免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的抗体有哪些？
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
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免疫细胞化学技术
一、免疫细胞化学技术的概述
*免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）
-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。
（一）对抗原和抗体的要求
*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
-对抗体的要求：纯度高、比活性强；
*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
（二）抗原（antigen, Ag）
*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
-免疫原性：引起机体产生抗体和（或）致敏淋细胞的特性；
-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
*根据抗原是否显示免疫原性分为：
-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体
*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
-常用的载体有钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。
（三）抗体（antibody, Ab）
1、抗体的概念：
*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
-抗体主要存在于血清内；
-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
-特异性强、抗体产量高。
*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
-特异性低，会产生抗体的交叉反应。
-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
*动物的选择
*佐剂（adjuvant）
*免疫方法
*免疫剂量
*抗体效价的测定
*放血或定期抽血
（1）动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
*所需抗血清的量
-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
*能供免疫用的抗原量
-小鼠50?g足够，而山羊需要几毫克。
（1）动物的选择（续）
*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性）为最常用。
（2）佐剂（adjuvant）
*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:
-弗氏不完全佐剂（Freund＇s incomplete adjuvant）
-弗氏完全佐剂（Freund＇s complete adjuvant）
弗氏不完全佐剂
（Freund＇s incomplete adjuvant, FIA）
*是由油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂（Freund＇s complete adjuvant, FCA）
*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌（终浓度为2～20mg/ml），即成为FCA。
*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后（油包水）注入动物。
-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法（续）
*注射器混合法
-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
*缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法（续）
*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
-每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
*优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上（冷水中），如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
（3）免疫方法——免疫途径
*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
*一般采用多点注射方法
-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
（3）免疫方法——免疫途径（续）
*几点说明：
-大动物一般不用腹腔注射
-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100?g抗原即可获得较好的免疫效果。
-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
（3）免疫方法——次数及间隔时间
*次数一般为2～3次（初次免疫和加强免疫）
-首次注射后，10～15天再加强注射；
-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
*初次免疫
-用50～200?g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
*两周后，加强免疫
-将50～200?g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
*一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml（卡介苗每兔合5mg）；
-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50?g；
-末次注射两周后兔耳放血测价（可达1:128）。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
*初次免疫
-用10～100?g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点0.lml，也可肌肉内或皮下注射；*加强免疫
-每隔7～8天，将10～50?g Ag于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
*抗体效价的检测
（4）免疫剂量
*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
（4）免疫剂量（续）
*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
（5）抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
*优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
*将玻璃板用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
*将1％agar 融化后，置56℃水浴。
*在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔（直径3rnm），孔间距10mm。
*中心孔加5?l 抗原样品，周围孔内每孔加5?l 抗血清（抗体预先作系列倍比稀释即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例）。
*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
*观察结果。
抗体效价检测的其它方法
*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
*酶联免疫吸附试验（ELISA）。
放血或定期抽血
常用以下3种方法
*颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
*心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
*静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
放血或定期抽血（续）
*采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
*血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白（例如蛋白水解酶）将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
*加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
二、组织和细胞标本的制备
*标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件
*免疫组化对组织和细胞标本的要求
-保持所检标本原有的结构、形态；
-在原位最大程度地保持待测抗原（或抗体）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。
*免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。
-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。
免疫组化中常用的组织和细胞标本
*组织标本
-石蜡切片
-冰冻切片
*细胞标本
-组织印片
-细胞培养片（细胞爬片）
-细胞涂片
（一）石蜡切片
*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；
-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。
*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。
*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。
-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。
1、取材的特殊要求及注意事项（续）
*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；
-镊取组织动作要轻；
-经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。
2、固定及常用的固定液
*取材后的组织需立刻投于固定剂中
-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
-对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
-醇类（常用乙醇）
-其它（丙酮）
（1）醛类
*甲醛（福尔马林）应用最广
-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
-缺点：
*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
*分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
-注意事项：
*缩短固定时间，降低固定温度（4?C），为此组织块不宜过厚。
*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
*固定后充分水洗以减少分子间交联。
*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现（抗原修复）。
*戊二醛：
-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
*多聚甲醛（常用4%）：
-可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等。
（2）醇类
* 最常用的醇类固定剂是乙醇。
-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
-优点：穿透性强、抗原性保存好。
-缺点：
*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长（2h内）。*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
（3）其它固定剂
*丙酮：
-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
3、抗原修复——原因
*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
*化学方法
*加热方法
-水浴加热法
-微波照射法
-高压加热法
-酸水解法
（1）化学方法
*主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
-胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05％～0.1％，消化时间为37?C，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；
-胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4％，消化时间为37?C、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。
*例如：Laminin、CollagenIV
（2）水浴加热法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。
-优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，
-缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。
（3）微波照射法
*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。
*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。
（4）高压加热法暴露抗原
*将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压
*由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。
（1）酸水解法
*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
*将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min（温度升高，作用时间缩短）。
*此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
*达到规定的温度（92～95?C以上）；
*维持一定的时间；
*避免切片干涸（抗原可能完全丢失）；
*加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；
*修复液：
-最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；
-最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液（pH8.0）。
4、载玻片的处理
*抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。
-新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。
*常用的粘附剂有：
-APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）
-Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）
-铬明胶溶液
APES（3-aminopropyltriethoxysilane）
3-氨丙基三乙氧基硅烷
*现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES（v/v）;
*将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；
*取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60?C烤箱烤干。Polv-L-Lysine （多聚赖氨酸）
*将清洁玻片浸于100?g/ml（10%w/v）的多聚赖氨酸溶液中（去离子水稀释），37?C放置30min，然后60?C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。
铬明胶溶液
*试剂：铬明矾（chrome alum）0.25g
明胶（gelatine）2.5g
蒸馏水500ml
*先将铬明矾溶解于40?C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 ?C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。
*用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。
（二）冰冻切片
*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
-缩短了制片时间
-抗原性不受损失
*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
*液氮中冰冻：组织投入液氮中（一196?C）中10～20sec；
*干冰中加入丙酮（或异戊烷），液体立即气化起泡，温度降至一70?C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；
-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。
-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 ?C冰箱。
2、切片
*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。
*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；
*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 ?C 。切片厚度一般为4～8?m。
3、切片后处理
*切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4?C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。
（三）组织印片
*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。
（四）细胞培养片（细胞爬片）
*贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定（丙酮-20?C固定10～20min），再进行免疫染色。
-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。
-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。
（五）细胞涂片
*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：
-血液、尿液、脑脊液；
-体腔积液；
-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织
-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。
（五）细胞涂片（续）
*细胞涂片的方法：
-手涂法
*将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。
*图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。
-涂片机涂片法
*将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100?l （1～2×104～5cells）加入涂
片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
三、免疫组化常用的染色方法
*根据标记物的不同分为
-（一）免疫荧光法
-（二）免疫酶标法
-（三）亲和组织化学法
（一）免疫荧光法
【原理】
*用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；
*荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；
*借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
*（1）异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）
*（2）四甲基异硫氰酸罗丹明（Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC）
*（3）四乙基罗丹明（RB200）
*（4）碘化丙啶（propidium iodide, PI）
（1）异硫氰酸荧光素（FITC）
*易溶于水和乙醇。
*最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm．呈翠绿色荧光，分子量389.4。
*在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15～20个FITC分子。
（2）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
*最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444。
*与蛋白质结合的方式同FITC。
（3）四乙基罗丹明（RB200）
*不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。
*最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595～600nm，呈橙红色荧光，分子量为580。*RB200在五氯化磷（PCl5）作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸?-氨基反应而标记在蛋白分子上。
（4）碘化丙啶（PI）
*是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色。
*PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择。
*最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
*一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
-一般认为0～4?C可保存1～2年，-20?C可保存3～4年。
-要小量分装，防止反复冻融。
-保存前需加防腐剂（浓度为1:5000～10000的硫柳汞或1:1000～5000叠氮化钠）。
3、免疫荧光的染色方法
*免疫荧光染色法常用的有
-直接法
-间接法
①原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应（用来检测未知抗原）。
②直接免疫荧光法的操作步骤
*标本的处理：
-细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST （含0.l%TritonX-100 pH 7.4）漂洗5min ×3/次；
-石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min ×3/次；
*2%BSA或10%BSA37?C湿盒内封闭30min
*抗体染色：
-在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体（1:8或1:16稀释），放在湿盒中，37?C孵育30min；?直接免疫荧光法的操作步骤（续）
*0.0lmol/L PBS（pH 7.4）漂洗5min ×3/次，不时震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。
*缓冲甘油封片
-分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
*镜检：在荧光显微镜下观察。
*优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
*缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
?直接免疫荧光法的注意事项
*对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
*一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
?直接免疫荧光法的注意事项（续）
*染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
-染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
-染色温度：多采用室温（25?C），高于37?C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2?C的低温，延长染色时间。
-低温染色过夜较37 ?C 30 min效果好的多。
?直接免疫荧光法的注意事项（续）
*试验时需设置下列对照：
-自发荧光对照（空白对照）：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
-阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
-特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
*若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
?直接免疫荧光法的注意事项（续）
*一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
*经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
（2）间接法又称为荧光抗-抗体法
? 需要两种抗体参与，即一抗和二抗（荧光素标记）。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
-可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
?间接免疫荧光法操作步骤
*标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
*一抗染色：
-加未标记的特异性抗体（通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释），37?C作用30min 或4?C过夜。
*0.01M PBST漂洗5min×3次（震荡漂洗）；
?间接免疫荧光法操作步骤（续）
* 加荧光标记的二抗抗体，37?C湿盒避光作用30min。
*0.01M PBST避光漂洗5min×3次（例如包上锡纸，在摇床上漂洗）；
*甘油缓冲液封片
*镜检
*优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；*缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。
?间接免疫荧光法的注意事项
*荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
*每次试验时，需设置以下三种对照：
-阳性对照：阳性血清+荧光标记物
-阴性对照：阴性血清+荧光标记物
-荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
?间接免疫荧光法的注意事项（续）
*标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
*一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
（二）免疫酶酶标法
【原理】
*以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；
*酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。
1、常用的标记酶及其显色底物
*辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）及底物
*碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）及底物
（1）辣根过氧化物酶（HRP）及底物
*HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；
*底物为过氧化物和供氢体（DH2）
-过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。
-供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化型染料，最常用的供氢体是DAB。
DAB （二氨基联苯胺）
*DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。
*目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。
（2）碱性磷酸酶（AP）及底物
*AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：
-偶氮偶联反应，底物为?-萘酚磷酸盐，经水解后得?-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝（fast blue）或坚牢红（fast red）形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。
-靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP），经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑（NBT）在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。
2、常用的免疫酶染色方法
*又分为以下两种方法：
-酶标抗体法
*直接法
*间接法
-非标记抗体酶法
*酶桥法
*PAP法
（1）酶标抗体法
*通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。
-优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。
-缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。
（1）酶标抗体法——直接法
? 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。
（1）酶标抗体法——间接法
*将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标抗体）与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。
酶标抗体间接法的操作步骤
*标本准备：
-石蜡脱蜡至水；
-冰冻切片浸入4?C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min×3；
-细胞爬片先用PBS洗，然后4?C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；
*石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；
（2）酶标抗体间接法的操作步骤（续）
*封闭内源性过氧化物酶：3％H2O2-甲醇溶液室温孵育5～10min （湿盒内）；
*0.01M PBST漂洗，5min×3；
*5～10%正常山羊血清（0.01M PBS稀释）封闭，室温孵育30min （湿盒内）；
*倾去血清勿洗，加1％BSA（PBST配制）稀释的一抗，37?C孵育60min 或4?C过夜（湿盒内）；
（2）酶标抗体间接法的操作步骤（续）
*0.01M PBST漂洗，5min×3；
*加HRP标记的二抗室温孵育lh或37?C 30min ；
*加0.01％H2O2~0.05％DAB显色（显色液应新鲜配置）；
*经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。
（2）非标记抗体酶法——酶桥法
*首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；
*以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；
*再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布
-优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。几点说明
*一抗（假设来自种属A）的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。
*二抗——桥抗体（抗种属A的IgG抗体）应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。
*因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。
（2）非标记抗体酶法——PAP法
* 与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;
*PAP是离体制备的复合物（HRP－－抗HRP）。
*显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。
PAP法评价
*PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。
-缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。
*由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。
（三）亲和组织化学法
*是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。
*这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位。
生物素—抗生物素染色法
【原理】
*生物素（biotin）又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。
*抗生物素（avidin），又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。
*两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。
-该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。
（1）标记抗生物素—生物素法（labelled avidin-biotin method, LA：分为直接法和间接法。*直接法
用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。
* 间接法
用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一
抗体相连结，最后进行呈色反应。
（2）桥抗生物素一生物素法（bridge avidin-biotin method，BRA
-此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。（3）抗生物素-生物素-过氧化物酶法
（ABC法）
*ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法。
*ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。*分为直接法和间接法。
-直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；
-间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。
ABC法的评价
*敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高20~40倍。
*特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。
*方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。
*由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。
1 、简述补体系统的组成与主要生物学功能。 组成： ①补体系统的固有成分 ②补体调节蛋白 ③补体受体 功能：补体旁路途径在感染早期发挥作用，经典途径在感染中、晚期发挥作用。 ①、细胞毒作用：参与宿主抗感染、抗肿瘤； ②、调理作用： C3b/C4b 可作为非特异性调理素介导调理作用； ③、免疫复合物清除作用：将免疫复合物随血流运输到肝脏，被吞噬细胞清除； ④、炎症介质作用：C3a/C5a 的过敏毒素作用、 C5a 的趋化和激活作用、 C2a 的激肽样作用，引起炎症性充血和水肿； ⑤、参与特异性免疫应答。 2 、补体激活的三个途径： 经典途径： ①激活物为抗原或免疫复合物， C1q 识别 ② C3 转化酶和 C5 转化酶分别是 C4b2a 和 C4b2a3b ③其启动有赖于特异性抗体产生，故在感染后期或恢复期才能发挥作用，或参与抵御相同病原体再次感染机体 旁路途径： ①激活物为细菌、真菌或病毒感染细胞等，直接激活 C3 ② C3 转化酶和 C5 转化酶分别是 C3bBb 和 C3bBb3b ③其启动无需抗体产生，故在感染早期或初次感染就能发挥作用 ④存在正反馈放大环 MBL （凝激素）途径： ①激活物非常广泛，主要是多种病原微生物表面的 N 氨基半乳糖或甘露糖，由MBL 识别 ②除识别机制有别于经典途径外，后续过程基本相同
③其无需抗体即可激活补体，故在感染早期或对免疫个体发挥抗感染效应 ④对上两种途径具有交叉促进作用 3 、三条补体激活途径的过程及比较： 经典途径 / 旁路途径 /MBL 途径 激活物：抗原抗体复合物 / 内毒素、酵母多糖、凝聚 IgA/ 病原微生物、糖类配体 参与成分： C1-C9/ C3 、 C5-C9 、 B 、 D 、 P/ C2-C9 、 MBL 、 MASP C3 转化酶： C4b2a/ C3bBb/C4b 2a 、 C3bBb C5 转化酶： C4b 2a 3b/ C3bBb3b/ C4b 2a 3b 、 C3bBb3b 作用：特异性免疫 / 非特异性免疫 / 非特异性免疫 4 、试述补体经典激活途径的全过程。 经典激活途径指主要由 C1q 与激活物（ IC ）结合后，顺序活化 C1r 、 C1s 、 C4 、C2 、 C3 ，形成 C3 转化酶（ C4b2b ）与 C5 转化酶（ C4b2b3b ）的级联酶促反应过程。它是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。 5 、补体系统可通过以下方式介导炎症反应 激肽样作用： C2a 能增加血管通透性，引起炎症性充血； 过敏毒素作用： C3a 、 C4a 、 C5a 可使肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺等介质，引起炎症性充血、水肿； 趋化作用： C3a ，C5a 能吸引中性粒细胞和单核巨噬细胞等向炎症部位聚集，引起炎性细胞侵润。 6 、简述补体参与宿主早期抗感染免疫的方式。 第一，溶解细胞、细菌和病毒。通过三条途径激活补体，形成攻膜复合体，从而导致靶细胞的溶解 第二，调理作用，补体激活过程中产生的 C3b 、 C4b 、 iC3b 能促进吞噬细胞的吞噬功能。 第三，引起炎症反应。补体激活过程中产生了具有炎症作用的活性片断，其中，C3a C5a 具有过敏毒素作用， C3a C5a C567 具有趋化作用。 7.简述I g生物学功能。 一、V区功能
第一节抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区的沟槽分子表面的结构互性与亲合性而结合的。 一、抗原抗体的结合力 抗原抗体间结合为非共价键结合，有四种分子间引力参与。 （1）静电引力：是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力。这种引力的大小与两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。 （2）范德华引力：是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力。能促使抗原抗体相互结合，这种引力的能量小于静电引力。 （3）氢键结合力：是抗体上亲水基团与相应抗原彼此接近时，相互间可形成氢键，使抗原抗体相互结合。氢键结合力较范德华引力强。 （4）疏水作用力：是抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，促进其结合。疏水作用力是这些力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大。 二、抗原抗体的亲合性和亲合力 亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适应而存在的引力，它是抗原抗体之间固有的结合力，可用平衡常数K来表示：K=K1/K2，K值越大，亲合性越高；亲合性越高，与抗原结合越牢。 抗体的亲合力是指抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关，即所谓多价优势，如IgG为两价，亲合力为单价的103倍，IgM为5～10价，亲合力为单价的107倍。由于抗原抗体的结合反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反之即容易解离。 二、亲水胶体转化为疏水胶体 大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，在溶液中这些残基带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云并形成了水化层，由于电荷的相斥，就避免了蛋白质分子间靠拢、凝集和沉淀。当抗原抗体结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。
转载某理工大学讲义，如果有更新的研究文章更好，呵呵 第一节抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表 位 )与抗体超变区的 沟槽分子表面的结构互性与亲合性而结合的。 一、抗原抗体的结合力抗原抗体间结合为非共价键结合，有四种分子间引力参与。 (1)静电引力：是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力。这种引力的大小与两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。 (2)范登华引力：是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力。能促使抗原抗体相互结合，这种引力的能量小于静电引力。 (3)氢键结合力：是抗体上亲水基团与相应抗原彼此接近时，相互间可形成氢键，使抗原抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强。 (4)疏水作用力：是抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，促进其结合。疏水作用力是这些力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大。 二、抗原抗体的亲合性和亲合力亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适应而存在的引力，它是抗原抗体之间固有的结合力，可用平衡常数 K 来表示： K=K1/K2 ，K 值越大，亲合性越高；亲合性越高，与抗原结合越牢。抗体的亲合力是指抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关，即所谓多价优势，如 IgG 为两价，亲合力为单价的103倍，IgM为5?10价，亲合力为单价的 107倍。由于抗原抗体的结合反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反之即容易解离。 三、亲水胶体转化为疏水胶体大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，在溶液中这些残基带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云并形成了水化层，由于电荷的相斥，就避免了蛋白质分子间靠拢、凝集和沉淀。当抗原抗体结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如NaCI，则进一步使疏水胶体物相互 靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 第二节抗原抗体反应的特点 一、特异性抗原抗体的特异性是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由两者之间查问结构互补决定的。抗体分子VH 区和 VL 区上 各自具有的三个高变区共同组成抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的槽沟，决定了抗体的特异性。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测相应的抗体或抗原。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现交叉反应。 二、比例性比例性是指抗原抗体特异性结合时，生成结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见的反应。因此在进行抗原抗体试验时，抗原抗体反应比例最合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时，称为后带。
《动物微生物及免疫学》复习题 一、多选题 1.中枢免疫器官有ABD A 胸腺 B 腔上囊 C 脾脏 D 骨髓 2.中枢免疫器官的特点有ACD A 胚胎早期出现 B 胚胎晚期出现 C 控制机体免疫反应 D 能诱导淋巴细胞分化 3.抗原具有BD A 特异性 B 免疫原性 C 专一性 D 反应原性 4.抗原按性质分为AC A 完全抗原 B 自身抗原 C 不完全抗原 D 异嗜抗原 5. 全菌抗原或整个病毒粒子抗原所制备的血清为C A 多联血清 B 单价血清 C多价血清D --- 6.免疫球蛋白的种类有ABCD A IgG B IgM C IgA D IgE 7.单克隆抗体的特点ABCD A纯度高 B专一性强 C 重复性好 D能在动物体内外持续产生同质性抗体 8.抗体具有亲细胞性质，能与下列细胞结合ABC A 肥大细胞 B T细胞 C B细胞 D 神经细胞 9. 血清学反应的类型有ABCD A 凝集反应 B 沉淀反应 C 中和反应 D 补体结合反应 10.沉淀反应的类型有ABC A 电泳 B 琼脂扩散试验 C 环状沉淀试验 D ELISA 11.试管凝集的特点有ACD A 方法简单 B 特异性不强 C 可定性 D 可定量 12.常用于检测炭疽病的实验方法是B A 琼脂扩散试验 B 环状沉淀反应 C 对流免疫电泳 D 血凝试验 13.间接凝集反应的类型有AD A 乳胶凝集 B 试管凝集 C 平板凝集 D 间接血凝 14.补体结合实验中，如果最终出现溶血现象，其结果应为C A 阳性 B 不确定 C 阴性 D A或B 15.血清学反应的一般特点 AC A 特异性强 B 特异性不强 C 抗原间血缘越近交叉程度越高 D 不会出现带现象 16.免疫原性:能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性 17.下列有关非特异性免疫应答说法正确的有AC A 先天的,遗传的 B 作用慢,范围窄 C 为第一线防御作用 D 有再次反应的能力,有记忆 18.干扰素的特性有AC A 可溶性蛋白 B 对热不稳定 C 对酶敏感 D 对病毒种类有特异性 19.非特异性免疫的防御屏障有BD A 血脑屏障 B 皮肤 C 胎盘屏障 D 黏膜 20.影响非特异性免疫的因素有ABCD A 遗传 B 年龄 C 环境（温度、湿度） D 动物种类 二、名词解释
抗体产生的一般规律
一、抗体产生的一般规律 当第一次用适量抗原给动物免疫，需经一定潜伏期才能在血液中出现抗体，含量低，且维持时间短，很快下降，称这种现象为初次免疫应答。若在抗体下降期再次给以相同抗原免疫时，则发现抗体出现的潜伏期较初次应答明显缩短，抗体含量也随之上升，而且维持时间长，称这种现象为现次免疫应答或回忆应答。由于对抗体分子结构研究的进展，发现初次应答产生的抗体主要是IgM分子，对抗原结合力低，为低亲和性抗体。而再次应答则主要为IgG分子，且为高亲和性抗体。TD抗原可引起再次应答，而TI抗原只能引起初应答。对初次和再次应答现象机制的研究，对抗体特异性、多样性、免疫记忆以及对自身抗原而受性机制等问题的研究，都必须以抗体生成的细胞学为基础（图11-1，表11-2）。 图11-1初次及再次免疫应答 表11－2初次与再次免疫应答特性
特性初次再次 抗原呈递非B细胞B细胞 抗原浓度高低 抗体产生 延迟相5～10天2～5天 Ig类别主要为IgM IgG、IgA等 亲和力低高 无关抗体多少 二、抗体产生的细胞学基础 抗体产生是由多细胞完成的，Miller等在60年代，首先证明了淋巴细胞是不均一的细胞群。他用早期摘除鸡的胸腺和法氏囊的方法证明了有二类不同的的淋巴细胞，即T和B细胞。前者与细胞免疫有关，后者与抗体形成有关（表11-3）。 表11-3 新生期摘除胸腺及法氏囊对免疫功能的影响（鸡） 全身X-线照射周围血淋巴细胞数Ig浓度抗体产生移植物排斥反应 未身X-线照射148 000 ++ +++ ++ 胸腺摘除9 000 ++ + － 法氏囊摘除13 200 －－+ +阳性反应；－阴性反应 Claman给经X-线照射小鼠移入同系骨髓细胞（B细胞来源）和胸腺细胞（T 细胞来源），然后用羊红细胞免疫，结果证明只有同时移入两种细胞才能产生抗体。因此证明了抗体产生需要T和B细胞共同参予。
一、名词解释 1、抗体（Ab）：机体接受抗原刺激后B细胞分化为浆细胞，由浆细胞分泌的一种能与抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 2、补体：存在于人或动物血清屮的一组不耐热、经活化后具有酶活性的蛋白质，由于它是抗体溶菌作用的必要补充，故称补体。 3、超敏反应：源于变态反应，指机体受同一抗原物质再次刺激后产生的一种异常或病理性反应表现为机体生理功能紊乱或组织细胞损伤。 4、半抗原：能与对应抗体结合出现抗原抗体反应、乂不能单独激发人或动物产生抗体的抗原，只有免疫反应性而没有免疫原性，又称作不完全抗体。 5、cutoff值：即临界值，是指被检测分析物的量值，用确定结果高于还是低于临床或分析的决断点。 6、细胞因子（CK）:是由免疫细胞或非免疫细胞合成、分泌的一类小分子多肽或糖蛋白，是一类重要的生物应答调节剂。 7、钩状效应：由于抗原抗体比例严重失调而导致假阴性的现象，其屮抗体过量称为前带效应，抗原过量称为后带效应。 8、主要组织相容性复合体（MHC）:编码主要组织相容性复合物（MHA）的基因是一组呈高度多态性的紧密连锁的基因群，称为主要组织相容性复合体（MHC） o 二、选择题 仁不能激活补体替代途径的物质是 A、细菌内毒素 B、酵母多糖 C、衙聚糖 D、凝聚的IgA E、甘露聚糖 【正确答案】E 【答案解析】由病原微生物等细胞壁成分提供接触面直接激活补体C3,启动替代途径。其激活物主要是细胞壁成分，如肽糖昔脂、多糖及酵母多糖等。 2、免疫应答过程不包括 A、B细胞在骨髄内的分化成熟 B、效应细胞和效应分子的产生和作用
C、T、B细胞的活化、增殖、分化 D、巨噬细胞的抗原的处理和递呈 E、B细胞对抗原的特异性识别 【正确答案】A 【答案解析】免疫应答的基本过程为：①识别阶段：巨噬细胞等抗原递呈细胞对外來抗原或口身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T辅助细胞及相关淋巴细胞的阶段，是诱导细胞活化的开始时期。②淋巴细胞活化阶段：接受抗原信号后的T、B淋巴细胞在一系列免疫分子参与下，发生活化、增殖和分化的阶段。③效应阶段：浆细胞分泌特殊性抗体，执行体液免疫功能；T淋巴细胞中Th细胞分泌细胞因子等效应因子，T杀伤细胞执行细胞毒效应功能。 3、IgE主要的抗体效应是 A、阻断中和作用 B、调理作用 C、裂解细胞作用 D、A DCC E、参与超敏反应 【正确答案】E 【答案解析】IgE为单体结构，正常人血清屮IgE水平在五类lg屮最低，仅为（0.1?0.9） mg/Lo IgE为亲细胞抗体，介导I型超敏反应，在特界性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。 4、在抗体产生的一般规律屮，初次应答产生最早，具有早期诊断价值的lg是 A、I gG B、I gM C> slgA D、I gE E、I gD 【正确答案】B 【答案解析】IgM为五聚体，主要存在于血液中，是lg中分子量最大的。分子结构呈环形，是个体发育最早合成的抗体，也是抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清lgM水平升高，说明近期感染；新生儿脐血中若IgM增高，提示有宫内感染。 5、存在于人和脊椎动物血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白是 A、补体 B、抗体 C、免疫球蛋白 D、细胞因子 E、白细胞介素 【正确答案】A 【答案解析】补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。
医学免疫学与病原生物学 班级：姓名：学号： 一、名词解释： 1．抗原: 2．抗体： 3．ADCC作用： 4．超敏反应： 5．条件致病菌： 6．病毒的复制： 7．脓毒血症： 8．鞭毛： 9．细胞因子： 10.败血症： 二、单项选择题： 1．人类B细胞分化成熟的场所是( ) A．骨髓 B．胸腺 C腔上囊 D．淋巴结 2．正常人体无菌的部位是( ) A．外耳道 B.小肠 C.胆囊 D.眼结膜 3．下列细菌中，繁殖速度最慢的细菌是( ) A.链球菌 B.大肠杆菌 C.破伤风杆菌 D.结核杆菌 4．识别与清除病原微生物是免疫系统的重要功能，这一免疫功能被称为( ) A．免疫监视 B.免疫稳定 C.免疫防御 D.免疫耐受 5．T细胞表面标志不包括( ) A．CD2 B.CD3 C.MHCⅡ类分子 D.有丝分裂原受体6．MHC限制性是指( ) A．抗原与抗体结合受自身MHC限制 B.补体激活受自身MHC控制 C.免疫细胞间相互作用受MHC限制 D.IgG调理巨噬细胞杀伤靶细胞受MHC限制 7．属Ⅰ型超敏反应( ) A．新生儿溶血症 B.血清过敏性休克 C. 血清病 D.系统性红斑狼疮 8．补体参与的超敏反应( ) A．Ⅰ型和Ⅱ型 B.Ⅱ型和Ⅲ型 C.Ⅲ型和Ⅳ型 D.Ⅰ型和Ⅲ型9．Ⅳ型超敏反应特征( ) A．IC沉积血管壁 B.中性粒细胞浸润为主的炎症 C.血管扩张水肿 D.单核细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症 10. 细菌致病性强弱主要取决于细菌的( ) A.基本结构 B．特殊结构 C.分解代谢产物 D．侵袭力和毒素11．对机体非特异性免疫的描述错误的是( ) A.生来在种系发育和进化过程中形成 B.对某种细菌感染针对性强 C对侵入的病原菌最先发挥作用D．生来就有
免疫球蛋白的结构与功能 一、免疫球蛋白分子的基本结构 Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N 端）和羧基端（C端）。 （一）轻链和重链 由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并证明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L链，很容易从患者血液和尿液中分离纯化这种蛋白，并可对来自不同患者的标本进行比较分析，从而为Ig分子氨基酸序列分析提供了良好的材料。 1．轻链（light chain,L）轻链大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。每条轻链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。L链共有两型：kappa(κ)与lambda(λ)，同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的。正常人血清中的κ：λ约为2：1。 2．重链（heavy chain,H链）重链大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和们置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L 链（κ或λ链）组成完整Ig的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。 （二）可变区和恒定区 通过对不同骨髓蛋白或本周蛋白H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现其氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大，称此区为可变区（V），而羧基末端（C-末端）则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区。 1．可变区（variable region,V区）位于L链靠近N端的1/2（约含108～111个氨基酸残基）和H链靠近N端的1/5或1/4（约含118个氨基酸残基）。每个V区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基。V区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于V区中氨基酸的种类为排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。 L链和H链的V区分别称为VL和VH。在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变休程度，这些区域称为高变区（hypervariable region,HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守，称为骨架区（fuamework rugion）。VL 中的高变区有三个，通常分别位于第24～34、50～65、95～102位氨基酸。VL和VH的这三个HVR分别称为HVR1、HVR2和HVR3。经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为决定簇互补区（complementarity-determining regi-on,CDR）。VL和VH的HVR1、HVR2和HVR3又可分别称为CDR1、CDR2和CDR3，一般的CDR3具有更高的高变程度。高变区也是Ig分子独特型决定簇（idiotypic determinants）主要存在的部位。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。 2．恒定区（constant region,C区）位于L链靠近C端的1/2（约含105个氨基酸残基）和H 链靠近C端的3/4区域或4/5区域（约从119位氨基酸至C末端）。H链每个功能区约含110多个氨基酸残基，含有一个由二锍键连接的50～60个氨基酸残基组成的肽环。这个区域氨
滨州医学院 组织胚胎学 目录 第1章绪论 第2章上皮组织 第3章结缔组织 第4章软骨和骨 第5章血液和血细胞发生 第6章肌组织 第7章神经组织 第9章循环系统 第10章免疫系统 第11章皮肤 第12章内分泌系统 第13章消化管 第14章消化腺 第15章呼吸系统 第16章泌尿系统 第18章男性生殖系统 第19章女性生殖系统 第20章胚胎学总论 第1章绪论 一、名词解释 1．组织学：是研究机体微细结构及其相关功能的学科，是在组织、细胞、亚细胞和分子水平上对机体进行的研究。 2. HE染色：利用苏木精和伊红对组织或细胞进行染色的方法。 3. 免疫组织化学技术：利用标记物标记的抗体与组织或细胞的抗原特异性反应，结合形态学观察，对抗原做定性、定量、定位检测的技术。 4. 原位杂交技术：利用有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 5. 嗜酸性:易被酸性染料着色的性质称为嗜酸性。部分细胞质及细胞外基质中的纤维等常呈嗜酸性。 6. 嗜碱性:易被碱性染料着色的性质称为嗜碱性。细胞核、核糖体等常呈嗜碱性。 第2章上皮组织 一、名词解释 1. 微绒毛：是上皮细胞游离面伸出的细小指状突起，电镜下可见绒毛轴心的胞质中有许多纵行的微丝，微丝连于胞质顶部的终末网，微绒毛可扩大细胞表面积，有利于细胞的吸收功能。 2. 纤毛：上皮细胞游离面伸出的较粗长突起，能节律性定向摆动，电镜下纤毛中央为两条单独的微管，周围为9组双联微管。纤毛主要分布于呼吸道等处。 3. 紧密连接：又称闭锁小带。这种连接呈点状、斑状或带状，位于相邻细胞间隙的顶端侧面。紧密连接除有机械连接作用外，还可阻挡细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内，具有屏障作用。 4. 缝隙连接：又称通讯连接，呈斑状，细胞间隙仅2～3nm，内有等间隔连接点，胞膜中有规律分布由6个亚单位并合组成的连接小体，相邻两细胞膜中的连接小体对接，成为细胞间直接交通的管道，利于小分子物质和离子的交换及细胞间信息的传递。 5．桥粒：又称粘着斑。主要存在于上皮细胞间，呈斑状连接，细胞间隙宽，其中含低密度的丝状物，中央有致密的中间线，细胞膜的胞质面有附着板，上附角蛋白丝。桥粒是一种很牢固的细胞连接。
来源：医学全在线更新：2007-12-3 医学论坛 该文章转载自医学全在线：https://www.doczj.com/doc/2818643826.html,/edu/200712/18959.shtml 免疫球蛋白的结构与功能 一、免疫球蛋白分子的基本结构 Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N 端）和羧基端（C端）。 图2-3 免疫球蛋白分子的基本结构示意图 （一）轻链和重链 由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并证明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L链，很容易从患者血液和尿液中分离纯化这种蛋白，并可对来自不同患者的标本进行比较分析，从而为Ig分子氨基酸序列分析提供了良好的材料。 1．轻链（light chain,L）轻链大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。每条轻链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。L链共有两型：
kappa(κ)与lambda(λ)，同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的。正常人血清中的κ：λ约为2：1。 2．重链（heavy chain,H链）重链大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和们置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L 链（κ或λ链）组成完整Ig的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。 （二）可变区和恒定区 通过对不同骨髓蛋白或本周蛋白H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现其氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大，称此区为可变区（V），而羧基末端（C-末端）则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区。 1．可变区（variable region,V区）位于L链靠近N端的1/2（约含108～111个氨基酸残基）和H链靠近N端的1/5或1/4（约含118个氨基酸残基）。每个V区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基。V区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于V区中氨基酸的种类为排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。 L链和H链的V区分别称为VL和VH。在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变休程度，这些区域称为高变区（hypervariable region,HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守，称为骨架区（fuamework rugion）。VL 中的高变区有三个，通常分别位于第24～34、50～65、95～102位氨基酸。VL和VH的这三个HVR分别称为HVR1、HVR2和HVR3。经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为决定簇互补区（complementarity-determining regi-on,CDR）。VL和VH的HVR1、HVR2和HVR3又可分别称为CDR1、CDR2和CDR3，一般的CDR3具有更高的高变程度。高变区也是Ig分子独特型决定簇（idiotypic determinants）主要存在的部位。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。
抗原抗体反应原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表位)和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗 原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。 抗原抗体反应可分为两个阶段:第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应;第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导的肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件(如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等) 的影响。 (一)抗原抗体结合力 抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键，需要四种分子间引力参与。 1.静电引力:又称库伦引力。是因抗原、抗体带有相反电荷的氨基与羧基基团间相互吸引的能力，这种吸引力的大小和两个电荷间的距离平方成反比。两个电荷距离越近，静电引 力越大; 2.范德华引力:这是原子与原子、分子与分子相互接近时分子极化作用发生的一种吸引力，是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，两者电子云中的偶极摆动而产生 的引力。这种引力的能量小于静电引力; 3.氢键结合力:是供氢体上的氢原子与受氢体上氢原子间的引力。其结合力较强于范德 华引力; 4.疏水作用力:水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向医学教。育网收集整，理聚集的力。当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也立即失去，从而排斥两者间的水分子，使抗原抗体进一步吸引和结合。疏水作用力是 这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。 (二)抗原抗体的亲和性和亲和力
动物微生物及免疫学本科复习题及答案 一、多选题 1.中枢免疫器官有ABD A 胸腺 B 腔上囊 C 脾脏 D 骨髓 2.中枢免疫器官的特点有ACD A 胚胎早期出现 B 胚胎晚期出现 C 控制机体免疫反应 D 能诱导淋巴细胞分化 3.抗原具有BD A 特异性 B 免疫原性 C 专一性 D 反应原性 4.抗原按性质分为AC A 完全抗原 B 自身抗原 C 不完全抗原 D 异嗜抗原 5. 全菌抗原或整个病毒粒子抗原所制备的血清为C A 多联血清 B 单价血清C多价血清D --- 6.免疫球蛋白的种类有ABCD A IgG B IgM C IgA D IgE 7.单克隆抗体的特点ABCD A纯度高B专一性强C 重复性好D能在动物体内外持续产生同质性抗体 8.抗体具有亲细胞性质，能与下列细胞结合ABC A 肥大细胞 B T细胞 C B细胞 D 神经细胞 9. 血清学反应的类型有ABCD A 凝集反应 B 沉淀反应 C 中和反应 D 补体结合反应 10.沉淀反应的类型有ABC A 电泳 B 琼脂扩散试验 C 环状沉淀试验 D ELISA 11.试管凝集的特点有ACD A 方法简单 B 特异性不强 C 可定性 D 可定量 12.常用于检测炭疽病的实验方法是B A 琼脂扩散试验 B 环状沉淀反应 C 对流免疫电泳 D 血凝试验 13.间接凝集反应的类型有AD A 乳胶凝集 B 试管凝集 C 平板凝集 D 间接血凝 14.补体结合实验中，如果最终出现溶血现象，其结果应为C A 阳性 B 不确定 C 阴性 D A或B 15.血清学反应的一般特点AC A 特异性强 B 特异性不强 C 抗原间血缘越近交叉程度越高 D 不会出现带现象 16.免疫原性:能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性 17.下列有关非特异性免疫应答说法正确的有AC A 先天的,遗传的 B 作用慢,范围窄 C 为第一线防御作用 D 有再次反应的能力,有记忆 18.干扰素的特性有AC A 可溶性蛋白 B 对热不稳定 C 对酶敏感 D 对病毒种类有特异性 19.非特异性免疫的防御屏障有BD A 血脑屏障 B 皮肤 C 胎盘屏障 D 黏膜 20.影响非特异性免疫的因素有ABCD A 遗传 B 年龄 C 环境（温度、湿度） D 动物种类 二、名词解释 1. 凝集反应：抗体与颗粒性抗原（细菌）反应(1.5分)所出现的肉眼可见的凝集现象表现出来的凝集反应(1.5分) 2. 沉淀反应:抗体与可溶性抗原反应所出现的肉眼可见的沉淀带(2分)，一般可在琼脂板上进行。(1分) 3. ELISA:标记抗体仍具有与抗原结合的能力(1分)，当结合有酶的免疫复合物遇到相应的底物时即可催化底物显色(1分)，根据底物显色的深浅进行测定(1分)。 4. 抗原:凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞(1.5分)，并能与之结合引起特异性反应的物质称为抗原(1.5分) 5. 抗原决定簇:在空间位置上的一些化学机团(1.5分)，即同抗体结合的部位(1.5分)
1. 关于轻链的叙述，哪项是错误的 (A) A、Ig根据V L抗原特异性不同分为两个型 B、Ig的轻链均相同 C、轻链有两型 D、同一个天然Ig分子上两条轻链的型总是相同的 E、人血清中各类Ig所含κ链和λ链的比例约为2:1 2. 免疫球蛋白的结构是由 (D) A、二条相同的重链组成 B、二条多肽链组成 C、以J链连接的一条轻链和一条重链组成 D、二硫键连接的二条相同重链和二条相同轻链组成 E、二硫键连接的一条重链和一条轻连组成 3. 将免疫球蛋白分为两型的根据是 (A) A、轻连恒定区抗原性不同 B、重链恒定区抗原性不同 C、重链可变区抗原性不同 D、轻链可变区抗原性不同 E、超（高）变区抗原性不同 4. 抗体与抗原决定簇互补结合的部位是 (C) A、V H B、C L、C H C、V H、V L中的CDR（HVR） D、V L中的CDR E、Fc段 5. 抗原和抗体特异结合的部位在 (B) A、V H B、V L和V H C、C L和C H D、Fc段 E、C H 6. IgG与FcR结合的功能区是 (D) A、C H2 B、C H1 C、铰链区 D、C H3 E、V H、V L 7. IgG (C) A、在胚胎期即可合成 B、有CH4功能区 C、能通过胎盘 D、B细胞表面抗原识别受体属此类 E、天然血型抗体属此类 8 .铰链区位于 (A)
A、C H1与C H2之间 B、V H与C H1之间 C、C H2与C H3之间 D、C H3与C H4之间 E、V H与C H之间 9. 关于Ig分泌片的特性哪项是错误的? (E) A、以非共价键方式连接两个Ig分子单体 B、由上皮细胞合成和分泌 C、分泌片的功能是保护IgA及介导IgA的转运 D、分泌片与IgA的形成无密切关系 E、主要存在于血清中 10. 人类个体发育过程中，最早合成的免疫球蛋白是 (C) A、IgA B、IgG C、IgM D、IgD E、IgE 11. 免疫球蛋白产生的顺序是 (B) A、IgA-IgG-IgM B、IgM-IgG-IgA C、IgG-IgM-IgA D、IgM-IgA-IgG E、IgA-IgM-IgG 12 .与抗原结合后活化补体能力最强的Ig分子是 (D) A、IgD B、IgG C、IgA D、IgM E、IgE 13. IgG分子中与补体结合的部位存在于 (A) A、C H2 B、C H1 C、C H3 D、C H4 E、V H 14. 能激活补体又能与SPA结合的Ig是 (C) A、IgD B、IgA C、IgG D、IgM E、IgE 15. 合成分泌抗体的细胞是 (A) A、浆细胞
免疫学检验试题（一） 1. 免疫监视功能低下时易发生（）。 A．自身免疫病 B．超敏反应 C．肿瘤 D．免疫缺陷病 E．移植排斥反应 答案C 解析免疫系统的功能之一是对自身偶尔产生的有癌变倾向的细胞进行清除，此即免疫监视功能，免疫监视功能低下时易发生肿瘤。 （ 2. 免疫自稳功能异常可发生（）。 A．病毒持续感染 B．肿瘤 C．超敏反应 D．自身免疫病 E．免疫缺陷病 答案D 解析免疫系统的功能之一是对自身衰老的组织细胞进行清除，此即免疫自稳功能，免疫自稳功能异常可发生自身免疫病。
— 3. 既具有抗原加工提呈作用又具有杀菌作用的细胞是（）。A．树突状细胞 B．巨噬细胞 C．中性粒细胞 D．B细胞 E．T细胞 答案B 解析树突状细胞、巨噬细胞和B细胞都有抗原加工提呈作用，但只有巨噬细胞兼有吞噬杀菌作用。 4. 免疫应答过程不包括（）。 A．T细胞在胸腺内分化成熟 ： B．B细胞对抗原的特异性识别 C．巨噬细胞对抗原的处理和提呈 D．T细胞和B细胞的活化、增殖和分化 E．效应细胞和效应分子的产生和作用 答案A 解析免疫应答过程指免疫系统针对抗原的反应过程，不包括免疫细胞的发育过程。
5. 关于外周免疫器官的叙述，不正确的是（）。 A．包括淋巴结、脾和黏膜相关淋巴组织 B．发生发育的时间晚于中枢免疫器官 — C．是免疫应答发生的场所 D．是免疫细胞发生和成熟的场所 E．是所有淋巴细胞定居的场所 答案D 解析免疫细胞发生和成熟的场所在中枢免疫器官，故D项不正确。 5. 在正常血清中，含量最高的补体成分是（）。 A．C1 B．C3 、 C．C4 D．C5 E．C4Bp 答案B 解析在正常血清中含量最高的补体成分是C3。 7. 细胞因子不包括（）。 A．单核因子
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 抗原抗体反应及应用 不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。 大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体) ，又有反应原性(与特异的抗体相结合) 。 抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。 一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。 抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为类微量，灵敏，快速的检测分析方法。 本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。 第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物) 及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。 同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum) ，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同 B 细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonal antibody) 。 一个 B 细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。 1 / 3
用免疫动物的 B 细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个 B 细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonal antibody) 。 随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibody combinatorial library) 筛选制备单克隆抗体。 应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineering antibody) ，以及催化性抗体(catalytic antibody 或 abozyme) 等的全新的抗体。 一、抗血清的制备 1．免疫动物 (1) 抗原： 免疫动物是制备抗血清的第步。 免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表71。 抗原的用量视抗原种类及动物而异，次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百 g ／次至几 mg／次。 〔2) 佐剂及乳化： 佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。 佐剂有完全和不完全佐剂之分。 完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗) 或棒状杆菌。 福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按 1：
单克隆抗体原理 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 单克隆抗体制备过程 杂交瘤细胞的制备 1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。 2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性 3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。 单克隆抗体的提纯 工业发酵主要类别,乙醇发酵、食品发酵、微生物发酵 发酵工程的一般过程可分为三个步骤：第一，准备阶段；第二，发酵阶 段；第三，产品的分离提取阶段。 为什么说基因工程发酵工程和酶工程之间存在着交叉渗透现象？ 1. 比如想获得某种可以治疗疾病的蛋白酶——这种酶的制备、纯化等过程就属于酶工程。 2. 这种蛋白酶是某生物的某基因的产物，把这个基因克隆构建到载体上——这就属于基因工程。 3. 把基因整合到细胞里面表达，得到这种酶——这就属于细胞工程。 4. 把细胞放到发酵罐中大规模生产——这就属于发酵工程。 利用固定化生物催化剂的优点有很多： ①酶成份可以重复利用； ②适合于连续操作； ③产品中不会掺杂入酶； ④可以更加精确地控制催化过程； ⑤酶的稳定性得到改善或提高； ⑥可发展成多酶反应系统； ⑦减少了下水排放的问题；
抗原抗体反应及其应用 摘要抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。免疫印迹，又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。双转印法、天然电泳及western blot 分析等是最近几年出现的新型蛋白印迹技术。单克隆抗体技术是20世纪后20年内最为重要的生物高技术之一。单克隆抗体药物在肿瘤治疗、抗感染等方面具有重要的作用。关键词抗原抗体反应、Western blotting、单克隆抗体技术 一、抗原抗体反应 抗原抗体反应指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。这种反应既可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的过程是经过一系列的化学和物理变化，包括抗原抗体特异性结合和非特异性促凝聚两个阶段，以及由亲水胶体转为疏水胶体的变化[1]。抗原是能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原表位是抗原上与抗体结合的区域。蛋白质抗原的表位是由相邻的连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构[2]，如图1所示。抗体是指宿主对体内存在的外来分子、微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质。抗体主要由B淋巴细胞系的终末分化细胞-浆细胞产生，并且循环在血液和淋巴液中，在那里与抗原结合。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子。整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。抗体上与抗原表位结合的位点由重链和轻链的可变区构成[3]，如图2所示。抗原抗体复合物通过大量非共价键连接。某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构像改变。研究抗原抗体复合物最有说服力的的方法是抗体-抗原共结晶的X射线衍射技术。