异
土壤脲酶的测定方法 脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂： 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至
1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d（前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中 2)向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3)之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4)将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5)培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
CLSI标准化指南解读(国家I类，5分) 1、细菌分离鉴定规范化操作 1.甲基红2（MR 试验）正确的是D A 大肠杆菌呈阴性反应 B 沙门菌呈阴性反应 C 志贺菌呈阴性反应 D 大肠杆菌、沙门菌、志贺菌呈阳性反应 2.有机酸盐利用试验正确的是D A 柠檬酸盐利用试验测试细菌能否利用柠檬酸盐作为碳源 B 丙二酸盐利用试验测试细菌能否利用丙二酸盐作为唯一的碳源 C 马尿酸钠水解试验是B群链球菌重要的特征 D 以上都对 3.尿素酶试验正确的是D A 测试细菌分解尿素的能力 B 是变形杆菌属的重要特征 C 是变形杆菌属与肠杆菌其他菌属重要的鉴别试验。 D 以上都对 4.硫化氢试验正确的是D A 测试细菌分解含硫氨基酸的能力 B 在肠杆菌科内各菌属的鉴定有重要的价值 C 费劳地枸橼酸杆菌、爱德华菌、沙门菌中某些菌种为阳性 D 以上都对 5.伏普试验正确的是D A 沙雷菌、阴沟、产气呈现阴性反应 B 大肠杆菌、沙门菌、志贺菌为阳性反应 C 本试验常与甲基红试验呈相同的结果 D 本试验常与甲基红试验呈相反的结果 6.毒性酶类试验正确的是D A 血浆凝固酶试验用于区别金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌 B 溶血试验区别细菌是否含溶血素 C 溶血试验常用于溶血链球菌的鉴别。 D 以上都对 7.呼吸酶试验包括D A 氧化酶试验 B 触酶试验 C 硝酸盐还原试验 D 以上都对 8.血清学鉴定试验正确的是D A 志贺氏菌多价和单价凝集血清用于志贺痢疾菌属种间的鉴别 B 沙门氏菌多价和单价凝集血清用于沙门菌属种间鉴别 C 致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清用于致病性大肠杆菌型间鉴别 D 以上都对 9.七叶苷水解试验正确的是A A 用于鉴别D群链球菌和A、B、群链球菌
脲酶urease（水解酶）： 脲酶试验原理： 存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解。脲酶的作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法是测定生成的氨量。 试剂：1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液 标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，定容至100ml，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 取新鲜土壤7份，每份30g，装于棕色广口瓶中，先将1，3－二氯丙烯溶于丙酮（定量），6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1，3－二氯丙烯，使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500μg/g，另1份相应加入1.5ml 的丙酮作为对照，然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量，以便补充水分）。放置于25℃恒温培养箱，培养后第0d、1d，5d，10d （前10d密封，后来测定的敞口）、20d，30d，40d，50d分别取土样检测脲酶的活性。取样前，反复旋转广口瓶，混匀土样，一个处理随机取3个重复。 1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中。 2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟 3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合 4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h 5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。 实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。 一.液态法 1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。 2.试剂 2.1尿素:GB696，分析纯。 2.2酚红指示剂 2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解； 2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 3.操作方法 3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。 3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。 3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于 15min。 颜色出现时间脲酶活性 1min 极强
一、脲酶测定(比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1、试剂配制： （1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7， 并用水稀释至2L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢 氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B 两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。 （4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。 （5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。 2、操作步骤 称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。 标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。 3、结果计算
靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性 一、实验原理 靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0.05~0.5mg/l之间。 靛酚蓝反应原理如下: NH3 + OCl——NH2 Cl +OH- 三、实验试剂 1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。 2）柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。 3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。 4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（9ml—100ml中）5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。 6）甲苯 四、实验过程 1.标准曲线的测定 吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00ml 13.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。 2.土样中脲酶活性的测定 分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7），并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38℃水稀释至刻度，充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。 设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中所做的空白对照。 分别吸取（1-3ml）滤液于50ml容量瓶中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈