大肠杆菌感受态细胞的制备
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分类：细胞技术> 感受态细胞
来源：
实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化
实验原理
处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞
的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种
手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体
（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些
特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生
了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可
以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂
(1)0.1mol/L CaCl2溶液
(2)LB液体培养基
(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
主要设备
(1)超净工作台
(2)冷冻离心机
(3)恒温摇床
(4)－70℃冰箱
(5)10mL移液管
(6)吸耳球
(7)1mL、200μＬ移液枪（配套枪头）
(8)50mL 离心管
(9)1.5mL离心管
实验材料
(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）
实验步骤
（一）受体菌的培养
(1)从LB平板上挑取新活化的 E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。
(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μＬ菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。）
(1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
(2)在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。
(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。
(4)0～4℃4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制
备）
（三）感受态细胞的分装与冻存
(1)在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%）。
(2)将此感受态细胞分装成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速冻，快速转入-70℃冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。）
注意事项
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体
细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。
⑶、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑷、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
人人都爱protocol。。。。
蛋白的纯化
1.菌液离心
取出三角瓶,倒入离心管中,离心(6000rpm,10min,4℃),离心之后,倒去上清.
2.细胞重悬
加上2mL的lysis buffer 洗沉淀,重悬细胞.
Nacl (4M) 500μl, DTT 3μl, Brij 100μl, lysis buffer 配方是HEPES (2M,PH 7.0)200μl,
PMSF 200μl,H2O 19ml,共20ml体系.
3.初步溶解
加入溶菌酶20μｌ（100mg/ml）于重悬液中,然后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.
4.冷冻
将分装后的菌体放入-80℃冰箱里冷冻约20min（或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后, 取
出待其融化。
5.细胞破碎
融化之后破碎细胞,用超声波细胞粉碎机破碎,每次10s, interval 20s, 20次.若量大可用压榨
机来破碎.
6.离心
离心细胞破碎液,12500rpm,1h,4℃,然后收集上清并转另一个 1.5ml管,再加100μl 1M Tris
-HCl buffer(PH 8.0) 到上清中。（碱性有利于蛋白的获得）可以先放-80.
7.纯化上清
⑴准备Ni柱
在试管中加上空柱,缓慢滴加300μｌ的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀（每300μｌ树脂液中有
5%Ni-NTA agnose）。再用2ml的AT buffer 平衡柱子（大约1h ）。AT buffer 配方：
Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl,Brij 20μl,DTT 3μl, H2O 18ml.
⑵上样
加2ml上清到Ni柱中,并用2ml AT buffer 冲洗.(注意缓慢滴加)
⑶洗脱样品
加上1ml的salt washing buffer 冲洗,其配方是AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij 100μl.
再加上1ml的Imidazole buffer（AT buffer 9.8ml ,Imidazole 1M 0.2ml）冲洗,洗去非特
异性蛋白。
⑷再洗脱目的蛋白
用300μｌ的Elution buffer 冲洗,获得所需的特异性蛋白. Elution buffer配方：AT buffer
7.5ml,Imidazole 1M 2.5ml.
8.纯化细胞破碎液的沉淀
用urea buffer 重悬细胞沉淀, 在常温温育1h,再离心(12500rpm 1h 4℃),收集上清,重复上
清纯化步骤.urea buffer的配方是Tris-HCl 1M PH8.0 1000μl,NaCl 4M 1000μl, Brij 20μl,
DTT 3μl, urea 8M 18ml.其余buffer 均用urea buffer来配置.
9.SDS-PAGE的鉴定
⑴配胶(根据此蛋白的大小（55KD）,配置12%的胶)
下层胶的配方:Acr/Bis 4.44ml,下层胶缓冲液PH8.8 3.75ml,TEMED7μl,10%APS75μl,ddH2O6.8ml.
上层胶的配方是: Acr/Bis0.75ml,上层胶缓冲液PH6.8 1.5ml,TEMED 4μl,10%APS37.5μl,ddH2O3.75ml.
⑵配置样品
每管加样品2μl,5×loading buffer 4μl,再加ddH2O补全20μｌ体系. 混合好loading buffer
和样品后,在100℃下煮约5min,然后置室温下冷却后上样。
样品1：纯化上清；样品2：纯化沉淀；
对照1：未纯化上清；对照2：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶
⑶上样
添加样品,上样20μl,同时加上Marker,10μl.
⑷电泳
加上足够的电泳缓冲液(1×),要加在两板内外,一定要浸没过板,形成电流通路.调好电压进行电泳,约1h后,loading buffer条带跑到底,便可停止.
⑸考马斯亮蓝染色
①将电泳后的PAGE胶取下放入容器中,加入50ml双蒸水或去离子水,加热至沸腾后停止,继续在脱色摇床上摇动5min,弃去水溶液.
②加上染色液,以浸没胶面为准,加热沸腾后保持状态30-60s,停止加热后继续在脱色摇床
上摇动10min,弃去染色液.
③加入约50ml的水,再加热至沸腾后保持沸腾状态30-60s,停止加热后在摇床上要
5-10min,换水可完成脱色.
④若要得到无背景的染色胶,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.
镍柱。用不同浓度的咪唑洗脱。因为咪唑和组氨酸都带正电，可在咪唑逐渐加大浓度的条件
下洗脱目的蛋白。protocol里有啊。
分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离.
常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要
取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分
子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.
蛋白纯化过程中,过完柱子后的上清称为什么?
我们称为流穿液.
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么？
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概
在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里
2016.4.4
周1：
小摇：9点半，每个菌种5ml双抗培养基(5ml新离心管），分别1,2,4号菌种。共2种菌（100:1接菌）（1000:1加入抗生素）
加入100微升保存的菌种液。250rpm，3-4h试试。下午一点开始大摇。
大摇：一个1L的锥形瓶中5ml菌液+300ml双抗培养基，250rpm，2-3h，4点半。当OD600约为0.6左右时（分光光度计测OD600)，加入0.1 mol/L IPTG至终浓度为0.7 mmol/L，16摄氏度，200rpm，过夜培养。每300ml需要加2.1ml 配好的0.1 mol/L IPTG。
周2：
收菌，相应缓冲液清洗菌体3次(v5，GST;48，HIS)，保存菌体于负80度冰箱。继续配2L培养基，装6个1L锥形瓶，灭菌
周3：
按周一操作继续准备一批菌液。
周4：
准备超声波破碎菌体，离心，取上清，沉淀保存到时候跑胶。
准备跑胶样品。保存好后面一次性跑胶。
准备柱子：蛋白纯化。
周5：
蛋白超滤浓缩，透析置换缓冲液
同时跑sds-PAGE检测蛋白。
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理： 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。 准备： 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30％甘油等体积混合) 混合溶液，高温高压灭菌； 注：CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净， 高温高压灭菌； 注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 （ ）中，37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。 实验步骤： 1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分 钟，4℃5000g离心5分钟。 注：此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体 中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转 以移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，摄取外源 DNA 。 转化（ Transformation）是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M- ），它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞（ Compenent cells ）。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant ，即带有异 源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70 ℃保存（半年），因此CaCl2 法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB 液体培养基
农杆菌电击感受态的制备及电击转化 表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化 （1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。 （2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。 （3）农杆菌EHA105电击预备处理。 I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。1.5ml III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。 IV. 重复步骤ⅲ三次。 V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。 （4）电击 I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。 II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。 III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。8000rpm 1.制备农杆菌电转感受态 (1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素 100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。 (2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡 3-4小时，至OD560=0.5左右。 (3) 5000rpm离心5分钟，去上清。 (4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min. (5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。 (6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟， (7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/ 管)备用。 2 农杆菌感受态的电转化 〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。 (2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。 (3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。 (4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ， araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化.
农杆菌感受态制备与转化 普通农杆菌感受态制备与转化：方案一 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。 2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。 3. 5k rpm离心5分钟。 4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。 5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。 6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。 7. 液氮中冷冻1分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。 10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。 11. 涂板，28℃培养2-3天。 电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二 1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。（如用5mlYEP，需培养36h） 2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。 3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。 5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。 6．重复4、5步骤2~3次。 7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。 8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。 1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。 注：HEPES需现用现配。 电击法转化农杆菌感受态细胞 1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。 2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压下电击。 4．取出电击杯，加入500μl预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h。 5．取30-40μl菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28℃倒置培养
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备 【课前预习】 1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？ 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？ 【目的要求】 1、了解感受态细胞生理特性及制备条件； 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法； 【基本原理】 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。 另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效
感受态细胞的制备（DH5α） 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 概述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。本实验室一般用TSS法制备感受态。 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外
农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草 1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜； 2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5； 3）5000rpm离心5min，倒掉培养液； 4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min； 5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。 取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。 用于浸润的菌液制备 MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul) 1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜； 2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0； 3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0； 4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。
A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页） 1 材料、设备及试剂 1.1材料 大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株 1.2试剂 LB液体培养基： 蛋白胨10g/L 酵母提取物5g/L NaCl 10g/L NaOH（1mol/L）1mL/L 400mL 0.1M/L预冷的CaCl2溶液（高温高压灭菌） 50%甘油 75%酒精 95%酒精 液氮 1.3 实验设备 接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。 2 实验步骤 1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。 2、培养12～16h，取1ml培养物加入到100mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD=0.4~0.6(3~4h) 3、在无菌条件下将菌液转移到250mL离心管中，置于冰上10min. 4、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。 5、加入20mL预冷的0.1M/L CaCl2溶液重新悬沉淀，至于冰上30min（严格） 6、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。 7、加入4 mL0.1M/L CaCl2溶液及15%(最终浓度)甘油（50%的甘油1.71428 mL），重悬沉淀。 8、以100μL每管分装于1.5mL冻存管中保存于液氮。 3 试验结果 4 注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
农杆菌感受态细胞制备 第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。 注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。 第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。 注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。 第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。 注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。 摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。 4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。 6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。 7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。 注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。 8) 4℃，5000rpm 离心5min 。 9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。 10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。 注意：要用1ml 枪轻轻抽打。 11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA 片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107
一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖 5g ， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm ）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。 四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min ； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。
一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk- mk- rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。