葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分
配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得
最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，
就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂
洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
(2) 饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
(3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
(5) 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
再生以备下次使用。
6 分离的技巧，最后说说我的使用心得
（1）流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。
（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。
（3）馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。
（4）洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。
（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。
（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。
Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。
1.装柱
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。
在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。
2.平衡
上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。
3.洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
4.样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。
5.洗脱
洗脱流速应根据情况而定，最大线性流速约12cm/min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm/h。总体来说，较低的流速，具有较高的分辩率。
6.再生
凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如更换洗脱液，则需要重新平衡。
7.体积流速与线性流速的关系
线性流速=体积流速/横截面积
8.溶胀体积
由于Sephadex LH-20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。
新体积=旧体积×（新柱体积/旧柱体积）
9.胶的性质
Sephadex LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
10.排阻极限 4-5KD（与所用溶剂有关）
11.上样量
吸附模式取决于所需分辩率
分子量大小小于总体积的20%
正相分配小于总体积的1%
12.其他
胶粒形状球形，多孔
颗粒大小（干） 18-111um（直径）
颗粒大小中间值（干） 70um（直径）
颗粒大小（甲醇） 27-163 μm（直径）
颗粒大小中间值（甲醇） 103 μm（直径）
最大线性流速 720cm/min
参考线性流速 60 cm/min
pH的稳定性
操作中 2-11
清洗中 2-13
化学稳定性在许多水溶液及有机溶剂系统中都稳定。在pH2以下或强氧化剂中不稳定高压灭菌 121℃可忍受20分种
操作温度 4℃到40℃
保存条件
新填料 4-25℃（干燥）
使用后填料 4-8℃，pH6-8，切勿冷冻，加入抑菌剂（如20%乙醇，0.04%叠氮钠）13.干胶溶胀表
溶剂床体积（ml凝胶/g干胶粉末）
Dimethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.4～4.6
Pyridine 嘧啶 4.2～4.4
Water 水 4.0～4.4
Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8～4.2
Saline 生理盐水 3.9～4.1
Methanol 甲醇 3.8～4.1
Methane dichloride 二氯乙烷 3.8～4.1
Chloroform* 氯仿 3.8～4.1
Propanol 丙醇 3.7～4.0
Ethanol** 乙醇 3.6～3.9
Isobutanol 异丁醇 3.6～3.9
Formamide 甲酰胺 3.6～3.9
Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6～3.9 Butanol 丁醇 3.5～3.8
Isopropanol 异丙醇 3.3～3.6 Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3～3.6
Dioxane 二氧杂环已烷 3.2～3.5
Acetone 丙酮 2.4～2.6
Acetonitrile*** 乙腈 2.2～2.4
Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8～2.2 Benzene 苯 1.6～2.0
Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6～1.8
Toluene 甲苯 1.5～1.6
*包含1%的乙醇
**包含1%的苯
***溶胀胶体积小于2.5ml/g的溶剂没有使用价值
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。 LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光 0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A 序号16 8 吸光 0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011 度A 2、蛋白质样品洗脱曲线：
使用注意事项： 色谱柱在使用过程中主要应该注意的是： 1、每根色谱柱都有一定的压力范围（说明书有说明），一般要在合适的压力下进行分析使用。 2、色谱柱在制作过程中是在一定的压力下按一定的方向添装的，因此要求在使用时要按照规定的方向进行连接。如果不小心装反了也不用着急，一般没有超压使用应该影响不是很大。但如果一直使用了很长时间如半年或1-2年，建议你就一直这样使用下去。 3、分析样品和流动相一定要过滤干净，不要让对柱有害的物质通过色谱柱。 4、增加一根保护柱或柱前保护对分析柱是有好处的。 5、色谱柱能不能反冲，在第2中提到了一点，一般咨询厂家时都会告诉你不能反冲，主要是担心反冲会使柱中的填料松散，那样整根柱子就报废了。这一点应该很好理解，就是在一定压力一定方向将填料填充压紧，如果反向冲操作不当很容易就会使原来压紧的填料松散开，这是无法弥补的损坏。但在具体使用中，就我所知可以在压力低一些，也就是流量小一些的条件下进行反冲，只要没有影响到柱内的填料，将堵塞的物质冲出可以有效降低系统压力，改善柱效。 应用： 凝胶色谱柱主要进行大分子样品分子量与分子量分布的检测，如果样品分子量差异较大，应该也可以进行分离。这类样品可以作为宽标的标准样品进行标准曲线的建立。 另外，凝胶色谱柱检测的样品有油性的高分子物质，如树脂类等，还有水溶性的高分子物质如糖类等。 对于不同厂家的色谱柱要说好坏之分，我认为和以上很多内容都有关系，样品是否干净，流动相是否干净，人员有没有误操作，有没有保护柱，每天工作量大小等很多影响因素。总体来说应该差不多。 凝胶色谱柱（水性）的保养与保存： 凝胶色谱柱需要注意防止微生物的生长，被微生物污染后的色谱柱将无法重现原来的分离效果与柱效，严重会使凝胶色谱柱报废。 为了抑制微生物的生长，可以使用低温保存。值得注意的是温度不能过低，以免冻结，为了不冻结可以提高保存时介质的离子强度。 常用的保存抑菌剂有：0.02%叠氮钠、0.002%洗必泰（hibitane，双氯苯双胍己烷）、0.01% -0.02%三氯丁醇、0.1mol/l氢氧化钠。 也可以用一定量有机溶剂来保存，如20%乙醇。 值得注意的是，无论何种保护方式，都必须根据色谱柱的特点来进行。 液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 一、液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构： a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
毛细管柱的老化 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等。检查气体过滤器和进样垫，保证载气和检测器的通气畅通，如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。 将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端小心切平，切面要平滑整齐。将色谱柱连接于进样口上。 老化中应注意载气的流速不易过大，否则会破坏均匀的液膜。 一般非极性柱在250℃以下老化使用，可用普通氮气，在250℃以上高温使用时，必须使用高纯氮气或普通氮气经脱氧后使用，以延长柱子的使用寿命。对极性柱，尤其是PEG类（聚乙二醇）、FFAP、含氰基的固定液（OV225、?OV275），一定要用高纯氮气（最好高纯氮气经过脱氧，）99.99%否则，固定液很快被氧化，以致不能使用。 色谱柱在进样口中插入的深度应根据所使用的GC仪器不同而定，正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，即处于进样针穿过隔垫完全插入进样口后针尖与色谱柱入口相距1～2cm 如果仪器已经较长时间没使用，在开机前要通载气30~40分钟，使系统中可能有的空气全部被排除后才能开机升温。 老化柱子时接上进样口端，断开检测器端，初温50度，保持通载气30分钟，然后以5度/分钟升到老化温度，保持4-8小时就可以。 （老化温度为比该柱子的最高使用温度低10-30度，但是一定不能超过色谱柱的温度上限否则极易损坏色谱柱；比作样分析温度高10-30度的温度） 各种固定液因其性质和生产厂家不同而最高使用温度有所不同，所以要注意毛细管柱的说明，生产毛细管柱的厂家应注明最高使用温度。 请参考产品附带的说明书，或者和我们联系！！！ 如果你接的是MS检测器，最好先不要使柱子出口进入质谱。 当达到老化温度后，记录并观察基线，初始阶段基线应持续上升，在达到老化温度后5～10min开始下降，并且会持续分钟，当达到一个固定的值后就会稳定下来。 --------------------------------------------------- 如果柱子受到污染, 可在推荐的最高色谱柱温度低20 度的条件下，老化柱子。
凝胶色谱柱操作 1、溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。 2、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品
特别注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！！柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 3、关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。这个我分离的次数很少，一般都是通过紫外灯查看的。 4、关于湿法、干法上样 湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1：1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用2.5 L的塑料桶装的。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，当然比较忙的时候我是不回收的，太费事了。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越
毛细管气相色谱柱的使用及常见故障分析 王波 （安徽省淮北市农业环境监测保护站淮北235000） 摘要根据多种毛细管气相色谱柱在国内外多种品牌的气相色谱系统的实际应用情 况，结合与其相关的文献资料，对毛细管气相色谱柱的使用及常见故障进行专业、细致 的分析与研究。 关键词气相色谱毛细管柱常见故障 现在的气相色谱系统中，毛细管色谱柱已被广泛的应用。大部分的检测工作可能只需几根柱子（OV-1、PEG-20M、OV-210）即可很好的完成，特别是大口径（0.53mm）柱的使用已逐步替代填充柱。掌握毛细管气相色谱柱的正确使用的方法，以及在其使用过程中故障处理的方法是非常必要的。 1 毛细管色谱柱的安装 在整个毛细管气相色谱中，柱子的安装尤为重要，柱子安装的好坏直接影响到检测结果。 1.1 毛细管柱与进样器的连接 对于分流进样，毛细管柱的入口端一定要伸过分流进样器的分流出口（见图1a），就是使毛细管柱的入口处于载气的高流速区域。如果毛细管柱的入口在分流进样器的分流出口以下（见图1b），处于载气的低流速区域，得到的色谱图就不理想，所以必须将毛细管的入口伸过分流进样器的分流出口，这样才会得到尖锐的峰形。对于分流/ 不分流进样，毛细管的入口应接到进样器的底部（见图1c），这样可以使汽化管中的样品完全进入柱子，也不会出现气流清洗不到的“死区”。 对于有些有特殊要求的气相色谱，毛细管气相色谱柱与进样器的连接，可以按仪器使用说明书的要求进行安装。 1.2 毛细管色谱柱与检测器的连接 在毛细管气相色谱柱连接到检测器之前，先接通载气，看一下柱子的出口是否有载气通过，（将柱子的出口浸入乙醇中看是否有气泡出现）如果没有载气从柱子出来，说明柱前的系统中有的地方漏气或柱子堵塞，应找出原因加以解决。然后将柱子的未端尽可能的伸到检测器（FID）的喷嘴以下的1~2mm 处，并使柱子的出口处于气流的最高流速区域（即氢气引入口以上），如果柱子不能直接伸到检测器的喷嘴下1~2mm 处，但必须伸到尾吹气入口的上部使柱子的末端处于气流的高速区域。
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分 配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得 最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦， 就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂 洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
葡聚糖凝胶使用说明 Sephadex Gel Manuals 1化学和物理性质 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。 葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 1.1化学稳定性 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 1.2物理稳定性 葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 2产品说明 名称分离范围（球蛋白）应用 葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子 葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子 葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液 葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定 葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 3使用方法 3.1乙醇浸泡 在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。 3.2无盐水浸泡 室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。 3.3盐酸浸泡 在常温下再用0.1M HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性。 3.4装柱
色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。 6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要
拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置或更长时间。 7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。 8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会
柱层析使用技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf 在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 关于无水无氧柱 适用于对氧，水敏感，易分解的产品，可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，
葡聚糖凝胶柱的使用方法： 预处理(1) 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持
一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－10，共收集3ml。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集1.0ml/min 管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm， 找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。 实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。 实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex ）和琼脂糖凝胶（Sepharose ）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱， 各个组分由于分子量不相同，
流动相： 1. 流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2. 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3. 含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。 4. 流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。 5. 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 色谱柱: 1. 要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 2. 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 3. C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 4. 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 5. 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。 6. 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 使用注意事项： 1. 使用中避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。 2. 平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）。 3. 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇/乙腈中。
葡聚糖凝胶层析 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤
1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果：
使用毛细柱分析的注意事项 1、无载气通过时，柱的固定液热分解较迅速。所以科晓仪器技术部的安装调试人员和培训工程师定会对操作人员强调：在柱箱（炉）升温前一定要先通上载气（这与TCD操作要求相似），在柱箱冷却后方能关载气。 2、载气中若夹带灰尘或其它颗粒状物体就可能导致色谱柱迅速损坏，同时还应注意不能让微粒或灰尘进入汽化室，因此在载气进入仪器管路前必需净化器； 3、载气中的水分通过固定液的液膜吸附在体内表面上，将会取代或破坏固定液液膜，所以，固定液极性越强，越需要采用干燥的载气，例如：象OV-1、SE-30、SE-5 4、OV-101对载气干燥要求不高，而PEG20M、FFAP和SP1000对载气要求就很高。 但在涂布于碳酸钡沉积层上的柱子情况就恰恰相反，涂极性固定液的柱子能经受含水样品的直接进样，而涂非极性固定液的柱反而不能经受含水样品。但不管如何，载气进入管路前最好都应进行脱水处理； 4、对于那些能被氧化的固定液（如PEG-20M、Carbowax、FFAP等），对载气除氧也很重要，由于N2和He中含O2较高，而H2中含O2少，所以，ECD、FID常用高纯N2作载气，TCD 用H2作载气。同时，停机使用时，应将排空端密封住，以防止空气中的氧气对色谱柱固定液的氧化作用。 本公司生产的GPI—Ⅱ型三气路气体净化器即专门为以上几点原因开发，可以根据不同需要装填不同净化剂，进行过滤、脱水、除氧除有机物。 5、在大多数情况下，柱的寿命与它的使用温度成反比。采用稍低些的温度上限，可显著提高柱的寿命，程序升温到较高温度所维持的时间越短对柱的寿命影响越小。 6、水、醇（尤其是甲醇）、二硫化碳这类的溶剂，有着非常强的置换固定液的能力，因此用于有意将相当大量的溶剂聚集在柱上（溶剂效应）的分流/不分流进样法以及柱上进样法的溶剂，应根据它们对柱壁的吸附亲和力（或固定液被置换的可能性）小心的加以选择。（例如：甲醇不宜用于PEG20M,丙酮往往会引起引起硅酮降解。） 7、毛细管柱最大特点是高柱效，但是柱效不仅反映了柱本身的质量，而且还包括进样过程的整个系统总效率，也就是说，自样品进入系统的一瞬间开始到出峰为止，每一个能影响峰宽或分离效果的因素，如进样器、柱的连接、辅助气引入位置、管路死体积、进样器内衬的毛病等等，都一定会影响柱效。 8、一根好的柱子，由于安装不当，可以造成理论塔板数降低，峰形增宽或拖尾、活性物质的吸附性拖尾或消失、灵敏度降低或组分分离不佳等等。 1）、进样器与毛细管色谱柱连接： 分流进样：分流点要求位于载气流速较高的区域。 不分流进样：色谱柱最好不伸进进样器内，避免造成气流扫不到的区域，通常直接连接到进样器的末端。 2）、检测器与色谱柱出口端连接：对FID不仅插入深度要超过尾吹和H2气的进口，而且应尽可能将柱出口端插到FID的喷嘴下面1mm处为佳，对微型TCD应插到TCD气体入口处为佳。可以改善轻度拖尾。 附表： 常见色谱柱固定相的使用温度 1、聚二甲基硅酮类固定相： OV-1 , SE-30 (弹性体，OV-101 , SF96 , DC2000流体)，使用温度上限为300C,但把温度上限改为280℃，可使柱子寿命显著延长。一般来说，弹性体类固定液比流体类更稳定些，SF96 , DC200因含有较高水平的残留催化剂和不纯物，不宜作GC/MS分析。 2、聚苯基乙基硅酮：SE-52（弹性体，5％苯基），SE-54（弹性体，5％苯基，1％乙烯基），DC10（液体，35％苯基），OV-17(液体，50％苯基)实际上限250℃。SE-52、SE-54在280时稳定性很好，常用于GC/MS分析，并能容纳超负荷的大进样量。苯基含量增加、稳定性要差点。 3、聚氰丙基硅酮是极性强的硅酮固定液：OV225（液体，25％氰丙基，25％苯基），Silav10c、SP2340（液体，75％氰丙基），实际温度上限是250℃。 4、聚乙二醇型（Carbowax or PEG）固定液是乙烯氧化物聚合体的混合物，其名称反映
葡聚糖凝胶LH-20使用说明书 货号：S8111 规格：25g/50g/100g 保存：室温存储 产品简介： 适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子，因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，重复使用分离效果可保持不变。 上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5-7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关——难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷。这些溶剂的极性依次降低，对极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常在被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离适用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用说明： 1葡聚糖凝胶LH-20的原理 葡聚糖凝胶LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保