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流式细胞仪操作规程_SOP

流式细胞仪操作规程_SOP
流式细胞仪操作规程_SOP

流式细胞仪操作规程目录

1:淋巴细胞亚群测定及绝对计数

2:活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测

3:HLA-B27测定

4:CD55/CD59测定

5:干细胞检测和绝对计数

6:白血病免疫分型测定

7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8:细胞周期分析

9:活化血小板检测

10:血小板抗体测定

11:红细胞抗体测定

12:粒细胞抗体测定

淋巴细胞亚群测定

(流式细胞仪)

医院检验科

操作规程文件号:

200 年月日起实施

第1版

(共3页)

本规程每2年复审一次

复审日期:年月日

复审人:

规程编写者:

审批者:

批准日期:年月日

文件分发部门和/或个人

院档案室保管者:

检验科主任:

检验科实验室:

淋巴细胞亚群测定

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3色

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(命名,点击save)画图

此图为CD45圈门

填写Flow-Count的浓度

活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定

HLA-B27测定

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sop操作规程

威世半导体(西安)有限公司中国陕西省西安市西安高新开发区新型工业园信息大道20号文件号:SOP-9 修改号:文件名称:电气检修作业安全操作规程第7 页共8 页3.7.4 高处工作时应用带绳传递物料,不得上下抛掷。 3.7.5 顶棚内工作需要照明时,应用安全灯或手电筒照明,不准使用明火或一般照明。3.8 铅酸蓄电池使用保养注意事项3.8.1 搬运蓄电池,必须使用工具车平稳运送,不得多层放置,应轻拿轻放,不得在地面上拖动,应避免剧烈振动。 3.8.2 蓄电池支架必须牢固可靠,防止打滑倾覆。 3.8.3 紧固端子前,应首先检查端子确保无氧化、断裂、变形。固定螺栓螺母外观检查必须做到六方头部完好、螺纹无损坏。紧固前固定螺栓螺母必须涂抹“抗锈成”防腐润滑剂。 3.8.4 端子固定方向应以保证紧固工具不会碰撞其它端子为宜。 3.8.5 拆装、紧固蓄电池端子时,必须使用合适规格的套筒扳手或呆扳手,注意每次旋转角度不得大于60度,以防电极间短路。 3.8.6 各类连接线、工具、零件不得放置于蓄电池上,以防引起极间短路。3.8.7 端子紧固完毕后,应在其表面涂抹一薄层黄油以防止腐蚀。3.8.8 连接端子时必须注意极性,操作时首先连接正极电缆。 3.8.9 电池拆下时应先关闭浮充电源,静置1h以上再作业,拆下时应避免正负端子打火。 3.8.10 拆卸连接电缆后,必须用绝缘包布包扎电缆裸露铜线部分。保持电池外观清洁,注意及时擦去尘埃与电解液,尤其是接线端子及接线电缆.。注意检查液口栓排气孔是否堵塞。 3.8.11 定期检查液面,如低于低位线,请用蒸馏水或纯净水补注液至上水线,绝不可添加硫酸液。注液后的电池应及时使用,如长期不用,定期进行补充电。 3.8.12 新电池初注液后,应静放置20分钟如液面不下降,则可进行充电,若液位下降,应再次加注。 3.8.13 电池长时间连续放电导致亏电后,应该实施恒流充电。此时,应将液口栓打开排气。充电完毕后,逐渐减小充电电流再切断电源。充电后,电池应静放0.5h 后再将液口栓拧紧。

【基础科学】BD FACSCALIBUR流式细胞仪操作手册(共27页)

BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载。 一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体: 1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。 2. 光学系统:BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 ?FSC Diode 只收488 nm波长散射光 ?SSC PMT 只收488 nm波长散射光 ?FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545 nm) ?FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606 nm) ?FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长 >650 nm)

3. 仪器面板: 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制: LO:样品流速:12 μl /min MED:样品流速:35 μl /min HI: 样品流速:60 μl /min 功能控制: ?RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。) ?STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。 ?PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME 结束,仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉: 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

流式细胞仪细胞分选的操作步骤

细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究,而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养,因此在样本制备,上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇(用无菌蒸馏水配制) 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子,振摇鞘液筒,确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接,否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处,并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管(若不使用浓缩器)。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门(画一个空门使机器进行分选操作)。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉,点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满(每管注满需要9min ),点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次,共需要1h。 13、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水,振摇鞘液筒,倒掉液体,反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水,盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满(每管注满需要9min),点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次,共需要1h。 20、断开鞘液筒,在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管(最左)中收集15 mL PBS后取下,使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞,则应用无菌技术,用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管,将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞

BD流式细胞仪原理与典型故障分析

Instrumentation and Equipments 仪器与设备, 2018, 6(3), 95-98 Published Online September 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/2711837580.html,/journal/iae https://https://www.doczj.com/doc/2711837580.html,/10.12677/iae.2018.63015 BD Flow Cytometer Principle and Typical Malfunction Analysis Xiusheng Qiu*, Caihui Zeng, Liting Zhang The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou Guangdong Received: Aug. 23rd, 2018; accepted: Sep. 11th, 2018; published: Sep. 18th, 2018 Abstract Flow cytometry is a device for automatic cell analysis and cell separation. In this paper, the prin-ciple of BD flow cytometry is introduced, and the common faults of flow cytometry are described. After analysis, the troubleshooting process is described in detail. Flow cytometry instrument equipment failure can be divided into liquid road faults, hardware failure, software failure, and all three cases. Only by accumulating in use can we fast judge the fault, and quickly solve the problem. Keywords Flow Cytometer, Principle, Malfunction Analysis BD流式细胞仪原理与典型故障分析 丘秀生*,曾彩辉,张丽婷 中山大学附属第三医院,广东广州 收稿日期:2018年8月23日;录用日期:2018年9月11日;发布日期:2018年9月18日 摘要 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置,已经渐渐成为生物科学重要的分析仪器。本文介绍了BD流式细胞仪的原理,并对流式细胞仪常见的典型故障做了阐述,进行分析后,并对故障的排除过程进行了详细的阐述。流式细胞仪维中设备故障可分为液路故障、硬件故障、软件故障和三者兼具的情况,只有在使用过程中不断积累,才能快速判断故障,并迅速的排除。 *通讯作者。

人员培训标准操作规程SOP

人员培训标准操作规程SOP 一、目的;建立人员培训标准操作规程,确保培训规范的执行,提高全体员工素质。 二、适用范围:适用于全体员工的培训管理。 三、责任者:综合管理部。 四、管理制度: 1 培训的基本原则: 1.1 各级管理人员,生产、检验以及与生产活动有关的维修、清洁、仓储、 服务等人员,均应按《保健食品良好生产规范》(以下简称《规范》)的原则和各自的职责要求接受培训教育。 1.2 培训教育方案应根据不同培训对象的要求分别制订。教材要深入浅出, 注重普及与提高,理论与实践相结合。 1.3 培训教育工作要制度化、规范化。个人培训记录要归档保存,培训效 果要定期考核、评比。 1.4 培训教育部门在编制企业教育规划及计划时,应将《规范》培训教育纳入计划,配备一定的任教人员,且任教人员的知识应不断提高更新,提高培训质量。 2 培训的基本内容:根据培训的对象确定培训教育的内容,制定教育方案及培训教育达到的目的和要求。培训教育的基本内容包括有关法规、规定、制度的培训,包括《保健食品良好生产规范》、企业规章制度、工艺规程及岗位操作法等。 3 培训的对象:培训对象是公司负责人、质量、生产制造等部门的负责人和从事生产、质量、销售、设备等部门的技术人员和管理人员及生产操作工人。 4培训的目的与要求: 通过培训使全体员工意识到保健品的生产、经营等各个方面都已进入法制化的阶段。 4.2 保健品是特殊商品,保健品质量关系着人的健康,全体员工要确立质量第一的原则。 4.3 使各级负责人具有相应的管理知识,懂得实施《规范》的意义和内容, 掌握实施《规范》的有关知识、方法和评价的基本原则。 4.4 使全体员工掌握企业的规章制度。 4.5 技术、管理人员进行专业知识和管理知识的培训,使其在各自的岗位上, 认真实施《规范》所规定的本岗位职责及活动内容。 4.6检验及操作人员进行全面的《规范》学习及保健品检验专业知识的培训 和本岗位的操作规程、工艺流程、岗位责任制的学习,使其了解本岗位

流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 Annexin V 检测细胞凋亡

A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN3,过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E):浓度为 10?,使用时,用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料: Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X)Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) PI(Cat. No. 66211E)或7-AAD(Cat. No. 34321X) Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X)PI(Cat. No. 66211E)Annexin V-PE(Cat. No. 65875X)7-AAD(Cat. No. 34321X) 6. FACS流式细胞仪:上样检测。 7. CELLQuest软件:获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管: Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管,按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次,再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料: 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀,室温(20?C ~25?C)避光处放置15分钟。

标准操作规程(SOP)基础知识

标准操作规程(SOP)基础知识 标准操作规程(SOP)是各种标准化管理认证和产品认证的重要内容,各行业都有SOP的要求。什么是SOP?简单的讲,SOP就是一套包罗万象的操作说明书大全。一套好SOP是确保产品或服务质量的必要条件。SOP不仅仅是一套技术性范本,它更重要的涵盖了管理思想、管理理念和管理手段。由于在成熟的行业,都有明确的管理规范和认证体系,因此其SOP的标准化和成熟性都比较高,编写SOP也有依据难度较低。由于目前还没有成熟的实验室管理和认证体系,因此,在检验工作中编写SOP会有些盲然。 首先,SOP具有行业特点,不同的行业都有不同的SOP。就检验工作而言,仪器有仪器的SOP,试剂有试剂的SOP,各个项目有各自不同的SOP,别说是细菌、生化免疫这些学科不同的有不同的SOP,就是同一学科内不同项目也有不同的SOP。所以检验SOP不是一个,而一套。 第二,SOP事无巨细,也就是说只要与项目有关,要详细全面,要包括所有的可能出现的细节。以飞行员操作规程为例,第一条竞然是“坐下”,由此可以看出,SOP涵盖细节程度。SOP不是简单的操作说明,而应该是实用操作大全,应该成为工具书性质的东西。一套理想的SOP 应该让一个不懂的学了后就能成为专家。 第三,SOP不是仅仅是详尽的操作说明,它是管理规范的一部分,也包涵着质量控制和管理理念,从中甚至可以看到人员配置等情况。 虽然不同的行业SOP的具体内容是不同的,但是其是有确实的逻辑联系,因此借鉴其他行业特别相近行业的SOP要求是很有价值的。以药品生产SOP为例,其要求是GMP认证所要求的,根据GMP,其SOP的重点见附。 借鉴药品的SOP的重点,检验SOP应该包涵: 1、操作程序:实验和仪器的操作程序、实验器械的取用和实验后的处理、实验台的清洗、实验物溢漏的处理等 2、质量控制:实验和仪器的质量监控,如实验质控数量(高、中、低?),仪器的校正(人员、时间、方法等)、维护和保养、实验的原始记录等。实验原始记录很重要,发现问题和解决问题的重要手段,除病人资料外,还应有环境参数(天气情况、温湿度等)、使用仪器及仪器情况、样本性状和质量、试剂厂商及批号、同批质控结果以及处理方式(如复查、重抽、发报告)等,尽量详尽。 3、异常结果判断及处理:判断异常结果的指标,及分析处理原因方当及程序。如,是异常给果,还是实验误差或错误?怎么判断?样本正常范围是多少?非正常范围的标本如果处理,大于多少或小于多少复查或与临床联系? 4、流程:应包括样本收发、报告单收发审核、质量和仪器问题处理等

流式细胞仪操作规程

FACSCalibur流式细胞仪操作规程 一、编号:YQ0606 二、标题:FACSCalibur流式细胞仪操作规程 三、关键词:流式细胞仪操作规程 四、目的:保证流式细胞仪的安全及有效操作 五、背景知识:流式细胞术(Flow CytoMeter,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,与传统荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。 六、原理 待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过A/D转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,液可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为测量强度,Y轴为细胞数目。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数,这视其模数转换器的分辨率而定。对于双

BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册

B D F A C S C a l i b u r流式细胞仪 FACS101Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。 如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载。 如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载。 一、BDFACSCalibur基本结构 1.1仪器本体: 1.电源开关:在BDFACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。 2.光学系统:BDFACSCalibur基本配有一支波长488nm的氩离子雷射 以BDFACSCalibur基本型为例 ?FSCDiode只收488nm波长散射光 ?SSCPMT只收488nm波长散射光 ?FL1PMT荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545nm) ?FL2PMT荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606nm) ?FL3PMT荧光光谱峰值落在深红色范围(波长>650nm) 3.仪器面板: 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制: LO:样品流速:12?l/min MED:样品流速:35?l/min HI:样品流速:60?l/min

功能控制: ?RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。) ?STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。 ?PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME结束,仪器恢 复STANDBY状态。 4.储液箱抽屉: 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器SheathFilter,及空气滤网Airfilter。请注意气路减压阀VENTTOGGLE之位置。 ?鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升。装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约3小时。筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。鞘液筒盖 上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。 ?废液筒:位于抽屉右侧,容积4升。筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 ?鞘液过滤器:0.22?m过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。 ?气路减压阀:沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。 ?空气过滤网:用于过滤冷却雷射的空气。 5.上样品区: 上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分,一个是进样针 SampleInjectionTube,将样本输入流动室,还有就是支撑架 TubeSupportArm、和液滴存留系统DropletContainmentSystem。 ?进样针:是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管,是液滴保留系统的一部分。 ?支撑架:用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置:位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。 液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组 成。当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启 动,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支 撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当 支撑架位于中位,真空帮浦停止工作)。更换样品时, 让仪器保持RUN的模式,使得进样针可以反冲;切换到 STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到 流动室中。

性控冻精使用技术手册

第一部分性控技术和性控冻精的概况 一、性控技术的概念和在畜牧业生产中的重要意义 性别控制:通过人为的干预使雌性动物繁殖出人们所期望的性别后代的一种繁殖新技术。奶牛XY精子分离技术是指将公牛的精液根据精子自身X染色体和Y染色体的DNA含量不同,把这两种类型的精子通过物理方法、计算机技术等进行有效的分离,将X精子分装冷冻后,用于牛的人工授精,使母牛怀孕的技术,母牛率可以达到90%以上;根据精子自身X、Y染色体中DNA含量的不同而有效分离的冻精就叫性控冻精。从经济效益来讲,该技术的应用将直接为奶农带来更多的获得良种母牛机会,增加了奶农的收入。 其重要意义在于: 1、产母犊效益提高良种母犊出生数量,使良种奶牛的繁育数量呈几何速度增长,加速牛群改良和更新,迅速达到良种化规模养殖,增加规模效益。 2、充分利用现有优质种公牛和高产奶牛的遗传潜力母牛一生能产6~7胎,平均可以留下3头母牛,采用性控冻精使高产奶牛一生可以产6~7头优质母牛。 3、提高生产性能加速低产奶牛的改良步伐,迅速扩大良种奶牛群,产奶性能得到快速提升,产奶效益不断增加。 以上三点都说明在使用性控冻精后可以显著的提高奶牛养殖的经济效益,同时与胚胎工程技术的结合可以使奶牛的品种改良一步到位。 二、性控冻精在我国应用的重要性和在国内的应用及效果 由于我国奶牛的品种质量较差,平均单产达不到 3500公斤/头,远低于世界平均单产5500公斤/头的水平,更达不到以色列、美国等奶业发达国家奶牛单产的一半。因此从我国实际情况分析,全国各地对良种牛的需求量非常大。奶牛是单胎动物,自然状态下,一头母牛一年只能繁殖一胎,终生平均也只能提供3头左右的母牛后代。由于奶牛自然繁殖率低,繁殖速度慢,年增长速度仅为15%,使得国内现有高产、良种奶牛扩繁速度受到很大限制;若从国外大批引进良种奶牛不但成本高,而且受到国外牛源和国家检疫的限制;因此,高产纯种奶牛的缺乏成为目前我国奶业快速发展的主要瓶颈。奶牛XY精子分离技术是目前最先进、最经济的良种繁育技术,X精子分离纯度已达到90%以上,分离后受胎率和常规冻精相当;这样意味着如果得到一头良种母牛犊,采用传统的冻精配种,则需要4剂精液,花费二年的时间;而采用性控冻精,只需要2剂,花费一年的时间。XY精子分离技术不论从繁育的成本还是从良种扩繁速度上考虑,都是畜牧业良种繁殖改良技术上的一场革命。 该产品已经在全国22个省市进行了广泛的推广和使用,以可信的质量和受胎率、母牛率在同类产品中最好(下表为部分抽样统计结果)得到了各级政府部门和养殖户(场)的称赞和认可。

标准操作规程(SOP)

标准操作规程(SOP) (一)申请程序 1、申请的提出 (1)由申办者向伦理委员会提出伦理审查申请,填写《提请伦理审查申请书》,按要求准备申请材料。 (2)伦理委员会秘书负责申请材料的受理工作,并初查提交的材料是否符合伦理委员会要求。 2、申请文件 (1)伦理审查申请表; (2)临床研究批准文件; (3)申办方资质文件; (4)临床研究方案(注明版本号)及其摘要; (5)研究病历、病例报告表、受试者日记卡和其他问卷表; (6)知情同意书(注明版本号); (7)主要研究者履历; (8)其他(如受试者招募启示等)。 3、申请的受理 (1)秘书确认申请材料符合要求、伦理委员会审查经费到位后,提请主任委员或受委托的副主任委员决定会议时间(从材料符合要求、经费到位之日起不超过15个工作日)。 (2)会议时间确定后由秘书负责向申办者发出《受理通知》。 (二)审查准备工作程序 1、秘书负责整理会议所需资料,并将审查材料于会议前3个工作日提交伦理委员会委员预审。 2、秘书负责预定会议地点,并将会议日程通知伦理委员会委员、申办者、主要研究者,必要时根据主任委员指示邀请独立顾问参会。 (三)审查程序

1、审查内容 伦理委员会在临床试验开始前要从保障受试者利益的角度严格对临床试验文件、规定进行审议,主要内容有: (1)研究方案及其附属文件 ①试验方案设计是否充分考虑了伦理原则,评价受试者在临床试验中预期风险、负担与受益的比例; ②受试者的纳入/排除标准; ③受试者退出的标准; ④不良事件的记录要求和严重不良事件的报告方法、处理措施、随访的方式、时间和转归;当受试者因参加临床试验而受到损害甚至发生死亡时的应急措施,给予的治疗和/或保险措施; ⑤暂停或中止试验的标准; ⑥临床试验的质量控制与保证; ⑦对试验方案提出的修正意见是否可接受; ⑧定期审查临床试验中受试者的风险程度。 (2)知情同意书及其取得过程 ①知情同意书应采用受试者或其法定代理人能理解的语言和文字; ②知情同意书中应告知试验目的、试验的过程与期限、检查操作、受试者预期可能的受益和风险,告知受试者可能被分配到试验的不同组别; ③必须使受试者了解,参加试验是自愿的,而且有权在试验的任何阶段随时退出试验而不会遭到歧视或报复,其医疗待遇与权益不会受到影响; ④参加试验及在试验中的个人资料均属保密。必要时,药品监督管理部门、伦理委员会或申办者,按规定可以查阅参加试验的受试者的资料;

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时,膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变,因此,与DNA 碎片检测比较,使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻,所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用,来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液:含0.1%NaN ,过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序: 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态(鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置,可以连续工作3个小时左右)、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液,要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关,打印 机。 3.气压阀置于加压位置,待流式细胞仪处于STANDBY状态,做Prime,以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液(或过滤PBS)中加入 1滴质控小微球,也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min,打开FACSComp软件,选择保持路径。选择所需校 正内容,如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型,即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品,微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查,并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕,显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果,退出FACSComp程序。 备注:在质控过程中,如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度,但是在调节灵敏度(Sens)时,一定要用“Low”的状态上样,保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯,在上样品过程中,仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件:CellQuest Pro 软件,选择“联机”。 1.

(2)对实验样本进行命名; (3)对实验通道进行预设(FSC,SSC,FL1-FL4)。 备注:如果界面被关闭,重新调出步骤: 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具(一般选择散点图),Inspect 界面会自动弹出,对几个常用选项进行设定:将散点图选中(用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形),将 更改横纵坐 备注:第一个散点图横坐标为FSC,纵坐标为SSC 。 (1一般获取10000个细胞。 (2 ( 3)将所有补偿调为0 (4)将非 52 (5)FSC和SSC (6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀,上机,功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号,第一个图:让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域;其他三个 散点图,要将细胞信号调整到阴性区域,即左下角区域。通过移动通

8. Attune NxT流式细胞仪标准操作规程

Attune NxT流式细胞仪标准操作规程 一、启动Attune NxT流式细胞仪 1、依次打开电脑主机电源、显示器及仪器电源。电脑用户名为INSTR-ADMIN, 密码为INSTR-ADMIN(全部大写)。 2、双击Attune软件图标,用户名为admin,密码为password1(全部小写)。 3、检查仪器内四个液体容器,清空“waste”桶中的废液,确认“Focusing fluid”、 “Wash solution”和“Shutdown solution”三个桶中的液体量是否满足实验要求(液面较高)。 4、点击startup,等待机器启动,整个过程大约需要3分钟。仪器指示灯显示为 绿色,软件左下角出现绿色对勾即为启动完成。 5、点击performance test,在2mL鞘液中滴入3滴performance tracking beads, 混匀后上机,点击Run Performance test。Performance test每天运行1次。这个过程大约耗时3分钟。 二、检测样品 1、点击new experiment新建一个实验,选择tube或plate实验,输入实验名称, 采用默认的Workspace和仪器设置参数,输入Tube Groups和Tube Samples 的数量,点击OK。 2、双击软件右侧Experiment下的Compensation,在弹出的对话框中选择相应的 荧光通道,点击OK。 3、双击UC后上样,点击Run,并调节电压,电压调好后点击Record,依次将 每个单染色的样本上样,并点击Record记录其荧光信号。 4、荧光补偿调好之后双击sample,上样后点击Run即可得到样本的荧光信号。 根据需要建立散点图并建门。 三、关闭Attune NxT流式细胞仪 1、确认”wash solution”和”shutdown solution”桶中液面高度至少在桶高的一半以 上,清空“waste”桶。 2、点击shutdown,选择Quick、Standard或Full,样品管内加入3ml 10% bleach 液,点击next启动关机程序,此时请勿关闭软件或者终止shutdown过程,关

BD_FACSCalibur流式细胞仪操作手册

BD FACSCalibur流式细胞仪 一、BD FACSCalibur基本结构 1.1仪器本体: 1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。 2. 光学系统:BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545 nm) FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606 nm) FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长 >650 nm)

3. 仪器面板: 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制: LO:样品流速:12 μl /min MED:样品流速:35 μl /min HI: 样品流速:60 μl /min 功能控制: ?RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。) ?STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。 ?PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME 结束,仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉: 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。

流式细胞仪操作方法

一、样品制备 1、取样(大约1×106 cells),离心弃上清,以PBS洗两遍,逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞,﹣20℃冻存过夜。分析时,离心弃上清,以PBS洗两遍,加入100μl的Rnase(GenScript试剂A),37℃水浴30min,然后再加入400μl的PI染液(GenScript试剂B),在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells, 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉,确认气压阀处于减压状态;打开金属挡板;取出鞘液桶,倒掉废液,将鞘液桶加至2/3满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFLow),拧紧鞘液桶盖,安上金属挡板,保证管路畅通无扭曲。检查废液桶,将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开,倒掉废液(加鞘液一定要倒废液)向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液,合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源(指示灯由bypass变Ac putput)、变压器电源,稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印,打开打印机电源。打开电脑(密码:BDIS),等待屏幕显示出标准的苹果标志(先开仪器,后开电脑主机)。 1.3、将压力阀置于加压位置,轻拍过滤器,使气泡位于滤器的上方,打开管路开关,将过滤器中的气泡排除,关闭管路开关。若滤器管路中有气泡,打开连接头,挤出鞘液,以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡(反向压力使鞘液从进样针中流出)。结束后自动STANDBY,5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化,选散点图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H(选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群)。选择单参数图标,打开,Plot type选择Acq-analysis,X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)

GMP标准操作规程(SOP)的制定方法

GMP标准操作规程(SOP)的制定方法 GMP软件系统主要包括生产管理、质量管理、技术管理、厂房设施和设备管理以及物料管理等五大系统。GMP软件系统构成按其性质可分为标准和记录两大部分,其中标准分技术标准、管理标准和工作标准,而标准操作规程(SOP)在软件系统中属于工作标准中的一类。因各国的GMP虽基本内容相似,但GMP并没有具体到每个企业应当如何做的地步,这就要求每个企业必需制定出各自实施规范的具体规定和要求,这些通常包括在标准操作规程内。因此,SOP是GMP规范中有关内容在某一特定企业的具体规定。 标准操作规程,其英文名称为standard operating procedures(SOP),在制定GMP软件系统中是个关键和难点,因在一般GMP规范中只是叙述一种笼统条理性条文,如在《药品生产质量管理规范》(1992年修定)中第七章生产管理第五十二条指出:每一产品均应制定生产工艺规程和岗位操作规则;第五十三条指出生产工艺规程和岗位操作规则的制定和修改应履行起草、审查、批准程序,并不得任意改变。这里的岗位操作规则即指SOP,在实际工作中可操作性差。现根据一些参考文献以及自己的理解浅析SOP的制定方法,以供参考。 1SOP制定的一般原则 一个企业在实施GMP过程中应结合本企业的实际出发,开发出一套实施GMP规范的具体规定和具体要求。首先应制定标准操作规程的SOP,具体应由质量管理部门(QA)将SOP 进行分类,对照GMP要求列出必需制定的SOP并按部门进行分类,统一编号以便统一管理;确定制定SOP的程序,明确制定人、审核人、批准人权限;确定SOP的基本格式,一个企业最好做到基本格式一致;根据SOP分类不同确定编写基本内容的思路;确定SOP 的执行与修改程序。 2SOP的分类 2.1SOP分类的一般原则标准操作规程的具体内容除了生产管理规程外,还包括卫生管理规程、质量管理规程、设备管理规程以及物料管理规程等。一般地说,有一些SOP涉及到公司许多部门的共同活动,而与产品无关,如:如何进入生产区;厂房和设备的维修;清洁指令等。 而另一些SOP则专门适用于某一类产品,规定了这类产品的生产和质量管理活动,例如:鲎的采血规程;鲎细胞洗涤规程;TAL灌装规程;TAL灵敏度标定规程等。 另外,对于某些生产方法来说,有些产品之间有许多细节是相同的,因为批生产记录必须给出每一产品制造过程的详细指令,为了避免这种雷同,最好将这些重复内容包括在SOP内,这样,批生产记录中就常用参考号码的方式指明某一SOP,例如:安瓿的洗涤;高压蒸气灭菌操作;干热除热原操作等。 2.2制药企业SOP的基本分类一个企业参照GMP要制定SOP可以有所不同,但基本应包括如下类别: 2.2.1总则(企业共同必须遵守的SOP)。 2.2.2物料管理的基本SOP(原辅料、包装、成品、半成品的收货发货,物料、成品、半成品的标签、标记凭证的储存与使用)。 2.2.3工艺及生产操作的基本SOP(工艺单元操作、批号编制、工序管理)。 2.2.4质量控制与检查的基本SOP(取样、留样、检测的单元操作、监测检查)。

流式细胞仪使用方法

流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称:流式细胞仪 生产厂家:美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法: 一.开机程序 1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。 2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀。确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。 3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。排出过滤器内的气泡。 4.如果需要打印,打开打印机电源。 5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。 7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。 二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数。 3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析。 三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取Connect to Cytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框。 4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode):线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周

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