【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体
原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。
希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等
这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充
pET，原核表达金标准（转）
pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点
·是原核蛋白表达引用最多的系统
·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
·真正的调节表达水平的“变阻器”控制
·提供各种不同融合标签和表达系统配置
·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物
·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述
pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，
它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。
有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码的高亲和力lacIq 阻遏蛋白，NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen 提供了λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过l CE6 感染提供T7 RNA 聚合酶。虽然不如用IPTG 诱导λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性T7 lac 启动子
除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET 系统中T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7 启动子和T7 lac 启动子。T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI 的机制（除了抑制lacUV5 ）。含T7 lac 启动子的pET 质粒还具有它们自己的lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。
在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/ 宿主菌组合。
控制诱导的表达水平
在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体/ 宿主菌组合控制T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET 系统还根据诱导物（IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。Tuner 和OrigamiB 宿主菌的lacY 突变使这种控制成为可能。
选择pET 载体
所有的pET 载体均来自pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类pET 质粒，即转录载体和翻译载体：
转录载体（包括pET-21 、pET-23 和pET-24 ）表达目标RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）
翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于BamH I 位点的GGA 、GAT 和ATC 三联体。
选择要点
选择用于表达的pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：
·所表达蛋白的用途
·所表达蛋白的已知信息
·克隆策略
pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。
任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。
由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采PCR 克隆策略时则有不同的考虑。LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。
溶解性和细胞定位
考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。
特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白(Trx.Tag ) 融合。新推出的pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白--Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，trxB 突变株AD494 和BL21 trxB ，或trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（15 -25 °C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。
获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。
一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用Novagen 的蛋白折迭试剂盒) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。pET-31b （+ ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。
满足不同需要的融合标签
如果融合序列不影响应用，生产带有S.Tag 、T7.Tag a 、His.Tag a 和HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，GST.Tag 、S.Tag 和T7.Tag 序列可用于亲和纯化。
使用S.Tag 和GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于1fmol 的融合蛋白。
His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。
CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有CBD clos .Tag a 序列的pET-34b （+ ）和35b （+ ））。因为只有正确重新折迭的CBDs 结合到纤维素基质上，CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。
Nus.Tag 、Trx.Tag 和GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。Nus.Tag 和Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的Origami 宿主菌相容。
各种融合标签和相应pET 载体见列表。一些pET 载体带有数个***的融合标签，作为5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。pET-30 Ek/LIC 、pET-32 Ek/LIC 、pET-34 Ek/LIC 和pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。pET Ek/LIC 载体Combo 试剂盒包括所有4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。
pET NusA 融合系统43.1
在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白
新推出的pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与495aa NusA （Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中4000 个以上蛋白进行可溶性建模，NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同NusA 融合蛋白进行的试验中，大于85% 的表达蛋白都是可溶的。pET-43.1 载体含有Nus.Tag 融合伴侣并与trx/gor 突变体Origami 和OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用pET-43.1 载体和这些trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。
优点
·高可溶性的N- 末端Nus.Tag 融合伴侣
·上游His.Tag a 、S.Tag 和可选择的C- 末端HSV.Tag a 、His.Tag 融合标签
·凝血酶和肠激酶切割位点
·多克隆位点位于所有读码框中
·与AD494 和Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭
pET 宿主菌株感受态细胞
所有pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。
（DE3 ）指宿主为λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5 启动子控制的T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为pLysS 和pLysE 的宿主菌带有编码T7 溶菌酶（为T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的pET 相容性质粒。带有pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET 重组体。带有pLacI 的宿主菌产生额外的抑制pETBlue 和pTriEx 载体基础表达的lac 阻遏蛋白。λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。
AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的质粒。
B834 为BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。
BL21 应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。
BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷BL21 背景上具有与AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 。由于trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的质粒。
BLR 为BL21 的recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174 菌株在K-12 背景上提供了recA 突变。与BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。
NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的K-12 菌株，具有高转化效率、蓝/ 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA 高产的recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的lacI q 阻遏蛋白，NovaBlue 的DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。
Origami 为K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似，Origami （DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高10 倍以上。Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记
bla 的pET 质粒。
Origami B 宿主菌来源于BL21 lacZY 突变株，还带有与原始Origami 菌株相同的TrxB / gor 突变。Origami B 菌株集BL21 、Tuner 和Origami 宿主菌的优点于一体。TrxB 和gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla 的pET 质粒。
Rosetta 宿主菌从BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA 、AGG 、AGA 、CUA 、CCC 和GGA 的tRNAs 。这样Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在Rosetta （DE3 ）pLysS 和Rosetta （DE3 ）pLacI 中，稀有tRNA 基因存在于分别带有T7 溶菌酶和lac 阻遏基因的同一质粒上。
Tuner 菌株为BL21 的lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac 通透酶（lacY ）突变使得IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner （DE3 ）pLacI 菌株与pETBlue 和pTriEx 载体的表达相容。
建议兄弟首先学习本版以前的帖子。
搬出老帖子，我们共同学习一下：
eeflying ：原核表达系统中，哪种载体最好？
原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，
和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。
比如，
１。你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，
２。如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his 或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，
３。最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X切掉HIS,
4。表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。５。是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。
６。你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。
７。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化？
８。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。
９。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。
１０。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。
这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。
YONG:原核表达系统中，哪种载体最好？
载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。
这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：
1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便）
2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达
3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达
此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。
最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。
YONG:关于表达载体
不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。
SDS-PAGE所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Western blotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。
对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达；更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。当然，通过western blotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，western blotting也是蛋白定性的重要指标。
YONG:请教-pET表达
我试着说一下：
1）如何获得非融合高效表达？
高效的非融合表达很多情况下是大肠杆菌表达最愿意看到的结果，如果是可溶性的，可能会让大部分研究者更加兴奋。但理想和现实是有差距的。凭心而论，你做的还是不错的，毕竟看到了高效表达，虽然是包含体，虽然信号肽的切割情况不明，毕竟你可以拿到东西了。可以试一下包含体的复性和纯化，测测活吧！否定一个信心苦苦得出的结果要慎重呀！
下面讨论一下如何实现更高的追求：
首先是老生长谈，影响大肠杆菌表达的因素：
遗传密码偏爱性、mRNA5'二级结构、第二密码子等，参见各种综述和论坛中的帖子。
融合表达优化了上述影响表达的因素，所以更容易成功。很多药用蛋白的表达也采用了融合表达策略，可能是无奈的选择，也可能是为了获得可溶性表达或为了获得有利于初步纯化的性质并成功的解决了酶切或化学切割融合头后目的蛋白的纯化。IL-11就是这样的例子。所
以非融合表达并不是一无是处，关键看有没有办法达到最后的目的。如果是药用蛋白，准备申报临床，最好保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化学切割要非常特异，不要再N端引入新的氨基酸或导致目的蛋白N端不整齐。
非融合表达的N端的Met一般是报批容许的，虽然这不是天然的形式。非融合表达省略了切割融合头的步骤和切割后的纯化步骤，具有成本优势。非融合表达的实现首先需要分析，其次看运气，有时运气因素更多。尽可能把影响基因表达的因素都考虑到并逐个优化要花费很大的精力，但这并不能保证这种优化一定会得到理想的结果，未知的因素和因素之间的作用使得完美的优化方案非常难实现，而且基因本身的因素也不允许随心所欲的优化（比如氨基酸序列不能任意改变）。原核表达的特点就是时间短、花钱少，所以多方案的尝试和理性的分析结合是大多数研究者采用的基本策略。具体到你的实验来说，如果你是要做药用蛋白，在融合表达成功后可以a.纯化一点蛋白，看看N-末端；b.在你的融合头后面引入一个切割位点，切割后产生天然N-末端。选择策略看你们实验室的传统，怎么方便怎么做。有的实验室纯化能力强，有得上游强。不管如何，建立有效的测活方法很关键，这可以为表达策略和纯化策略提供指引。
至于可溶性表达，看情况吧！如果你的包含体复性很成功，不必强求可溶性。降低诱导温度，降低菌生长速度和基因表达速度，降低总表达量，把蛋白导入周质空间和使用具有分子伴侣功能的融合等策略有助于实现可溶性表达，但都没有把握。如果你的蛋白的二硫键非常多，可溶性表达难度会较大。这些一般的原则很多综述或研究论文都有不同角度的表述，关键是结合自己的研究目的和实验室的条件灵活运用。
2）基因往表达载体中克隆失败。可能是克隆的操作问题，也可能是这种表达方式导致的表达对细胞生长有不利影响或重组后的质粒不稳定。
验证克隆操作可以通过载体自连对照解决，如果载体自连后的转化子没有或很少，说明酶切操作没有问题。
如果表达产物对细胞有毒或质粒不稳定就不容易解决了，也许凭经验可以判断原因，但更换载体、宿主或表达方式可能是最常用的方法。
YONG:浅论基因表达系统的选择
因表达是基因工程的重要内容，是工业、医疗和基础研究领域的重要技术。
基因表达系统按照基因表达宿主的性质分为原核表达系统和真核表达系统两类，前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统等，后者主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。
原核表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后加工机制的缺乏，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。
简单单细胞真核生物表达系统以酵母表达系统为代表，其中甲醇酵母具有较大优势（主要包括毕赤酵母Pichia pastoris和汉森酵母Hansenula ploymorpha）。甲醇酵母表达系统主要优点有：表达量高，表达可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，容易实现高密发酵等。缺点是并非所有基因都可以获得高表达，当然，这是几乎所有表达系统的共同问题。
哺乳动物细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，缺点是表达量通常较低，生产成本高。
表达系统选择的根据是研究和开发的目的。具体考虑以下几个方面：
目的基因的来源，如果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主要是考虑到与目的基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱性较
一致。
生产的成本和工艺放大要求。大肠杆菌和毕赤酵母系统生产重组蛋白的成本低，生产工艺较简单，用于规模化生产较有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考虑目的蛋白的活性和小规模纯化制备的方便。
研究周期和可操作性。在这一点上，大肠杆菌优于酵母，酵母优于细胞。
蛋白的用途和用量。对于药品开发，这三种宿主都可以选择，但要考虑到报批的要求。如果是体内用，天然的氨基酸序列较重要，最好不要因为基因表达和蛋白纯化的便利引入融合伴侣，如果是制备抗原用于纯化和体外的活性研究则不必太严格。某些蛋白体内活性需要的剂量并不大，如angiostatin，但是，大肠杆菌或酵母表达的蛋白体内半衰期短，所以蛋白用量较大。
蛋白的天然性质。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，则选择分泌表达较好，毕赤酵母分泌表达优势非常显著。对于大肠杆菌系统来说，其蛋白的分泌机制复杂，除了信号肽之外，有些蛋白的分泌和与成熟蛋白的序列有关，而且大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累。根据蛋白活性的要求，结合其天然的性质，选择表达系统是非常重要的。
知识产权的考虑。如果是研究工作，选择商品化的载体较好，因为同行对这些载体也很了解，对于用这些载体做出来的结果容易比较。如果是开发工作，选择表达系统时最好是把载体的知识产权问题考虑进去，否则可能会受制于人。
总之，选择一种合适的表达系统是开始基因表达工作前的重要步骤，选择的主要依据是研究的目的，结合各种其他参数的综合考虑。这种选择可以充分体现出研究者智慧和风格。
YONG:寻找载体
1）pThioHisA,B,C
Trc 启动子，Thioredoxin融合，IPTG诱导，也可以用NdeI进行非融合表达
https://www.doczj.com/doc/2c10034078.html,
2）pBV220
PLPR***启动子，42度热诱导，EcoRI克隆，非融合表达。
病毒所张智清、候云德等构建，国内很多实验室有。
3）pET系列
T7启动子，IPTG诱导，一般为融合表达，NdeI或NcoI非融合表达
https://www.doczj.com/doc/2c10034078.html,
4）pQE系列载体
T5启动子,IPTG诱导，融合表达
https://www.doczj.com/doc/2c10034078.html,
原核表达载体种类非常多，下表不一定全
Features of E.coli Expression Vectors
Vector Name Promoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Replicon Provider
pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega
pALTER-Ex2 T7 Tet none none Promega
pBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen
pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen
pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen
pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene
pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP Thr，EK ColE1 Stratagene
pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene
pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene
pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen
pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thr ColE1 Stratagene
pET-3a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen
pET-9a-d T7 Kan none none pBR322 Novagen
pET-11a-d T7-lac Amp none none pBR322 Novagen
pET-12a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen
pET-14b T7 Amp N-His Thr pBR322 Novagen
pET-15b T7-lac Amp N-His Thr pBR322 Novagen
pET-16b T7-lac Amp N-His Xa pBR322 Novagen
pET-17b T7 Amp none none pBR322 Novagen
pET-19b T7-lac Amp N-His EK pBR322 Novagen
pET-20b(+) T7 Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen
pET-21a-d(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen
pET-22b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen
pET-23a-d(+) T7 Amp C-His none pBR322 Novagen
pET-24a-d(+) T7-lac Kan C-His none pBR322 Novagen
pET-25b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen
pET-26b(+) T7-lac Kan Signal sequence C-His none pBR322 Novagen
pET-27b(+) T7-lac Kan signal sequence C-His none pBR322 Novagen
pET-28a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr pBR322 Novagen
pET-29a-c(+) T7-lac Kan C-His Thr pBR322 Novagen
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pET-31b(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen
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pET-39b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbA N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-40b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbC N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-41a-c(+) T7-lac Kan GST N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen
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pETBlue-1 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen
pETBlue-2 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen
pETBlue-3 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen
pGEMEX-1 T7 Amp T7 gene 10 none Promega
pGEMEX-2 T7 Amp T7 gene 10 none Promega
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pGEX-2T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia
pGEX-2TK tac Amp GST Thr EK pBR322 Pharmacia
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pGEX-5X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia
pGEX-6P tac Amp GST Pre pBR322 Pharmacia
pHAT10/11/12 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech
pHAT20 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech
pHAT-GFPuv lac Amp N-GFPuv EK pUC Clontech
pKK223-3 tac Amp none none pBR322 Pharmacia
pLEX PL Amp none none pUC Invitrogen
pMAL-c2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB
pMAL-c2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB
pMAL-c2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB
pMAL-p2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB
pMAL-p2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB
pMAL-p2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB
pProEX HT trc Amp N-His TEV Life Technologies
pPROLar.A lac-ara1 Kan N-c-Myc EK p15A Clontech
pPROTet.E LtetO-1 Cam N-c-Myc EK ColE1 Clontech
pQE-9 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen
pQE-16 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen
pQE-30/31/32 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen
pQE-40 T5-lac Amp N-His N-DHFR none ColE1 Qiagen
pQE-60 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen
pQE-70 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen
pQE-80/81/82L T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen
pQE-100 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen
pRSET T7 Amp N-His EK ColE1 Invitrogen
pSE280 trc Amp none none pUC Invitrogen
pSE380 trc Amp none none pUC Invitrogen
pSE420 trc Amp none none pUC Invitrogen
pThioHis trc Amp His-Patch EK Trx ColE1 Invitrogen
pTrc99A trc Amp none none pBR322 Pharmacia
pTrcHis trc Amp N-His EK pUC Invitrogen
pTrcHis2 trc Amp C-His none pUC Invitrogen
pTriEx-1 T7 Amp C-His none pUC Novagen
pTriEx-2 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen
pTrxFus PL Amp Trx EK ColE1 Invitrogen
学到不少东西，希望大家可以继续补充。
^_^，其实我就是希望引出像纤夫这样的高手来讲讲，原核表达确实新手比较挠头，再怎么说也感觉老虎吃天，无从下口。刚才细细看了纤夫所写，受益良多啊！印象中自己做表达，就是实验室有什么就用什么载体，根本不考虑为什么用这个，现在进了单位，才感觉这方面
欠缺太多了
泛泛的说太空洞，大家可以具体问题提出来进行分析。
比如，我先说个困扰我得问题：pGEX-4T－1和pGEX-6p－1有什么区别？没区别肯定不会作为两个商品，那么他们的区别是作甚么的？落实的我们做表达时使用的指导依据是什么？
希望高手指点！！
haoran866 wrote:
泛泛的说太空洞，大家可以具体问题提出来进行分析。
比如，我先说个困扰我得问题：pGEX-4T－1和pGEX-6p－1有什么区别？没区别肯定不会作为两个商品，那么他们的区别是作甚么的？落实的我们做表达时使用的指导依据是什么？
希望高手指点！！
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 （1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 （2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。 （3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
VEGFA 基因重组真核表达载体的构建与表达 吴勇1，刘学刚2，郭嘉诚1，李慧敏1，丁周志1，王亚明1，宋伟3，徐家丽1，赵武1 (蚌埠医学院第一附属医院1．儿科;2．心胸外科;3．超声心动图，安徽蚌埠233004) 摘要：目的构建VEGFA 基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA ，并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T ）中的表达。方法以人 脐血单核细胞的RNA 为模板，采用RT-PCR 技术扩增VEGFA 基因，并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl 中，构建重组真核 表达载体pEGFP-VEGFA 。经限制性核酸内切酶BglII 和SalI 酶切和DNA 测序鉴定后，用脂质体法将pEGFP- VEGFA 转染HEK293T 细胞，转染后24h 和48h 采用荧光显微镜观察pEGFP- VEGFA 的表达。结果pEGFP-VEGFA 被双酶切为4697bp 和1251bp 两条条带，测序结果证实VEGFA 序列与GenBank 公布的VEGFA mRNA 序列完全一致。在经转染的HEK293T 细胞 内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP-VEGFA 成功转染HEK293T 细胞，并在其中得到了表达。结论成功构建重组真核表 达载体pEGFP-VEGFA ，为进一步研究VEGFA 基因的生物学功能奠定了基础。 关键词：血管内皮生长因子A ；基因；遗传载体 Construction and expression of recombinant eukaryotic expression vector of VEGFA gene WU Yong 1，LIU Xue-gang 2，GUO Jia-cheng 1，et al （Department of 1．Pediatrics ；2．Cardiothoracic Surgery ，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ，Bengbu 233004，China ）Abstract ：Objective To construct a recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，and to detect its expression in HEK293Tcells．Methods VEGFA gene was amplified from the total RNA of human umbilical cord blood monocytes by RT-PCR and then directionally inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1in order to construct the recombinant expression vector pEG-FP-VEGFA．The recombinant vector pEGFP-VEGFA was identified by restriction endonuclease BglII and SalI digestion analysis ，and se-quence analysis．The pEGFP-VEGFA was then transfected into the HEK293T cell by lipofectin reagent ，and its expression was detected by fluorescence microscopy at 24and 48h post-transfection．Results The recombinant vector pEGFP-VEGFA was digested into two bands of 4697and 1251bp．Sequencing results showed that the sequence of VEGFA in pEGFP-VEGFA was identical to GenBank VEG-FA accession number NM_001025366．Strong green fluorescence was observed in the HEK293T cells transfected with the pEGFP-VEG-FA ，which showed that the pEGFP-VEGFA had been successfully transfected into the HEK293T cells and acquired expression．Conclu-sion We successfully construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，which lays a foundation to further study the biological function of VEGFA gene． Key words ：vascular endothelial growth factor A ；gene ；genetic vectors 基金项目：安徽省自然科学基金面上项目（No 11040606M198） 作者简介：吴 勇，男，硕士研究生通信作者：赵武，男，博士，副教授，研究方向：小儿血管疾病的临床与基础研究，E-mail ：zhaowuronghai@yahoo．com．cn · 54·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013Jan ;17(1)
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，
重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转 染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹 【摘要】目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5his HER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、连接构建pcDNA6/v5his HER2; 转化大肠杆菌DH5α, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5his HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RT PCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5his HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5his HER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RT PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
【关键词】HER2; 真核表达; 转染 ［Abstract］AIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5his HER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5 his HER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5his HER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RT PCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5his HER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RT PCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5 his HER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.
标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。
载体，质粒，基因表达载体3者有何不同？ 载体是一种运输工具，细胞膜上的蛋白质也是一种载体，其识别很单一，也因此有了选择透过性。 质粒是一种小型环状DNA，广泛存在于微生物中，一般的基因工程中，质粒被用来当做目的基因的运载体，也是一种运输工具。 基因表达载体是目的基因和运载体连接后的产物。 基因表达载体和重组质粒的区别 基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体， 首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。这个重组的DNA分子也叫重组质粒。 就是这样。简单的说，重组质粒是基因表达载体的一种。 生物学上marker是什么意思 从文字上说，标记（Marker），染色体上一个可以被识别的区域（比如限制性内切酶的酶切点，基因的位置等）。标记的遗传能够被检测出来。标记可以是染色体上有表达功能的部分（比如基因），也可以是没有编码蛋白质功能但遗传特性能够被检测出来的部分 从实验上说，marker有两种，一种是基因marker，一种是蛋白质marker。两种marker分别是进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE（蛋白质电泳）所用的标准参照物，用以指示目的基因或者蛋白的大小。 一般常称呼的marker都是指基因marker，即DNA marker DNA Marker 作为一种分子标记(Marker)，构建分子图谱。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。 DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。 现在常用的DNA MARKER有两种，一种是病毒等DNA经过酶切获得的，分子量大小有零有整，另外一种是固定数值的，比如100BP，200BP等。 两种MARKER都不难制作，对于第一种，稍微难一些，主要是要获得病毒等大的基因组片段，然后用适当的酶切，切割完全以后，就能得到相应的图谱。第二中实际上很简单，如果你手头有任何一个载体，而且它的序列完全清楚，那么可以采用PCR的方法获得一系列大小不同的片段，比如上游引物可以使用一个，然后用数数的方法确定下游100BP处的下游引物，扩增出的就是100BP的片段，200BP处的引物就是200BP的片段，依此类推，可以获得一系列不同大小的片段，扩增后，把它们放到一起，就获得了自制的MARKER了
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
常用的哺乳动物细胞表达载体和组成成分 有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。 (1)原核DNA序列：为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。当具备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。 (2)启动子：真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bp到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。启动子的转录效率因细胞而异。因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。 (3)增强子：增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远时仍有活性。许多增强子只能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。 (4)剪接信号：真核基因由许多内含子和外显子组成。被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。一般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能会影响邻近拼接位点的使用效率，在替换外显子时应注意。 (5)终止信号和多聚腺苷化的信号：转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。为了保证目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表达载体上必须包括多聚腺苷化下游的一段序列。最常用的方法是用SV40的一段237bp长的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信号。另一种的方法是将全长cDNA与已组装在表达载体上一个顺式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信号。 （6）遗传标记：从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
原核表达操作步骤及注意事项 时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 （1）制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 （二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。 （3）SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020
实验方法与步骤 1 表达质粒的构建及测序分析 1.1 cofilin-1的片段的准备 1.1.1 引物设计 根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下： 引物名称序列 F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′ R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。 1.1.2 cofilin-1片段PCR 1 反应体系： 2.5μl KOD polymerase(3’-5’核酸外 切酶活性) KOD polymerase buffer 5μl MgSO4 2.5μl DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl dNTPMixture 5μl PrimerF（底物） 1.5μl PrimerR 1.5μl Template（模板）5μl ddH2O 25μl Total 50μl 2PCR反应条件：
①94℃预变性3min ②94℃退火30s ③65℃延伸40s ④68℃40s ⑤go to②30个循环 ⑥68℃5min ⑦4℃forever 3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测 （1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。 （2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。 （3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。 4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收： （1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。 （2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。 （3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。 （4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，