多克隆抗体的原理及制作方法
一、原理
多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未
成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。
二、材料
（一）动物选择
根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的
物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没
有明显的损伤。
（二）抗原
制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构
象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。比如用于筛选细菌cDNA表达
文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印
迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。
（三）佐剂
佐剂是能非特异性增强抗原免疫原性，也可改变免疫应答类型的物质。它通过改变抗原物理性状，延长抗原在体内存留时间，增强APC对抗原的呈递和处理能力，刺激淋巴细胞增殖从而扩大免疫应答反应。目前常用的佐剂有以下几种：①福氏佐剂（Freund adjuvant，FA），是一种最常用的油包水（water-in-oil）佐剂。根据加或不加灭活分枝杆菌而分为完全福氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）。CFA 含有羊毛脂、矿物质油和灭活分枝杆菌，不但能增强免疫原性，也能改变免疫应答的类型；IFA中仅含羊毛脂和矿物质油，可增强抗原免疫原性。值得注意的是，CFA是极强的炎性物质，尤其是注射到皮内或眼睛可能引起严重皮肤腐烂或视力丧失。因此处理CFA时需使用手套和保护性眼罩。②生物来源的佐剂如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、细菌内毒素、大肠埃希菌脂多糖、植物血凝素等。③无机化合物佐剂如氢氧化铝、钾明矾等。④人工合成佐剂如多聚肌苷酸-多聚胞苷酸［poly（IC）］、多聚腺苷酸-多聚尿苷酸［poly（A-U）］、脂质体和CpG寡核苷酸佐剂等。免疫佐剂常与抗原同时注入动物体内。选择安全有效的佐剂用于动物免疫是备受关注的问题。福氏佐剂因其免疫效果可靠能获得较高的抗体滴度而广泛地使用了50余年。然而，由于这种佐剂的使用常给动物带来一定程度的痛苦和不适，研究者在积极寻找相应替代品。本节主要介绍福氏佐剂免疫法（CFA/IFA免疫法）。
三、免疫步骤（CFA/IFA免疫法）
1.佐剂的制备福氏完全佐剂和不完全佐剂可以选择市售品，也可以自制。自制福氏佐剂时，将液状石蜡与羊毛脂按5∶3比例混合（也有研究者使用的比例为3∶5，佐剂中羊毛脂含量高，与抗原混合后研磨时，较易达到油包水状态），煮沸或高压灭菌，趁热混匀，即成不完全佐剂。在油相中加入卡介苗，使其终浓度为0.25mg/ml，即为福氏完全佐剂。自制佐剂在室温保存过程中，福氏佐剂会变得浓稠，卡介苗常沉淀于容器底部，使用前需要水浴加热，充分混匀。
2.免疫前动物采血，分离血清作为对照。
3.免疫抗原的准备充分混匀CFA。用PBS（不要使用含Tris的缓冲液）溶解蛋白抗原至0.25～0.5mg/ml，加2ml CFA至2ml蛋白抗原中，制备的免疫原足够免疫4只家兔和80只小鼠。
4.用3ml玻璃注射器（19-G针头）吸取CFA/抗原混合物。移去针头，尽可能排除空气，将注射器连上接合器或三通旋塞，在另一头连上一个空的3ml玻璃注射器。推动注射器栓，使混合物从一个注射器进入另一个注射器，如此反复来回推动。直到混合物颜色变白成为“油包水”状的乳化悬液。去掉接合器或旋塞，接上21-G针头，将一小滴乳液滴在50ml冷水的表面，检测乳状物是否稳定。乳化好的油包水乳状液应该在水面上结合很紧，形成乳滴；如果乳滴很快分散，则需重复上述操作来混匀抗原以形成乳状物。另一种做法：将抗原与佐剂混合物置于乳钵中研磨，使其成为油包水状态。我们的经验是在冰浴中研磨，或将其保持在低温状态，易于得到抗原/佐剂油包水乳
液免疫抗原的准备。
5.将全部抗原佐剂乳液移到一个注射器中，接上22-G针头到注射器并去除气泡。
6.固定动物将佐剂/抗原乳液注射到动物体内。常用的免疫途径有：皮内、皮下、肌肉、淋巴结、腹腔、足垫等。初次免疫一般选择吸收缓慢的途径，以延长抗原刺激时间。免疫家兔时，多选择背部多点皮下注射（10～20个点），免疫小鼠多用腹腔注射。
7.初次免疫10～14天后抽取少量静脉血，分离血清。
8.按以上步骤2～4准备抗原进行加强免疫，加强免疫用IFA为佐剂。
9.初次免疫2～8周后开始加强免疫，7～14天后抽取血样，分离血清。
10.加强免疫间隔时间为1～2周，连续加强数次。初次免疫前后、每次加强免疫后，均需采集动物血样并分离血清检测抗体滴度。
四、分离血清
免疫完成后即可给动物放血，放血前动物应禁食24小时。采血方法参见第四十三章“免疫细胞分离纯化技术”。
1.将血样装在离心管或平皿中于室温放置4小时或4℃过夜，直到形成血凝块。
2.用一根木棒从离心管或平皿侧面轻轻拨动血凝块，然后用木棒
除去血凝块。
3.将血清转移到50ml离心管中。4℃，4000r/min离心10分钟，沉淀血细胞和碎片，立即吸出血清。
4.通过免疫印迹法、免疫沉淀、ELISA、双向免疫扩散等方法测定抗体滴度和特异性。
5.血清分装，保存于-20℃。合格的抗血清经56℃30分钟加热处理，加入适当的防腐剂后分装保存于-20℃，数月至数年内效价无明显变化。防腐剂可用0.8g/L硫柳汞、1.0g/L酚、1.0g/L三甲酚、0.5g/L 氯仿、1.0g/L叠氮钠（均为终浓度）。也可采用中性甘油保存，抗血清加入等容积中性甘油（每100ml甘油中加Na2HPO4•12H2O 2～3g，沸水浴中使溶），充分混匀后分装小份，置-20℃保存。抗体效价2～3年内可保持不变。
多克隆抗体的原理及制作方法 一、原理 多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未 成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。 二、材料 （一）动物选择 根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的
物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没 有明显的损伤。 （二）抗原 制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构 象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。比如用于筛选细菌cDNA表达 文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印 迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。 （三）佐剂
多克隆抗体制备免疫小鼠 简介 多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。 流程 多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤： 1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原， 可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。 2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠 体内，观察免疫反应情况。 3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清， 获得抗体。 4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试 验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术， 对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。 关键步骤 抗原制备 抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。以下是一些常见的抗原制备方法： •纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。 •重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。 •合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。 适当的佐剂 适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的
活化。常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。 免疫小鼠免疫 将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等 方式将抗原注射到小鼠体内。注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。 血液采集和抗体收集 一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。 抗体筛选和纯化 获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进 行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。筛选出特异性较好的抗体后，可以通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择 实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠1.5g左右，21天断乳时12～15g，至2月龄体重达20g以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α'、β'、α'β'和O型四种。α'、α'β'型易产生人A型抗体，β'、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞A型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α'β'血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕 冷，寿命为15年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学 等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1．3R原则 3R指的是reduction(减少)、replacement(替代)和refinement(优化)。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素： (一)动物种系 免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原） 上海师范大学 实验报告 专业、年级生物科学班级姓名学号 课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期 基本原理 免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。 材料 (一)动物：健康雄性家兔2只 (二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。 (三)试剂 1.灭菌生理盐水； 2.纯化人IgG(10mg／ml)； 3.消毒酒精及碘酒； 4.弗氏不完全佐剂（FCA） 5.弗氏完全佐剂（FIA） 6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 免疫方法
1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤； 2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称 FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。 3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。 4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。 5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另 外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。首次注射后一周或稍长时间再次进行加强注射，可大大增强免疫应答。 对免疫原性弱的抗原，需要多次注射(注射5-6次)，可以在适当的时间间隔内，有效的控制抗体效价的增加。 放血 颈动脉放血 将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。 分离血清 将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。 结果鉴定
单克隆抗体与基因工程抗体的制备技术 掌握： 1.杂交瘤技术的基本原理 2.抗体工程的基本技术 一、单克隆抗体技术（Monoclonal antibody，McAb） （一）概述： 克隆（clone）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程称为克隆。 多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb）：大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）：由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体 − −→ 单个克隆→ B − ）淋巴细胞 化学性质单一、特异性 强的抗体（单克隆抗体 细胞群 ①哺乳动物在感染病原体后，体内会形成多种相应的B淋巴细胞（浆细胞），因而产生多种特异性抗体。 ②每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。 多克隆抗体：劣势：均一性差、特异性低、排斥副反应强。 单克隆抗体：优势：活性专一、特异性强、纯度高、副反应弱。 （二）杂交瘤技术的基本原理 1.杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。 2.细胞的选择与融合： (1)亲本1：经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。 (2)亲本2：肿瘤细胞，通常选择多发性骨髓瘤细胞（Sp2/0）。其具备以下特点为： ①与B细胞为同一体系，可增加融合的成功率 ②稳定、易培养 ③自身不分泌Ig或CK ④融合率高 ⑤是HGPRT缺陷株 3.融合剂（fusogen） ①引起融合的病毒：副粘病毒 ②化学制剂：聚乙二醇（PEG） ③细胞电融合技术：电脉冲 （三）选择培养基的应用 1.细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况： ①脾细胞与瘤细胞 ②瘤细胞与瘤细胞 ③脾细胞与脾细胞 ④未融合的瘤细胞 ⑤未融合的脾细胞 ⑥细胞多聚体形式 2.杂交瘤细胞的选择性培养基——HAT培养基 细胞的DNA合成一般有两条途径： (1)主要途径： 糖和氨基酸→核苷酸→DNA (2) 替代途径：
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。 一、抗原的选择 在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。 二、免疫小动物 免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。 三、免疫过程 免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。 四、细胞融合与筛选 经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。 五、生产与纯化 经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。 六、性质鉴定与应用 纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体的应用及现状 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体群体，与单克隆抗体相比具有更强的多样性和高度的特异性。多克隆抗体广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域，成为重要的实验和临床工具。本文将从多克隆抗体的制备、应用以及现状三个方面进行详细介绍。 首先，多克隆抗体的制备是实现其应用的基础。多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：首先，将目标抗原免疫动物（如兔、小鼠等）多次注射，刺激其产生特异性抗体。然后，从动物体内收集血清，分离抗体。接着，将抗体与大量不同的抗原冲突，筛选出特异性较高的抗体克隆。最后，对特异性较高的抗体进行扩增和提纯，得到多克隆抗体。 多克隆抗体的应用广泛涉及多个领域。在生物医学研究中，多克隆抗体常用于蛋白质表达与定位、蛋白质相互作用和信号转导的研究。例如，通过使用多克隆抗体可以检测特定蛋白在细胞内的定位和表达水平，进一步了解其功能及参与的生物过程。此外，多克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和流式细胞术等实验技术，以便更全面地研究生物学问题。 在临床诊断中，多克隆抗体也有重要应用。多克隆抗体可以用于特定抗原的定量测定，如肿瘤标志物的测定、感染病原体的检测等。同时，多克隆抗体也可以用于免疫组织化学检测，辅助病理诊断。另外，多克隆抗体还广泛应用于临床病原体的荧光染色和免疫组化检测，用于快速定位和识别病原体，提高诊断效率。
在治疗领域，多克隆抗体已经取得了巨大的成功。多克隆抗体可以用于治疗多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。通过靶向特定抗原，多克隆抗体可以选择性地破坏癌细胞，抑制肿瘤生长和转移。此外，多克隆抗体还可以通过激活免疫系统来增强机体对疾病的免疫反应。近年来，许多多克隆抗体药物已经获得上市和临床使用，成为治疗疾病的重要手段。 然而，多克隆抗体也存在一些局限性和挑战。首先，多克隆抗体制备过程中存在批次差异，导致抗体的特异性和亲和力有一定的波动性。此外，多克隆抗体的批量生产和提纯成本较高，难以大规模应用。为了解决这些问题，近年来，单克隆抗体的发展和应用得到了快速发展。单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有更强的特异性和一致性。单克隆抗体已经成为当前生物医学研究和临床治疗的主流。 综上所述，多克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。随着单克隆抗体技术的不断发展和改进，预计多克隆抗体将逐渐被单克隆抗体所取代。然而，多克隆抗体作为一种重要的研究工具和药物，仍然存在一定的应用空间，并且在某些特定情况下可能仍然是更好的选择。因此，多克隆抗体的研究和应用仍然具有重要意义，在未来仍将继续发展。
抗体的制备及检测和豚鼠超敏实验 小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备及检测&豚鼠超敏实验实验报告 实验一：小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备及检测 【实验原理】： 一、小鼠抗绵羊红细胞抗体（多克隆抗体）的制备： 特异性体液免疫应答中，抗原可刺激机体产生特异性抗体。每个抗原分子表面常带有多种不同的抗原决定簇（表位），可被机体内不同特异性的B细胞克隆识别并产生不同特异性的抗体。因此以抗原免疫动物所产生的免疫血清实际上是针对该抗原表面不同表位的多种抗体的混合物，又称为多克隆抗体。 用纯化抗原免疫动物是制备多克隆抗体的常用方法。免疫血清的效价和特异性主要取决于抗原和实验动物两方面的因素。欲获得高效价的免疫血清，需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性；并适时地加强免疫以诱导机体的再次应答。欲获得高特异性的免疫血清，则必须保证抗原的纯度，在条件许可的范围内应对抗原进行最大限度的纯化。此外，抗原的剂量、免疫途径、免疫时间以及动物和佐剂的选择等，都是影响免疫血清效价和特异性的重要因素。 二、小鼠抗绵羊红细胞抗体的检测（酶联免疫吸附实验） 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。具有灵敏度高、特异性强、快速方便等优点，是免疫学技术中应用最广的方法之一。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量检测，即酶联免疫吸附实验（ELISA），亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶联免疫组织化学技术。酶与抗体或抗原后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。 根据检测目的和操作步骤不同，ELISA有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。本次实验使用间接法对小鼠抗绵羊红细胞抗体的检测。
实验一小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备与检测 实验原理：特异性免疫应答中，抗原可刺激机体产生特异性抗体。抗原免疫动物所产生的免疫血清实际上是针对该抗原表面不同表位的多种抗原的混合物，又称为多克隆抗体。 用纯化抗原免疫动物是制备多克隆抗体的常用方法。免疫血清的效价和特异性主要取决于抗原和实验动物两方面的因素。欲获得高效价的免疫血清，需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性；并适时地加强免疫以诱导机体的再次应答。欲获得高特异性的免疫血清，则必须保证抗原的纯度，在条件许可的范围内应对抗原进行最大限度的纯化。此外，抗原的剂量、免疫途径、免疫时间以及动物和佐剂的选择等，都是影响免疫血清效价和特异性的重要因素。实验步骤： 1、SRBC的制备：脱纤维防凝处理的绵羊血，加入适量生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，再加入适量的生理盐水混匀，2000r/min离心5min，弃上清，利用生理盐水分别配制成上述浓度——20%SRBC、25%SRBC、30%SRBC、40%SRBC。 2、免疫小鼠：利用上述不同浓度的SRBC悬液给小鼠免疫，腹股沟皮下注射，每周1次，连续3周，每次0.1ml。注意做好标志。 3、溶血素的检测 （1）第4周，摘眼球取血，将血置于4℃冰箱内5~10min。 （2）5000r/min离心5~10min。 （3）按表进行试验。 （4）全部加完后混匀，置于37℃水浴中30min。 4、结果判定：首先判定第7管，出现不溶血现象，说明对照正确。然后判定1~6管如果出现溶血，说明试验成功，血清里含有溶血素。若未出现溶血则说明血清里不含有溶血素或含量太低未检测出来。 实验结果：左边为20%的实验组，右边为40%的实验组，1~4里分别加的是空白、阴性、阳性、待测血清。其中显色的3、4号为阳性，1、2号为阴性。 结果分析：根据4个管的颜色可知，待测小鼠血清为阳性，说明小鼠血清中含有抗绵阳红细胞抗原的抗体。但是左边3号颜色比右边深，可能是在实验过程中操作不当所致。 实验二豚鼠过敏实验——I型超敏反应 实验原理：超敏反应是指已致敏的机体再次接触相同变应原时，所引起的自身组织损伤和（或）生理功能紊乱。超敏反应是异常的或病理性的免疫应答。I型超敏反应又称为速发型超敏反应或变态反应。 在I型超敏反应中，变应原首次进入机体，刺激浆细胞产生IgE，IgE的Fc段与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面的FcɛR结合，使得IgE吸附在这些细胞的表面，这是致敏阶段。当相同的变应原再次进入致敏机体时，即可与吸附在这些细胞表面的IgE结合，引起一系列反应，使这些细胞释放组胺等生物活性介质，引起I型超敏反应的发作，即发敏阶段。组胺是一个主要的生物活性介质，它的迅速释放，能扩张小血管和增加毛细血管通透性、刺激平滑肌收缩、促进黏膜腺体分泌增加；导致血压下降、呼吸困难、腹痛，甚至引起过敏性休克，导致死亡。 实验方法： 1、致敏注射：在实验开始前2周，给豚鼠注射皮下注射1ml稀释的蛋清。 2、发敏注射：固定好豚鼠，找到心尖搏动处，用碘酒、乙醇溶液依次消毒后，给豚鼠心内注射1ml稀释的蛋清。放开豚鼠，观察反应情况。
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，
我需要纯化一多克隆抗体.抗原是GST融合蛋白. 不知道谁有抗体纯化手册,给小妹一些建议好吗?不胜感谢 回复 抗体的纯化有很多中方法，帮你整理一些供你参考。 一、硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 （一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； （二）沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 （三）透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
抗体的制备 一、实验目的 掌握抗体制备的实验原理和方法。 二、实验原理 三、实验试剂及器材 四、操作步骤 将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液，4000rmp离心10min，弃上清，得到血浆，即抗体。 抗体的制备、鉴定、纯化及纯度鉴定 一、实验目的 ⒈加深对抗体基本知识的了解。 ⒉了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 1、抗体的制备 一、实验原理
当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
抗体的制备方法与原理 抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）选择免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等，多用家兔和山羊。因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。 用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为雄性。 若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是弗氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全弗氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。 1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。 ⑴弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA） 羊毛脂 1 份 石蜡油 5 份 混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。 ⑵弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA） 弗氏不完全佐剂10ml 卡介苗10mg～200mg 卡介苗可100℃10min灭活处理。 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一