α-葡萄糖醛酸酶的研究进展
摘要：α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖类半纤维素完全降解过程中必不可少的重要酶，它在构建彻底降解半纤维素的基因工程菌和半纤维素酶制品的应用开发方面的生物技术潜力正在越来越受到人们的关注。本文从木聚糖的结构着重介绍α-葡萄糖醛酸酶的作用机理、酶活分析、酶纯化和基因克隆的研究进展。
关键词：木聚糖；α-葡萄糖醛酸酶；作用机制；基因重组技术
木聚糖类半纤维素是仅次于纤维素的第二个重要的异源多糖，它以其数量大，组分易提取成为最具潜力的可再生资源[1]。因此，各国政府都不断投入对木聚糖类半纤维素酶的研究。尤其是石油危机引起的价格战更促使了人们对半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究。我国科学工作者在半纤维素酶方面已经进行了深入研究，并在食品加工、饲料、纸浆溶解及纸浆漂白上取得了可喜成绩。但主要是集中在内切木聚糖酶的研究上[1]。我国是一个农业大国，每年有大量的秸杆成为环保负担，而秸杆中约94%的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[1]。如果将其生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品，如有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类、溶剂或燃料。但是，彻底降解木聚糖需要由多种水解酶组成的酶系统的协同作用。这个木聚糖降解酶系是由内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶组成的。α-葡萄糖醛酸酶在开发木聚糖类半纤维素中起着非常重要的作用，它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注。目前，有关α-葡萄糖醛酸酶的研究在国内还未见报道，本文将从木聚糖类半纤维素的结构、酶作用机制介绍有关α-葡萄糖醛酸酶及其基因的研究进展。
1 木聚糖的结构
木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，它是一个以β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基像乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的[2]。为了保证植物细胞壁的刚性，木聚糖则与细胞壁聚合物果胶质和木质素相连接，其中阿魏酸与果胶质和木质素中的酚酸残基形成共价键，并通过阿拉伯糖基连到木聚糖主链上。细胞壁的木质素与4-O-甲基葡萄糖醛酸之间则通过4-O-甲基葡萄糖醛酸以酯键连接到木聚糖主链上[3]。大多数硬木半纤维素是O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，它是一条约70个β-木糖吡喃型残基通过β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链（平均聚合度在150~200之间），平均每10个木糖残基就由α-1,2键连上一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基。硬木木聚糖被高度乙酰化，每十个木糖单位的C-3和C-2位置上带有7 个O-乙酰。用碱抽提木聚糖时，这些乙酰基很容易去除[4]。
软木和禾本科植物半纤维素中的木聚糖主要是阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖（平均聚合度在70~80之间），平均每6个木糖单位带有一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基，每8~9个木糖残基带一个α-L-阿拉伯呋喃糖单元，与硬木半纤维素相比，是未乙酰化的[2,4]。秸杆半纤维素就属于此类。
2 α-葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理
由于异源木聚糖是高度分支的多糖，其主链和侧链含有不同的侧枝，主要有乙酰基、阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基等；当内切木聚糖酶随机作用木聚糖时便受到这些基团的空间阻碍，而不能到达所作用的木糖苷键，所形成的产物只能是带侧枝的低聚糖。因此，木聚糖的完全降解需要多种水解酶的协同作用。它包括主链水解酶β-1.4内切木聚糖酶、β-木糖苷酶和侧链水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶（如图1）[4]。这些酶的协同作用，将木
Endoxylanase:内切木聚糖酶；β-Xylosidase:β-木糖苷酶；α-Glucuronidase:α-葡萄糖醛酸酶；
α-Arabinofuranosidase:α-阿拉伯呋喃糖苷酶；Acethy Xylan Esterase:乙酰木聚糖酯酶。
图3 木聚糖降解酶系的木聚糖降解作用
Fig 1. xylan degradation of xylanolytic system
聚糖转化为它的组成分糖。
α-葡萄糖醛酸酶（EC3.2.1-）水解甲基葡萄糖醛酸（４-O-MeGlcA）与葡萄糖醛酸木聚糖主干上木糖残基间的α-1.2键，该键对酸水解很稳定。木聚糖中的葡萄糖醛酸通常被甲基化为４-O-MeGlcA。自然界中的硬木、软木和禾本科植物木聚糖中都存在着这种α-1.2糖苷键连接的４-O-MeGlcA取代基。当主链水解酶与木聚糖底物结合时，４-O-MeGlcA侧枝阻碍酶到达所作用的糖苷键，从而降低木聚糖的水解效率。Shao W 等报道，如果α-葡萄糖醛酸酶与内切木聚糖酶同时存在时，它们相互促进，加速低聚糖的产生，同时低聚糖也需要经α-葡萄糖醛酸酶去除4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝后才能被β-木糖苷酶彻底降解作用[5]。因此，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖降解酶系中非常重要的一员。α-葡萄糖醛酸酶的底物专一性依据酶源而不同，该酶的水解作用需要低分子质量的葡萄糖醛酸木聚糖为底物，它们能够从木聚糖内切酶水解产生的低聚木糖释放4-O-甲基葡萄糖醛酸。α-葡萄糖醛酸酶只对聚合度DP大于2的取代低聚木糖有效[4]。
3α-葡萄糖醛酸酶活性分析方法
用于α-葡萄糖醛酸酶活性分析的底物主要有4-D-甲基葡糖醛酸基木二糖、
木三糖（４-O-MeGlcAX2、４-O-MeGlcAX3）、4-D-甲基葡糖醛酸基木糖醇（４-O-MeGlcA-xylitol）、糖醛二酸糖醛三酸混合物和４-O-MeGlcA取代的低聚糖混合物[6]。人工合成p-硝基苯-α-葡萄糖醛酸被用于检测酶活性，但是，由于有些微生物的α-葡萄糖醛酸酶只对天然底物显示活性，而对人工生色底物不能分解，因此，到目前为止，该酶活性的测定还不能用人工生色底物替代。
α-葡萄糖醛酸酶活性测定是利用带有糖醛酸的低聚木糖（4-O-MeGlcAX2~4）与α-葡萄糖醛酸酶反应，结果产生的4-O-MeGlcA使得还原糖增加而显示出其活性。最早采用的方法有气液色谱、薄层层析和硼酸盐复合物离子交换色谱对酶降解产物的分离。其中，离子交换色谱是在NaOH-培养基检测α-葡萄糖醛酸酶活性的有效工具。但是，该法操作比较繁琐。现在α-葡萄糖醛酸酶活性测定是利用酶降解下产生的4-O-MeGlcA与砷钼酸钠的进行显色反应，最后在600~660 nm下用分光光度计测其吸收峰值[3]。此法虽然较早期的测定方法有了很大改进，
此，目前所报道的α-葡萄糖醛酸酶的研究，其酶活测定所用底物各不相同，结果不同生物之间的该酶活性很难进行比较[6,7]。目前，人们正在利用一种新型合成底物或通过检测转化产物的结构研究α-葡萄糖醛酸酶的底物专一性[8]。
4α-葡萄糖醛酸酶的纯化和基因克隆
由于α-葡萄糖醛酸酶在自然界出现不多，而且活性不高，因此直到1986年
该酶才有报道。迄今为止，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖侧枝分解酶中报道最少的。目前，只有少数几个酶被纯化和定性，经过基因克隆和分析的就更少了（见表1）。纯化的α-葡萄糖醛酸酶是分子质量为100 kDa左右的大分子蛋白质，采用的纯化技术主要为阴离子交换柱层析，疏水作用层析和凝胶过滤。第一个α-葡萄糖醛酸酶是从嗜热真菌Thermoascus aurantiaus中利用DEAE-Sephadex离子交换柱层析和凝胶过滤纯化的[9]，该酶能以相同的速度从聚合木聚糖和低聚糖释放4-O-MeGlcA。目前所研究的α-葡萄糖醛酸酶大多数只能作用4-O-MeGlcA取代的低聚糖或小型底物。因此，大部分α-葡萄糖醛酸酶需要同水解主链的木聚糖酶一起协同作用以便从木聚糖释放出相当量的4-O-MeGlcA。但是Thermoanaerobacterium sp ，Aspergillus tubingenis和Phanerochaete chrysosporium中的α-葡萄糖醛酸酶对聚合木聚糖也有少量活性，来自T.aurantiaus中的是这些纯化酶中对聚合木聚糖作用活性最高的[16]。第一个从细菌中纯化的α-葡萄糖醛酸酶是来自嗜热厌氧细菌Thermoanaerobacterium sp.JW/SY485，它是通过阴离子交换柱层析和疏水作用层析纯化得到的。该酶存在于细胞内，对于低聚木糖上的葡萄糖醛酸侧枝有较高的活性[5]。
有关α-葡萄糖醛酸酶的基因是木聚糖降解酶系中报道最少的，目前，在真菌和细菌中只有四个α-葡萄糖醛酸酶及其基因进行了分子水平的研究。T. Reesei 中编码α-葡萄糖醛酸酶的基因glr1是第一个被克隆和定性的[18]。它是EmlilioMargolles-clarky从以λ-ZAP为载体构建的T. Reesei Rut-30的cDNA表达文库中，通过α-葡萄糖醛酸酶的多克隆抗体筛选到的。核酸序列分析表明，含有一个2541 bp的可读框架（ORF），编码一个847个氨基酸的蛋白质。一个假定信号肽序列的切割位点被确定在距离起始密码子的19个氨基酸处。成熟蛋白有828个氨基酸，与Siika-aho等人报道的纯酶分子质量91 kDa相同。氨基酸序列上有8个糖基化位点。Ruile P等从Thermotogo maritimn MSB8基因文库中，通过α-葡萄糖醛酸酶活性筛选法得到6.5kb的基因组DNA，并对其进行核酸序列分析、缺失实验及在大肠杆菌中表达，最后分离到一个编码674个氨基酸的α-葡萄糖醛酸酶基因，重组酶的凝胶过滤纯分子量大于630 kDa, 最适pH6.3,最大活性温度为85℃[3]。接着，De Vries R P等从A. tubigensis 2菌中纯化到一个胞外α-葡萄糖醛酸酶[14]，经内切蛋白酶处理和反相HPLC分离后，得到7个末端和中间肽并对其进行N-端测序；根据测得的氨基酸序列设计合成九条简并引物，分别以A. tubigensis基因组DNA为模板进行PCR，获得一个1,142 bp的α-葡萄糖醛酸酶基因的部分片段，然后以该片段作探针从A. tubigensis的基因组文库中筛选到α-葡萄糖醛酸酶的完整基因。该基因含有一个2523bp的阅读框，编码着841个氨基酸的蛋白质，并含有一个20个氨基酸的真核信号肽。最近，Choi I D 等又从B. sterothermophilus中克隆到α-葡萄糖醛酸酶基因并测序[17]。他们是根据B. sterothermophilus、T. Maritima和 A. tubingensis 3个菌中的α-葡萄糖醛酸酶基因的保守序列设计合成了两个简并引物，经PCR扩增到一个638 bp的PCR 产物用作探针，通过Southern杂交筛选到一个带有α-葡萄糖醛酸酶基因的克隆子。该基因含有一个2073 bp的开放阅读框，编码691个氨基酸多肽[17]。由氨基酸序列分析，T. reese i的glr1，T. maritima、B. sterothermophilu和A. tubigensis的agu A相互间具有明显的同源性，属于糖基水解酶第67族家族。
5结语
木聚糖类半纤维素是自然界大量存在的异源多糖，如果将其充分降解和有效
转化将为人类带来不可估量的效益。但是，完全降解木聚糖需要由多种水解酶的协同作用，它包括内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶，其中α-葡萄糖醛酸酶是这个降解酶系中很重要的一员。无论是硬木（阔叶树）还是软木（针叶树）和禾本科植物中的木聚糖都含有α-葡萄糖醛酸和4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝。这些侧枝在木聚糖的降解过程中阻碍木聚糖酶的作用。目前的研究表明，α-葡萄糖醛酸酶作用的底物是木聚糖酶和β-木糖苷酶相互协同作用产生的低聚糖，但是低聚糖需经葡萄糖醛酸酶去除4-O-MeGlcA侧枝后才能被木糖苷酶彻底降解，因此，葡萄糖醛酸酶对木聚糖类半纤维素完全降解是极其重要的。目前，本实验室主要从事以下几方面的研究工作是：（1）、研究能分解利用半纤维素的微生物，重点是具有降解木聚糖类半纤维素微生物；（2）、将编码木聚糖类半纤维素酶的基因转入现有的发酵工程菌以获取各种半纤维素酶制品；（3）、用基因重组技术构建能分解利用半纤维素的发酵工程菌，其中本实验室正在研究的能有效利用半纤维素生产乙醇的工程菌是国家自然基金资助项目，有望在秸杆半纤维素的综合利用上取得突破性成果。α-葡萄糖醛酸酶是这些研究课题中必不可少的重要酶类，由于它能协同其它木聚糖降解酶完全降解木聚糖类半纤维素，因此，开发该酶在食品加工、饲料工业和纸造纸业等方面的应用价值将具有广阔的市场前景。
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Advances in the studies on α-glucuronidase
XUE Ye-min, LIU Hai-li, TANG Lei, SHAO Wei-Lan, MAO Zhong-Gui
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Southern Y angtze Univercity Wuxi 214036)
Abstract:α-glucuronidase are part of the microbial xylanolytic enzyme system
necessary for the complete hydrolysis of heteroxylans’hemicellulose, and could have interesting biotechnological potentials in constructing strains of recombinant genes, which can completely degrade hemicellulose, and exploiting hemicellulases’ application. This thesis mainly introducedthe action mechanism , activity analysis, purification and gene cloning of α-glucuronidase .
Keyword:xylan; glucuronidase ; action mechanism; recombinant technology
α-葡萄糖醛酸酶的研究进展 摘要：α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖类半纤维素完全降解过程中必不可少的重要酶，它在构建彻底降解半纤维素的基因工程菌和半纤维素酶制品的应用开发方面的生物技术潜力正在越来越受到人们的关注。本文从木聚糖的结构着重介绍α-葡萄糖醛酸酶的作用机理、酶活分析、酶纯化和基因克隆的研究进展。 关键词：木聚糖；α-葡萄糖醛酸酶；作用机制；基因重组技术 木聚糖类半纤维素是仅次于纤维素的第二个重要的异源多糖，它以其数量大，组分易提取成为最具潜力的可再生资源[1]。因此，各国政府都不断投入对木聚糖类半纤维素酶的研究。尤其是石油危机引起的价格战更促使了人们对半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究。我国科学工作者在半纤维素酶方面已经进行了深入研究，并在食品加工、饲料、纸浆溶解及纸浆漂白上取得了可喜成绩。但主要是集中在内切木聚糖酶的研究上[1]。我国是一个农业大国，每年有大量的秸杆成为环保负担，而秸杆中约94%的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[1]。如果将其生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品，如有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类、溶剂或燃料。但是，彻底降解木聚糖需要由多种水解酶组成的酶系统的协同作用。这个木聚糖降解酶系是由内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶组成的。α-葡萄糖醛酸酶在开发木聚糖类半纤维素中起着非常重要的作用，它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注。目前，有关α-葡萄糖醛酸酶的研究在国内还未见报道，本文将从木聚糖类半纤维素的结构、酶作用机制介绍有关α-葡萄糖醛酸酶及其基因的研究进展。 1 木聚糖的结构 木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，它是一个以β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基像乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的[2]。为了保证植物细胞壁的刚性，木聚糖则与细胞壁聚合物果胶质和木质素相连接，其中阿魏酸与果胶质和木质素中的酚酸残基形成共价键，并通过阿拉伯糖基连到木聚糖主链上。细胞壁的木质素与4-O-甲基葡萄糖醛酸之间则通过4-O-甲基葡萄糖醛酸以酯键连接到木聚糖主链上[3]。大多数硬木半纤维素是O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，它是一条约70个β-木糖吡喃型残基通过β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链（平均聚合度在150~200之间），平均每10个木糖残基就由α-1,2键连上一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基。硬木木聚糖被高度乙酰化，每十个木糖单位的C-3和C-2位置上带有7 个O-乙酰。用碱抽提木聚糖时，这些乙酰基很容易去除[4]。 软木和禾本科植物半纤维素中的木聚糖主要是阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖（平均聚合度在70~80之间），平均每6个木糖单位带有一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基，每8~9个木糖残基带一个α-L-阿拉伯呋喃糖单元，与硬木半纤维素相比，是未乙酰化的[2,4]。秸杆半纤维素就属于此类。 2 α-葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理
1.诊断名词解释： 1.稽留热：是体温恒定在39-40 ℃以上，持续数天或数周24h内体温波动不超过1 ℃。 见于伤寒、大叶性肺炎等。 2.呼吸困难：是指病人主观上有空气不足或呼吸费力的感觉；客观上有呼吸频率、深度和 节律的改变。可见呼吸肌参与呼吸运动，严重者呈端坐呼吸及发绀。见于支气管炎，肺炎等。 3.莫非氏征（Murphy）:检查时医师以左手掌平放于患者右胸下部，以拇指指腹勾压于右 肋下胆囊点处然后嘱患者缓慢吸气，宰吸气过程中发炎的胆囊下移时碰到用力按压的拇指，即可引起疼痛，此为胆囊触痛，如因剧烈疼痛而致吸气终止。见于胆囊炎。 4.移动性浊音：检查者自腹中部脐水平面开始想患者左侧叩诊，发现浊音时，扳指固定不 动，嘱患者右侧卧，再度叩诊，如呈鼓音，表明浊音移动。同样方法想右侧叩诊，叩得浊音后嘱患者左侧卧，已核实浊音是否移动。这种因体位不同出现浊音区变动的现象。 称为移动性浊音。见于肝硬化腹水。 5.主诉：是病人就诊的主要原因，是感觉最明显、最痛苦的症状或体征，包括一个或数个 主要症状及持续时间。主诉必须包括症状、部位、时间。 6.肝颈静脉反流征：当右心衰引起肝淤血肿大时，用手压迫肝脏可使颈静脉怒张更明显。 见于肝硬化。 7.潮式呼吸：是一种由浅慢逐渐变为深快，然后再由深快转变为浅慢，随之出现一段呼吸 暂停后，又开始如上变化的周期性呼吸。见于脑炎，脑膜炎等。 8.周围血管征：由枪击音，Duroziez双重杂音，毛细血管搏动征组成，见于主动脉瓣重度 关闭不全、甲状腺功能亢进等。 9.核左移：外周血杆状核或杆状核以上的幼稚粒细胞增多，超过5%。见于急性化脓性感 染，急性失血等。 10.肺型P波：P波尖而高耸，电压≥0.25mV,以Ⅱ、Ⅲ、aVF导联表现最为突出，见于右 心房肥大，肺心病等。 11.腹膜刺激征：板状腹，压痛，反跳痛组成，见于急性腹膜炎，胃肠穿孔等。 12.抬举性心尖搏动：心尖区徐缓、有力、较局限的搏动使手指尖端抬起，见于左室肥厚等。 13.弛张热：是指体温常在39度以上，24小时内温差超过1C°，但最低体温仍高于正 常体温。常见于败血症，风湿热，重症肺结核及化脓性炎症等。 14.三凹征：是指呼吸极度困难，辅助呼吸肌如胸部及腹部的肌肉都强力运动以辅助 呼吸活动，此时虽企图以扩张胸廓来增加吸气量，但因肺部气体吸入困难，不能扩张，致使在吸气时可见胸骨上窝、两侧锁骨上窝以及下部肋间隙均显凹陷，故称“三凹症”。此时亦可伴有干咳及高调吸气性喉鸣。常见于喉部、气管、大支气管的狭窄和阻塞，当伴随出现发绀、双肺湿罗音和心率加快时，提示左心衰竭。 15.眼眼球震颤：是一种不自主的、有节律性的、往返摆动的眼球运动。常由视觉系统、眼 外肌、内耳迷路及中枢神经系统的疾病引起。 16.间停呼吸：表现为有规律的呼吸几次后，突然停止一段时间，又开始呼吸，周而 复始。发生机制是由于呼吸中枢的兴奋性降低，使调节呼吸的反馈系统失常，只有在严重的缺氧和二氧化碳积聚到一定的时候，才能有效刺激呼吸中枢，进入到下一个呼吸周期。 17.触觉语颤：被检查者发出语音时，声波起缘于喉部，沿气管、支气管及肺泡传到 胸壁所引起共鸣的振动，可由检查者的手触及，故又称触觉震颤。减弱或消失）： 1、肺泡内含气量过多（肺气肿） 2、支气管阻塞（阻塞性肺不张） 3、大量胸腔 积液或气胸 4、胸膜高度增厚粘连 5、胸壁皮下气肿（增强）：1、肺泡内有炎
小鼠β葡萄糖醛酸苷酶(βGD)ELISA试剂盒使用说明书本 本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中β葡萄糖醛酸苷酶(βGD)的含量。 试验原理： βGD试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知βGD浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将βGD和生物素标记的抗体同时温育。小鼠β葡萄糖醛酸苷酶ELISA试剂盒洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中βGD的浓度呈比例关系。 试剂盒组成： 自备材料 蒸馏水。 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。 振荡器及磁力搅拌器等。
安全性 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。 操作注意事项 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。 样品收集、处理及保存方法 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。 保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。小鼠β葡萄糖醛酸苷酶ELISA试剂盒不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。 试剂的准备 标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。 洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GD）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC1910 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：液体37.5mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：1μmol/mL标准储备液10mL，4℃保存； 产品说明： β-GD广泛存在于动物组织中，是一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶，具有水解固醇葡萄糖醛酸和酸性粘多糖等生理功能。该酶在肝细胞中含量较高。此外在胃癌组织中含量丰富，测定胃液β-GD活性对于研究胃癌具有重要的意义。 β-GD催化苯酚β-D-葡萄糖醛酸产生游离的酚酞，通过测定苯酚含量反应该酶活性高低。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样品测定的前处理 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）加样孔 测定管标准管空白管 试剂一100100100 试剂二100100100 样本50 1μmol/mL50 蒸馏水50 混匀后，37℃水浴30min 试剂三750750750 混匀，540nm下测定各管吸光值 注意：标准管和空白管只需测一次。 三、β-GD活性计算 （1）按样本鲜重计算： 单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生1μmol酚酞的量为一个活力单位。 β-GD（μmol/h/g鲜重）=(C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W ×V1÷V2)÷T=2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W （2）按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1μmol酚酞的量为一个活力单位。 β-GD（μmol/h/mg prot）=(C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr C标准管：标准管浓度，1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.05mL； V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
期末考核 课程：Glycobiology 植物糖基转移酶研究进展 ：*** 学号：*** 班级：*** 时间：****
植物糖基转移酶研究进展 摘要:糖基转移酶一类是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶，在生物体中普遍存在并形成了超基因家族。糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程。本文综述了近年来的研究报道，综述了糖基转移酶的分类、分离鉴定方法及在生物学功能方面的研究进展，期望为相关研究工作提供参考。 关键词:植物糖基转移酶，分类，分离鉴定，生物学功能 糖基转移酶（Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y）是一类催化糖基转移的酶，通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移至特异的受体上。糖基转移酶几乎存在于所有的生物体中，其所催化的糖基化反应是最重要的生物学反应之一，直接参与二糖、单糖苷、聚糖苷等的生物合成。糖基供体分子包括双糖、多糖、1-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，植物中最常见的供体为UDP-Glc。受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸。糖基转移酶催化供体-受体形成α、β两种糖苷键，产物为多糖、糖蛋白、糖脂以及糖苷化合物等。全基因组测序发现真核生物中约1%的基因编码糖基转酶。 1糖基转移酶的分类 目前，对糖基转移酶的分类主要根据Campbell等提出的GT Family 分类系统（数据收录在CAZy数据库中）。糖基转移酶作为高度分歧的多源基因家族，根据蛋白氨基酸序列的一致性、催化特性以及保守序列对其进行分类。因此，一特定的糖基转移酶既可以通过生物化学的方法鉴定其底物，也可以通过生物信息学方法研究其与已知酶基因或酶蛋白氨基酸序列的同源性对其进行分类。目前，依据这种分类方法，糖基转移酶被分为94个家族。根据其的折叠方式可将绝大多数酶分为两个超家族，GT-A超家族和GT-B超家族（图1）。根据催化反应机制、产物的立体化学异构性，在这两个超家族中糖基转移酶又分为反向型和保留型两大类（图2）。 GT-A型折叠的空间结构有两个紧密相连的β/α/β类Rossmann折叠区域。GT-A家族成员需要一个D-X-D基序用来结合二价金金属离子（多为Mn2+），这有助于UDP-糖供体的PPi在酶活性位点上的固定，对于催化反应是不可或缺的。GT-A难以识别UDP-糖供体以外的供体，所以受体的多样性较低。GT-B型折叠的空间含有两个正对的β/α/β类Rossmann折叠区域，连接方式灵活。GT-B成员无需二价金属离子维持活性，这是GT-B与GT-A家族成员的一个显著区别。此外，通过结构分析和PSI-BLAST发现了由跨膜GT组成GT-C超家族，其折叠方式全为反向型，活性位点位于长环部，一般含有8-13个跨膜螺旋。
1、(L)药物效应动力学 又称药效学，研究药物对机体的作用及作用机制。 2、(L)药物代谢动力学 又称药动学，研究药物在机体的影响下所发生的变化及其规律。 3、(L)吸收 指药物从给药部位经过细胞组成的膜屏障进入血液循环的过程。 4、(M)pK a值 解离常数的负对数值，弱碱性或弱酸性药物在溶液中50％离子化时的pH值。 5、(M)离子障 非离子型药物可以自由穿透细胞膜，而离子型药物被限制在细胞膜的一侧，不易穿过细胞膜，这种现象称为离子障。 6、(L)首关消除 药物口服吸收后，通过门静脉进入肝脏发生转化，使进入体循环量减少，称为首关消除。 7、(L)分布 药物吸收后，通过循环向全身组织输送的过程。 8、(L)时效曲线 标准答案：用曲线表示药物效应随时间变化的过程。 9、(L)血浆半衰期 标准答案：血药浓度下降一半的时间(t1/2)。 10、(M)生物利用度 标准答案：指经过肝脏首关消除后，被吸收进入体循环的相对量和速度，F＝A/D，D表示给药剂量，A表示进入体循环的药量。 11、(M)绝对口服生物利用度 血管外给药的AUC与静脉注射后的AUC之比。12、(M)相对口服生物利用度 药物剂型不同，其吸收率不同，F=试药AUC/标准药AUC，可作为评比药物制剂的质量指标。 13、(M)零级消除动力学 :当体内药物过多时，机体以其最大能力消除药物，消除速度与C0无关，故以恒速进行(也称定量消除)；血浆半衰期不是固定不变的，当血药浓度下降至最大消除能力以下时，则按一级动力学消除。 14、(M)一级消除动力学 药物以恒比消除，单位时间内实际消除的药量随时间递减，药物半衰期与药物浓度高低无关，是恒定值，一次给药后，经过5个t1/2体内药物已基本消除，每隔1个t1/2给药一次，5个t1/2后可达稳态。15、(M)稳态血浓 标准答案：每隔1个t1/2给药一次，剂量相等，则经过5 个t1/2后，消除的药量与进入体内的药量相等，即为稳态。 16、(H)血浆清除率 单位时间内若干容积血浆中的药物被机体清除，单位为L/h，为肝、肾等器官的药物消除率的总和，CL=RE(消除速率)/Cp(当时的血浆药物浓度)。 17、(H)表观分布容积(V d) 标准答案：静脉注射一定量的药物，待分布平衡后，按测得的血浆浓度计算该药应占有的血浆容积。18、(M)药物作用 标准答案：指药物与机体细胞间的初始反应；是动因，是分子反应机制，有其特异性。 19、(L)药理效应 标准答案：是药物作用的结果，机体反应的表现。 20、(L)不良反应 不符合用药目的并给患者带来不适和痛苦的反应。 21、(L)药源性疾病 由药物引起的、较严重的、较难恢复的不良反应。 22、(L)副反应 在治疗剂量下发生，不符合用药目的的其他效应。 23、(M)后遗效应 指停药后血药浓度已降至阈浓度以下时残存的药理效应。 24、(L)停药反应由于突然停药导致原有疾病的加剧(又称为回跃反应) 25、(L)毒性反应 指药物剂量过大或蓄积过多而发生的危害性反应。 26、(L)剂量－效应关系 标准答案：指药理效应与剂量在一定浓度内成比例。 27、(M)量效曲线 标准答案：以效应为纵坐标，药物浓度为横坐标作图，得直方双曲线。可将药物浓度改用对数值作图，呈典型对称S型曲线，即为量效曲线。 28、(L)最小有效量 标准答案：刚能引起效应的阈剂量。 29、(M)半数有效量(ED 50) 标准答案：能引起50％的动物出现阳性反应(质反应)或50％最大效应(量反应)的剂量。 30、(L)半数最大效应浓度(EC 50) 标准答案：能引起50％最大效应的浓度。 31、(L)半数致死量(LD 50) 标准答案：能引起50%实验动物死亡的剂量。 32、(M)半数中毒量(TD 50) 标准答案：能引起50％实验动物中毒的剂量。 33、(M)效能 标准答案：继续增加浓度或剂量而效应不再继续上升称为效能(即最大效应)。 34、(M)效价强度 标准答案：指能引起等效反应(一般采用50％效应量)的相对浓度或剂量。 35、(M)构效关系 标准答案：指药物的化学结构与药物效应之间的关系，其中药物的化学结构包括药物的基本骨架、活性基团、侧链长短、立体构型等。 36、(M)受体 是一类介导细胞信号转导的功能蛋白质能识别其周围环境中某种微量化学物质，药物与之结合后通过中介信息转导与放大，可触发生理反应与药理效应。 37、(L)配体能与受体特异性结合的物质。 38、(M)激动药 能激活受体的配体称为激动药，受体激动药对相应受体有较强的亲和力，也有较强的内在活性。 39、(M)内源性配体 标准答案：如神经递质、激素、自身活性物质等能与受体特异性结合的物质。 40、(L)拮抗药 标准答案：能阻断受体的配体称为拮抗药。 41、(L)竞争性拮抗药 能与激动药互相竞争，与受体呈可逆性结合的药物。 42、(H)拮抗参数(pA2) 标准答案：使激动药剂量加倍而效应维持不变所需的竞争性拮抗药浓度的负对数。 43、(M)非竞争性拮抗药 标准答案：与受体牢固结合，结合后分解缓慢或呈不可逆性结合的药物；在量效曲线中E max下降， K D不变。 44、(H)部分激动药 标准答案:药物与受体有亲和力，但内在活性有限，具有激动药与拮抗药两重性，当激动药小剂量时，其效应与激动药协同，达到E max时，则与激动药竞争受体而呈竞争性拮抗作用关系。 45、(H)药物当量与生物当量 标准答案：前者指不同制剂所含的药量相等；后者指药物不同制剂能达到相同血药浓度的剂量比值。 46、(M)协同作用 指联合应用两种或两种以上药物以达到增加疗效的目的。 47、(M)拮抗作用 指联合用药以到减少药物不良反应的目的。 48、(M)配伍禁忌
葡萄糖醛酸及其内酯制备方法的研究进展 陈 辉 和娴娴 （河北科技大学石家庄 050018) 摘 要：对葡萄糖醛酸及其内酯的制备方法进行了简单的介绍,讨论了各方法的局限性,并且对其工艺进行分析。结合贵金属铂催化剂对葡甲苷的伯羟基进行选择性催化氧化，合成葡萄糖醛酸及其内酯的工艺进行讨论。指出催化氧化法合成葡萄糖醛酸及其内酯反应工艺条件温和、催化活性好、氧化选择性高，具有较好的工业应用前景。 关键词：葡萄糖醛酸 制备方法 催化氧化 研究进展 The research progress of preparation methods on glucuronic acid and its lactone CHEN hui ,HE xian xian (The hebei university of science and technology, hebei shijiazhuang 050018) Abstract: The preparation methods of glucuronic acid and its lactone is introducted briefly, and the process is analyzed. The catalyst used in this study was a combination of the noble metal palladium which had the advantage of selectively oxidizing primary hydroxide radical which was a unique assistant oxidant．It was conclued that the catalytic oxiding technology had some industrial feasibilitywith the moderate condition and the high oxidative selectivity． Key Words: glucuronic acid; preparation methods；catalytic oxidation; research progress 引言 葡萄糖醛酸的分子结构为葡萄糖6位上的醇基被羧基置换。在人和动物体内，葡萄糖醛酸是以尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的活性供体的形式存在的。在微生物中，葡萄糖醛酸常以细菌分泌的多糖形式出现，个别细菌也有从6-磷酸葡萄糖经过肌醇形成游离的葡萄糖醛酸的途径。以葡萄糖醛酸为基础, 制备了与铂的络合物具有抗肿瘤活性作用的药物[1]。在肝脏中以葡萄糖醛酸盐或配合物的形式存在葡萄糖醛酸能与含有羟基、羧基、巯基等有毒物质结合，形成无毒或低毒的配合物而由尿排出[2]。 葡萄糖醛酸内酯，其化学成分为：D-(+)-呋喃葡萄糖醛酸γ-内酯[3]，分子式为C6H8O6。在植物体内内酯通常以与其它碳水化合物形成聚合物形式存在；在人体器官中，形成无毒或低毒的葡糖醛酸结合物而由尿排出，起到保护肝脏及解毒作用，因此可作为一种肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，是常规的保肝护肝良药。除在医药领域的应用外，葡醛内酯及其后续产品还是功能性饮料和食品、减肥药、化妆品等的主要添加剂，具有补充体能、改善缺氧、滋养肌肤、延缓衰老的功效，其市场需求量已经远远超过在医药领域的需求[4]。 1 葡萄糖醛酸及内酯制备方法概述 现行生产工艺中一般以多糖( 如淀粉)为原料，通过不同的氧化剂来氧化其结构单元中的伯
头发中乙基葡萄糖醛酸苷分析的研究进展 施妍1,2,向平1，沈保华1，沈敏1 （1.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063； 2.复旦大学上海医学院法医系，上海200032） 摘要：乙基葡萄糖醛酸酐（ethyl glucuronide ，EtG ）为乙醇的体内代谢物，摄入的乙醇大约0.02%～0.06%以EtG 的形式排出，其消除时间较乙醇缓慢，即使当乙醇在体内完全消除后，EtG 仍可作为酒精滥用的生物学标志。测定头发中的EtG 可延长检测时限，获取饮酒史的信息，在法庭科学和临床医学领域已成为研究热点。头发中EtG 的检测主要采用以串联质谱为主的高灵敏的分析方法，且注重头发采样、去污、水解、提取、分析等各环节的质量控制,避免出现假阳性结果。头发中EtG 的研究结果可广泛应用于法庭科学、临床医学、征兵、招工、驾驶能力测试等领域。关键词：EtG ；头发分析；串联质谱；酒精滥用中图分类号：DF795.1文献标志码：A 文章编号：1671-2072-（2009）03-0024-07 Review of Ethyl Glucuronide in Hair Analysis SHI Yan 1,2,XIANG Ping 1,SHEN Bao-hua 1,SHEN Min 1 (1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,Shanghai 200063,China ； 2.Shanghai Medical College of Fudan University,Shanghai 200032,China) Abstract:Ethyl glucuronide (EtG)is a minor metabolite of ethanol,which only represents 0.02%-0.06%of the total ethanol intake.Following alcohol intake,EtG is reported to be detectable for an extended period of time after the complete elimination of ethanol from the body,so it can be used as a marker of alcohol abuse.Its detection in hair has become a hot subject of re -search in both clinical and forensic context for the purpose of alcohol abuse monitoring.The hair analysis of EtG requires more sensitive methods for its low concentration,which needs to be carried out by LC -MS/MS or GC -MS/MS.Special attentions should be paid in the decontamination procedures of hair sampling,washing and extracting to avoid a false positive result.Moreover,EtG concentration in hair may help to estimate the daily alcohol intake and can confirm abstinence,so it can be widely used in forensic science,treatment programs,workplaces,schools,troops as well as driving ability test to provide legal proof of drinking. Key words :ethyl glucuronide (EtG);hair analysis;tandem mass-spectrum (MS/MS);alcohol abuse 收稿日期：2009-01-09 基金项目：国家科技部公益基金资助项目（2007GY0701），正谊学者项目（JYE101001）。 作者简介：施妍(1984-)，女，博士研究生。E －mail:ydeedyx@ https://www.doczj.com/doc/28807800.html,. 通信作者：沈敏(1955-)，女，研究员，博士生导师。 酒精滥用是众多国家存在的社会问题之一。多年来，国内外学者们都在致力寻找并研究合适的生物学标记物，用以评估酒精滥用情况，其中乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide ，EtG ）就是近年来被广泛关注的一种重要的酒精滥用判断指标[1]。 EtG 是乙醇的体内代谢物之一，在体内可以进入 头发，并在头发中累积。由于头发样品易采集、易保存，根据头发长度还可以检测数月乃至数年内的酒精滥用情况，提供长程信息，因此头发中EtG 的分析弥补了血液和尿液分析的不足。检测头发中的EtG 可以反映被测者的酒精滥用史状况，区分日常饮酒与酗酒，因而成为近年来法庭科学和临床医学领域的研究 热点，其研究成果不仅适用于法医学领域，还可用于临床医学，职业卫生学等方面[2]。 但是，头发中EtG 的质量分数极低，要求分析方法有极高的灵敏度和可靠性。近年来的研究，从头发采样、去污、水解、提取到串联质谱分析，各环节条件不断优化，方法灵敏度逐渐提高，最低检测限（limit of detection,LOD ）从最初的2ng/mg [3]已达0.7pg/mg [4]， 大大拓展了方法的应用范围。本综述旨在对1993年以来建立的头发中EtG 的分析方法作一比较分析，并阐述该研究成果的应用价值和应用状况。 1EtG 的生物学特性及体内代谢 EtG 是不挥发的、水溶性的、非氧化性的乙醇代 谢物，相对分子质量为222，分子式为C 8H 14O 7，结构式如图1，其沸点约为150℃。 乙醇进入体内后大约90%~95%在肝中被氧化成乙醛，而仅有约0.02%~0.06%以EtG 的形式消除[5]。 鉴定科学 Research Paper
Songling s1210322 姜黄素的生物代谢产物在小鼠体内减少及葡萄糖醛酸结合研究 MIN-HSIUNG PAN, TSANG-MIAO HUANG, AND JEN-KUN LIN Institute of Biochemistry, College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, Republic of China; Y ung-Shin Pharmaceutical Ind. Co., Ta-Cha, Taiwan, Republic of China (Received March 17, 1998; accepted December 10, 1998) This paper is available online at https://www.doczj.com/doc/28807800.html, 摘要 姜黄素，存在于姜黄和咖喱中的黄色颜料，具有抗氧化和抗癌活动。在本项研究中，我们考察了姜黄素在小鼠体内的药代动力学性质。在腹腔注射给予小鼠0.1g/kg的姜黄素，在15min后血浆中姜黄素的量为2.25微克每毫升。给药一小时后，在肠道，脾脏，肝脏和肾脏的姜黄素分别是177.04 ，26.06 ，26.90 ，7.51毫克/克。在脑中存在的药物仅为0.41毫克/克。为了阐明姜黄素的代谢产物的本质，由反相HPLC等离子体鉴定两个假定共轭物。用β-葡萄糖醛酸苷酶的等离子体处理导致在这两个假定的共轭物浓度减少和随之而来的四氢姜黄素（THC ）和姜黄素的出现。为了研究这些葡萄糖醛酸化产物的体内过程，由电喷射分析血浆样品。由二级质谱分析这些代谢物的化学结构，建议姜黄素第一个生物转化二氢姜黄素和THC ，随后
货号: QS2626 规格：50管/48样β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase，β-GD）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： β-GD广泛存在于动物组织中，是一种参与肿瘤侵袭和转移过程的基质降解酶，具有水解固醇葡萄糖醛酸和酸性粘多糖等生理功能。该酶在肝细胞中含量较高。此外在胃癌组织中含量丰富，测定胃液β-GD活性对于研究胃癌具有重要的意义。 测定原理： β-GD催化苯酚β-D-葡萄糖醛酸产生游离的酚酞，通过测定苯酚含量反应该酶活性高低。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂仍-20℃保存； 试剂三：液体37.5mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：1μmol/mL标准储备液10mL，4℃保存； 样品测定的前处理： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 注意：标准管和空白管只需测一次。 β-GD活性计算： 第1页，共2页
（1）按样本鲜重计算： 单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生 1μmol酚酞的量为一个活力单位。 β-GD（μmol/h/g 鲜重）= (C标准管×V1)×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=2×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷W （2）按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1μmol酚酞的量为一个活力单位。 β-GD（μmol/h /mg prot）= (C标准管×V1)×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=2×（A测定管-A空白管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr C标准管：标准管浓度， 1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。 第2页，共2页
B-葡萄糖醛酸苷酶活性影响因素的探讨 杨 光 (山东农业大学动物科技学院 泰安 271018)李振清 (滨州职业学院生物工程系兽医教研室) 李建基 (扬州大学畜牧兽医学院) 摘要 探讨实验室条件下人工培植牛黄过程中,温度、pH值、钙、乙二醇等因素对B-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,结果表明,温度升高可显著提高该酶的活性(P<0.01),且在55℃时,其活性比在37℃提高近4.1倍;该酶的最适pH值为7.0;Ca2+在0.5～10m Mo l/L浓度范围内对该酶具有激活作用且与浓度成正比,在10mM ol/L时其激活作用最大;乙二醇在0.3～3M ol/L的浓度范围内对该酶具有激活作用,其最适浓度为1.5Mo l/L。 关键词 大肠杆菌 B-葡萄糖醛酸苷酶 温度 pH值 钙 乙二醇 在人工培植牛黄的研究中,如何提高培植牛黄的产量和质量成为研究的热点。牛黄中胆红素和胆酸含量是评价牛黄质量优劣的标准,因此促进胆汁中结合胆红素的水解和游离胆红素钙的沉淀是提高牛黄质量的关键。埃希氏大肠杆菌可以产生B-葡萄糖醛苷酶(B-G酶),可作为牛黄菌种,其酶活性的高低对牛黄产量和质量有重大影响。目前国内在牛黄菌种的筛选、驯化等方面报道较多,但在如何提高B-G的活性这一方面还鲜有研究。为了探讨促进B-G活性的因素,为提高培植牛黄的产量和质量提供科学依据,特进行该项试验。 1 材料方法 1.1 牛黄菌种 采用5种血清型的大肠杆菌,编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,其中Ⅰ、Ⅱ组为本院预防兽医学系微生物教研室提供;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为本课题组保存菌种。 1.2 试剂 beta-GLUCOSIDASE:Worthington,批号, J1K697J;pHenolpHthalein m ono-B-g lucosiduronic acid:SIGM A,批号,229-896-3;酚酞(A.R.):上海化学试剂站分装厂,批号,871217;氯化钙(C. R.):天津市四通化工厂,批号,20020206;乙二醇(A.R.):上海试剂总厂第三分厂,批号,860919;氨基乙酸(B.R.):山东济宁化工研究所,批号, 890118。1.3 仪器 721-100型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)、SY21-Ni型电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司产)、1702型电子分析天平(德国产)、7DL -40B型台式离心机(上海安亨科学仪器厂产)、JY99-2D型超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司产)。 1.4 样品处理 将5种血清型大肠杆菌菌种依次接种于10%、20%、30%、40%、50%、60%的自制胆汁琼脂培养基中进行耐胆汁驯化培养,再经营养肉汤培养基增菌培养后用超声波细胞破碎机处理15min,然后经3000r pm离心5min后,将上所得上清液置于5支试管内保存于-4℃冰箱中,作为酶源进行酶活性测定。 1.5 酶活性测定 酚酞葡萄糖醛酸在B-G作用下分解为酚酞和葡萄糖醛酸,酚酞在碱性溶液中显红色,且红色的深浅与酚酞的量成正比。通过比色法由标准曲线得出酚酞含量,然后按下式计算酶的活性单位。 酚酞量(L g) 318.33×1000× 1000ml 0.2× 1 120=国际单位B-G活性用每分钟、每升检测样品水解底物释放出10-6mol的酚酞为一个国际单位。具体操作步骤见表1。 1.6 不同温度条件下酶活性变化的试验 在37℃、40℃、55℃3个温度条件下,用上述方法分别测定样品的酶活性,观察不同温度条件下酶活性的变化,从而确定最适反应温度。 1.7 不同pH值的系列缓冲剂中酶活性变化的试验 在pH= 4.0～6.5的醋酸盐缓冲液、pH= 5.5～8.0的磷酸盐缓冲液和pH=3.0～4.5柠檬酸-磷酸二氢钾缓冲液这3种缓冲液环境中,分别测定样品的酶活性,观察其活性的变化规律,从而确定最适pH值。 4山东畜牧兽医
诊断名词解释 公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
诊断学名词解释 1)暗示性提问：是一种能为患者提供带倾向性的特定答案的提问方式 2)主诉：患者感受最主要的痛苦或最明显的症状或体征，也就是本次就诊的主要原因以 及患病到就诊的时间。 3)发热（fever）当抗体在致热源作用下或各种原因引起体温调节中枢的功能障碍时， 体温升高超出正常范围，称为发热。 4)稽留热（ontinued fever）指体温恒定地维持在39—40℃以上的高水平，达数天或 数周，24小时内体温波动范围不超过1℃。 5)弛张型（remittent fever）或败血症热型指体温常在39℃以上，波动幅度大，24小 时内波动范围超过2℃，且都在正常水平以上。 6)间歇热型（intermittent fever）指体温骤升达高峰后持续数小时，又迅速至正常水 平，无热期（间歇期）可持续1天至数天，如此高热期与无热期反复交替出现。 7)波状型（undulant fever）指体温逐渐上升达39℃或以上，数天后又逐渐下降至正 常水平，持续数天后又逐渐升高，如此反复多次。 8)回归热（recurrent fever）指体温急骤上升至39℃或以上，持续数天后又骤然下降 至正常水平，高热期与无热期各持续若干天后规律性交替一次。 9)不规则热（irregular fever）指发热的体温曲线无一定规律。 10)咳嗽：是一种保护性反射动作。 11)咳痰：是通过咳嗽动作，将呼吸道内病理性分泌物排出口腔外的病态现象。 12)咯血：是指喉及喉以下的呼吸器官出血，经咳嗽从口腔排体外 13)牵涉痛：来自内脏的痛觉冲动直接激发脊髓体表感觉神经元，引起相应体表区域的痛 感，称牵涉痛。 14)发绀（又称紫绀）：是指血液中还原血红蛋白增多，使皮肤、粘膜呈青紫色的表现。 15)中心性发绀：是指由于心、肺疾病导致SaO2降低引起的发绀。
设计说明 此住房坐落于黑河学院小区0#的户型，是居住与休闲很好地方，交通发达，人口众多流动量大，餐饮，娱乐都很方便。方案面积为150-180平方米（四室一厅三卫）本方案是围绕现代简约为主题，适合于三代人共同生活的典型住宅，再加上简欧式的设计元素在里面。相互结合，相交融。以简洁明快的设计风格为主调，简洁和实用是现代简约风格的基本特点。简约风格已经大行其道几年了，仍然保持很猛的势头，这是因为人们装修时总希望在经济、实用、舒适的同时，体现一定的文化品味。而简约风格不仅注重居室的实用性，而且还体现出了现代社会生活的精致与个性，符合现代人的生活品位。全面考虑，在总体布局上方面尽量满足业主生活的需求，主要装修材料以樱桃木，壁纸为主，以樱桃木的优美含蓄，壁纸的朴素大方来装饰墙面的景点。更体现现代简约的之感。创造一个温馨，健康的家庭环境。 在功能方面，客厅是主任品味的象征，体现了主人品格，地位，也是交友娱乐的场合，沙发背景墙只做了简单的处理，用细木工板贴上黑色的亚克力板，做了一个悬挂的台面，上面可以放装饰画等，一些装饰品非常实用。与黑白色的沙发相呼应，客厅与餐厅相通，在客厅的一面做了一个玄关，避免了在客厅直接看到餐厅的问题。顶部的吊顶简单大方，三面是暖色的灯带，中间是一盏美丽立漂亮的水晶灯，顶部与墙面，实木的木地板衔接的非常美丽。 四个卧室当中的主卧附带一个主卧卫生间，老人房也附带一个略小 的卫生间，着重装修的是主卧室，主卧室铺的白胡桃色的木地板，主卧室我用了大量的壁纸，壁纸以暖色调为主，应为它具有色彩多样、图案丰富、价格适宜、耐脏、耐擦洗等主要优点。可以充分体现主人的品味，让主人有一个舒适温暖的卧室。然后我用黑胡桃色的实木装饰条装饰墙面，把墙面分成格格，再加上局部的软包，和工艺布帘整个卧室及舒适又漂亮。另一个卧室为附卧房没有过多的装修，只是在墙漆上做了变化，儿童房也是简约现代风格。还有一个佣人房，也可以当做客房。 书房设计要制造出安静，高雅，明亮的书香气息同时又要提供书写，阅读，创作，研究，和存放书刊的条件，书房最为阅读写字的场合，对于采光照明的条件很高。因为人在强，弱的光照下学习都会对眼造成伤害，所以书做应放在阳光充足但不直射的窗边，这样工作学习累了可以对着窗外眺望一下缓解一下疲劳。书房除了顶棚灯和台灯外，书柜用了射灯，便于主任阅读和查找书籍。地面为实木地板。书房运用的大面积的书柜及解决了储书的需要又充分体现主人的个性。餐厅是家居生活的心脏，不仅要美观，更重要的实用性，整体性。餐厅的灯光很重要既不能太强又不能太弱，灯光则以温馨和暖的黄色为基调，顶部做了简单的吊顶。墙面贴了局部壁纸，在餐桌的墙面上作了一个台面，可以摆放一些饰品，可以增加以下餐厅的情调。餐厅的垭口用实木套做了装修。 简洁和实用是现代简约风格的基本特点。加上传统的中式风格让人感觉舒适和恬静，适度的装饰是家居不缺乏时代气息，使人在在空间 得到精神和身体的放松，并紧跟着时尚的步伐，也满足的现代人‘混搭’的乐趣。 简约、质朴的设计风格是众多人群所喜爱的，生活在繁杂多变的世界里已是烦扰不休，而简单、自然的生活空间却能让人身心舒畅，感到宁静和安逸；藉着室内空间的解构和重组，便可以满足人们对悠然自得的生活的向往和追求，让他们在纷扰的现实生活中找到平衡，缔造出一个令人心弛神往的写意空间。把这种理念融入设计里，摒弃了吹毛求疵的形式美，否定过分的堆砌和浮夸，通过清晰，简明的线条剪裁和素净质朴的家具组合，构建出舒简约欧式装修风格以其典雅、自然、高贵的气质见长，特别是在生活元素多元化的今天，欧式风格的家居设计更以其浪漫的情调备受青睐,质朴的设计风格是众多人群所喜爱的，生活在繁杂多变的世界里已是烦扰不休，而简单、自然的生活空间却能让人身心舒畅，感到宁静和安逸篇二：思密达临床应用