葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20
使用说明
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。
溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。
二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。
LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高.如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。
1.葡聚糖凝胶 LH-20 的原理。
葡聚糖凝胶 LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
2.葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂。
葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
3.样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进行过滤！否则把Sephadex LH-20 堵塞，就必须将Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
4.葡聚糖凝胶 LH-20的步骤。
（1） 选择条件：
梯度洗脱在葡聚糖凝胶 LH-20使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性大的
用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。
（2） 饱和层析柱：
用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
（3） 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。
（4） 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
（5） 洗脱：控制流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。再生以备下次使用。
Sephadex LH20使用心得谈：
分离的技巧，最后说说我的使用心得
（1） 流速不可太快，切切不可新急，所谓欲速则不达。
（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。
（3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。 （4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。
（5）鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。（6）Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用
问：在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?
那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的
起使浓度相同?
如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?
还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?
解答如下:
1 "在不同的溶剂中的吸涨程度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响."
当然有影响,Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是Sephadex LH20很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯 中收缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯 作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举
了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?"
样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同，但有时（其实是多数情况下），都办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是：
1 样品一定要溶解（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同志对好填料看得都很重，职业问题，哈哈哈；同时，避免样品不溶解造成的脱尾）
2 溶解样品的体积尽可能小（色谱分离理论的基本要求，减小原始谱带宽度）
3 样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同（若样品的溶解溶剂比洗脱的起使浓度洗脱能力强，则会人为增加洗脱起使溶剂的洗脱能力；同时若样品的溶解溶剂与洗脱的起始溶剂差别很大，样品可能因为溶解性的问题而析出。）
以上三点是上样的基本要求，有时很难求全，只有根据具体的实际来决定了。一般我的做法是满足1，2点，尽量满足第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解”，请注意我的陈述“尽可能”，
3 "还有分到什么程度是用Sephadex LH20比较好?"
如果实验室Sephadex LH20很珍贵，分道较纯再用， 如果实验室Sephadex LH20很普及，只要满足使用的注意事项，较粗的样品可直接使用Sephadex LH20分离。日本的师兄都是用Sephadex LH20粗分，人家有钱，所以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。有很多问题根本不是学术本身的问题，人也不可能在真空中搞科研。哈哈，跑题了。
问：那上样体积与柱体积最小的比是多少？我用100克的填料，如果样品不好溶，那一次最多能上多少毫升的样呢？
1 在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情
况是很多的.一般解决的途径有两条:
1） 将样品一次全上柱,这样分离效果一定不会好,但我们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍,这叫反复xxxx柱层，好处是工作量小（对比下面就知道了），在前后较纯的馏分，如果目标组分量足够，可就乐去吧。
2 ） 将样品分几次分别分离，这样每次分离的效果一定比将样品一次全上柱的分离效果好，但这样有一个很大的弊病，就是每次柱层的条件不可能保持完全一至，这样几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的过程中，合的太粗，就如同 将样品一次全上柱的合并结果，只是工作量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎么合并了。
2 100g填料已不少了，样品如果实在太多，就只好分开上柱了.
3 一般Sephadex LH20上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的1／10吧。
问：分得效果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差不多，很让人困惑，郁闷。
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说
的是Sephadex LH20不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是Sephadex LH20这种填料的特点:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积",
2 "我用甲醇洗脱,而且仍然和没上柱之前差不多",说明你的样品组分之间分子大小差别不大,所以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了,如果你还用Sephadex LH20分离,那你应该利用他反相分配的作用,即先用低浓度的甲醇/水,逐渐提高甲醇比例,最后才用甲醇洗脱。
1 XX提到用少量的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比较难处理,是指甲醇水难蒸干吗?其实这根本不应成为问题。XX请想一想,做植化的,哪有遇不到甲醇水的时候, ODS柱层用甲醇水洗脱, Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱,D101用乙醇水洗脱, HP20 用甲醇水洗脱, 高效液相最常用的是反相, 流动相还是甲醇水,可见甲醇水是植化同志最亲密的朋友! 所以蒸不干也
要蒸,想想办法吗!
2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的,,办法是有的,先看看旋转薄
膜的几个要素: 真空度, 冷凝液, 蒸发温度.
1) 真空度决定于水泵的效率和系统的密闭性.一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水),但一定注意的是水泵的循环水一定要开,如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热,将极大地减少水泵的效率,且会
将抽出的溶剂挥散出来,很不好!国产的旋转薄膜配的垫圈很烂,全不耐氯
仿等有机溶剂,当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂,垫圈就废了.所
以要多预备几个垫圈.
2) 冷凝液一般使用水,如果配一台冷阱,使用半量的水配比上办量的
汽车冷冻液, 效果棒极了
3) 提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,
国产旋转薄膜,水泵,用水冷,当然就只好提高蒸发温度了。我用东京理化的旋转薄膜,1/2汽车冷冻液冷凝,隔膜泵,蒸水不到45度,很爽!
3 向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高! Sephadex LH20柱子被弄脏了，大多数情况下是由于样品没滤, 将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去,具体做法很简单,只将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可,
2 如果柱子整个被污染,如果是将Sephadex LH20用反相被污染，办法如下依次用水,NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分），所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。
NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ,30g NaCl， 1000ml水
问：不知道用反相柱分离和用LH-20那个效果比较好.如果同时用同一根LH-20的话,洗脱剂可以从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题,上LH-20的时候可以用一个梯度洗脱吧?最后用甲醇冲柱就可以了吧??
1.Sephadex LH-20主要还是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱效果。如要分离的物质在反相板上分离效果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物质分子量相差较大，当然是Sephadex
LH-20效果好。实际使用中往往上在一起配合使用，逐渐细分为多个部分直到拿到纯品。
2.Sephadex LH-20使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时候当然要换）。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的膨胀率，分量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
我们实验室用的LH-20柱一般就是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流动相，
如果冲不干净就换纯甲醇来冲，没碰到过你说的情况！根据LH-20在不同溶剂中的溶涨程度不同，如果你用的溶剂溶涨系数接近的话，可能影响不大，如果溶剂之间溶涨系数相差较大，我想出现气泡是可能的。以下列举了1g干态的,Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
丙酮 0.8ml
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。 LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为 1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 序号 2 4 6 8 10 12 14 吸光 0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A 序号16 8 吸光 0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011 度A 2、蛋白质样品洗脱曲线：
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
SephadexG-10葡聚糖凝胶 G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶 G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sephadex G-15 葡聚糖凝胶 G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离Sepharose 6B 琼脂糖凝胶 6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶 G-25 中分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶 G-25 中分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶 G-25 细分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶 G-25 细分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶 G-50 中分离范围 1500-30000 Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶 G-50 中分离范围 1500-30000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000 DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶 FF 分离范围：3000-80000 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围 4000-150000 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶 G-100 分离范围 4000-150000 Sephadex G-150 葡聚糖凝胶 G-150 分离范围 5000-300000 DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300000 Sephadex G-150 葡聚糖凝胶 G-150 分离范围 5000-300000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000 DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶 A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子 DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶 A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子 DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶 A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子
凝胶色谱柱操作 1、溶胀 商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。 2、装柱 由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。 3、柱均匀性检查 凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。 4、上样 凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品
葡聚糖凝胶使用说明 Sephadex Gel Manuals 1化学和物理性质 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。 葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 1.1化学稳定性 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 1.2物理稳定性 葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 2产品说明 名称分离范围（球蛋白）应用 葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子 葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子 葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液 葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定 葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 3使用方法 3.1乙醇浸泡 在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。 3.2无盐水浸泡 室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。 3.3盐酸浸泡 在常温下再用0.1M HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性。 3.4装柱
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分 配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得 最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦， 就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂 洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
葡聚糖凝胶柱的使用方法： 预处理(1) 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持
一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－10，共收集3ml。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集1.0ml/min 管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm， 找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。 实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出
葡聚糖凝胶LH-20使用说明书 货号：S8111 规格：25g/50g/100g 保存：室温存储 产品简介： 适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子，因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，重复使用分离效果可保持不变。 上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5-7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1-2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关——难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷。这些溶剂的极性依次降低，对极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常在被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离适用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用说明： 1葡聚糖凝胶LH-20的原理 葡聚糖凝胶LH-20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。 实验五. 葡聚糖凝胶层析 【实验目的】 1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。 【实验原理】 凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex ）和琼脂糖凝胶（Sepharose ）。 葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱， 各个组分由于分子量不相同，
葡聚糖凝胶使用说明 化学和物理性质 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。 葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 化学稳定性 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 物理稳定性 葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 产品说明： 产品名称分离范围应用 葡聚糖凝胶 G-10 <700 缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶 G-15 <1500 缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶 G-25 1000-5000 工业上脱盐及交换缓冲液 葡聚糖凝胶 G-50 1000-30000 多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定葡聚糖凝胶 G-75 2000-70000 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶 G-100 2000-120000 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶 G-150 5000-300000 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶 G-200 5000-600000 蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定
葡聚糖凝胶层析 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤
1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果：
产品筑.明= 葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25 (50 —100 目)约5g，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h进行 溶胀。 ⑵装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。 同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡 2 —3h即可加样品分离。 ⑶加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一 极薄液层)为止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加 完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2 —3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防 止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8 — 1.0ml/mi n 。洗脱 液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ,共收集10管。据经验，4或5号管核 苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。 用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCI 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验 完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95% 乙醇洗两次，在60 C 烘箱中烘干，回收保存。
各种葡聚糖凝胶的分离范围与用途： SephadexG-10葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sepharose 6B 琼脂糖凝胶6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离 SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000 Sephadex G-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000 DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶FF 分离范围：3000-80,000 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000 Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000 Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000 DEAE Sepharose CI-6B 琼脂糖凝胶CI-6B 分离范围：5000-300,000 Sephadex G-150 葡聚糖凝胶G-150 分离范围5000-300000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000 Sephadex G-200 葡聚糖凝胶G-200 分离范围5000-600000 DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子 DEAE Sephadex A-25 DEAE葡聚糖凝胶A-25 颗粒大小：40-120μm 分离大小：小蛋白及巨大分子 DEAE Sephades A-50 DEAE DEAE葡聚糖凝胶A-50 颗粒大小：40-120μm，分离范围：小蛋白及巨大分子
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质 实验简介：凝胶层析法是用一般的柱层析法使分子量不同的溶质通过具有分子筛效应的介质(如葡聚糖凝胶)，从而达到分离提纯的目的。凝胶层析设备简单，操作简便，条件温和，已成为分离分析蛋白质等生物大分子不可缺少的实验手段。 一、实验目的 1、掌握葡聚糖凝胶柱层析法的工作原理及基本操作技术。 2、掌握蛋白质分离纯化的一般操作技术。 二、实验原理 凝胶层析是按溶质分子大小不同而进行分离的一种层析技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验采用葡聚糖凝胶G-50作为固相载体，它适用于相对分子质量范围在1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。当蓝色葡聚糖-2000(相对分子质量在200万以上，蓝色)，细胞色素C(相对分子质量12800，红色)和重铬酸钾(相对分子质量294，黄色)的混合物流经层析柱时，三种物质的分级分离明显可见。蓝色葡聚糖因完全被排阻在凝胶颗粒之外而首先流出，细胞色素C渗入凝胶颗粒内部而其次流出，重铬酸钾则完全渗入凝胶内部最后流出。通过作洗脱曲线便可清楚地表示出葡聚糖凝胶G-50对这三种物质的分离效果。 样品中的各组分的流出顺序，可用有效分配系数K av表示： K av =(V e-V o)/(V t -V o) 上式中，K av指的是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔径的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。 外水体积V o(outer volume)指基质颗粒之间体积的总和； 内水体积V i(inner volume)指基质颗粒内部体积的总和； 基质体积(V g)指基质自身所具有的体积。V。、V i和V g都是随着床体积和基质性质变化而变化的； 洗脱体积V e(elution volume)指从加样到柱出现最大浓度(峰)时所流过的洗脱液的体积(如图1)。 床体积V t(total volume)指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。V t是基质的外水体积(V o)和内水体积(V i)以及基质体积(V g)的总和(如图2)。 即：V t=V o+V i+V g=V o+V i
葡聚糖凝胶使用说明 1 化学和物理性质 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。 葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 1.1 化学稳定性 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 1.2 物理稳定性 葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 2 产品说明 3 使用方法 3.1 乙醇浸泡 在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用
无盐水洗去残存的乙醇滤干。 3.2 无盐水浸泡 室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。 3.3 盐酸浸泡 在常温下再用0.1M HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性。 3.4 装柱 将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层。 3.5 平衡 上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）。 3.6 上样 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可。 3.7 洗脱方法 可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。 3.8 清洗 每次用完之后，将柱子里的缓冲液置换为去离子水，然后用20%的乙醇封存。 3.9 在位清洗（CIP） 凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。 特别注意： 上样之前，样品至少用0.45微米膜过滤，尽量去除色素，否则色素会被吸附到填料上，影响填料的正常使用。 在使用过程中，不能使用强酸强碱，酸和碱的浓度应低于0.15摩尔。
葡聚糖凝胶使用说明书 货号产品名称分离范围产品应用 S8121葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子S8131葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子S8141葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液 S8151葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定S8161葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 S8171葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 S9191葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 S9160葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定 化学和物理性质: 葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。 葡聚糖凝胶有不同的粒度。超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。另外，粗级也可用于批量工艺。 化学稳定性: 葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂(除非它被化学降解)。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖昔键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。 物理稳定性: 葡聚糖疑胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌或在高压灭菌器120℃、30分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。 使用方法: 1.葡聚糖凝胶预处理：
各种葡聚糖凝胶分离范围与用途 —上海鑫饰化工科技有限公司葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 —上海鑫饰化工科技有限公司 SephadexG-10葡聚糖凝胶G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；Sephadex G-15 葡聚糖凝胶G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；Sepharose 6B 琼脂糖凝胶6B 分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；ConA-Sepharose ConA琼脂糖凝胶分离范围：1000-5000，适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；Sephadex G-25 Medium 葡聚糖凝胶G-25 中分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离； Sephadex G-25 Fine 葡聚糖凝胶G-25 细分离范围1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离；—上海鑫饰化工科技有限公司 SephadexG-50 Medium 葡聚糖凝胶G-50 中分离范围1500-30000；Sephadex G-75 葡聚糖凝胶G-75 分离范围3000-80000； DEAE Sepharose FF DEAE琼脂糖凝胶FF 分离范围：3000-80,000；Sephadex G-100 葡聚糖凝胶G-100 分离范围4000-150000；
(1)预处理 称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。 凝胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装。 (3) 加样 装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm 处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。凝胶色谱的共性是流速慢，每份一般体积较小。（内径1.3cm左右，长80cm左右的柱子我一般每份收集液为8ml） (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱多次使用后，若污染严重，则考虑用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl 混合液浸泡后，再用水洗净即可。 通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后，就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，需经再生后才可使用。再生方法有多种：如（1）用水进行逆向冲洗，再用洗脱剂平衡，便可重新使用。又如（2）把凝胶倒出，用6mol/L脲浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。 1.凝胶的预处理 交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。 2.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的