双酶切连接反应之全攻略
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/
微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约
为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp
DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段
被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连
接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
3、转化：
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl
几个非常重要的问题
1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般
连接3小时,16度.
2. 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.
我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干
3. 对照的设立：
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时,也要进行对照.
设4个:
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克
隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培
基,连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何
酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。
希望大家不断补充。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
下面简要的说一下对照的结果。
A 只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切
B 约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%。
C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。
D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。
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Home > Technical Reference > Restriction Endonucleases
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)
Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/μg) for 60 minutes at the
recommended incubation temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100-500 colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques , 19, 56-59).
Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.
| A | B | E | H | K | M | N | P | S | X |
Enzyme Base pairs from End
%Cleavage Efficiency Vector Initial Cut
AatII
3 2 1
88 (2) 100 (2) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 NcoI NcoI PinAI Acc65I
2 1
99 (2) 75 (3) LITMUS 29 pNEB193 SpeI SacI AflII 113 (2)LITMUS 29StuI AgeI
1 1
100 (1) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 XbaI AatII ApaI 2100 (1)LITMUS 38SpeI AscI 197 (2)pNEB193BamHI AvrII 1100 (2)LITMUS 29SacI BamHI 197 (2)LITMUS 29HindIII BglII 3100 (2)LITMUS 29NsiI BsiWI 2100 (2)LITMUS 29BssHII BspEI
2 1
100 (1) 8 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 BsrGI BsrGI BsrGI
2 1
99 (2) 88 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 SphI BspEI BssHII 2100 (2)LITMUS 29BsiWI EagI 2100 (2)LITMUS 39NheI EcoRI
1 1 1
100 (1) 88 (1) 100 (1)
LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 39
XhoI PstI NheI
EcoRV1100 (2)LITMUS 29PstI
HindIII 3
2
1 90 (2)
91 (2)
0 (2)
LITMUS 29
LITMUS 28
LITMUS 29
NcoI
NcoI
BamHI
KasI 2
1 97 (1)
93 (1)
LITMUS 38
LITMUS 38
NgoMIV
HindIII
KpnI 2
2
1 100 (2)
100 (2)
99 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
pNEB193
SpeI
SacI
SacI
MluI299 (2)LITMUS 39EagI MunI2100 (1)LITMUS 39NgoMIV NcoI2100 (1)LITMUS 28HindIII NgoMIV2100 (1)LITMUS 39MunI
NheI 1
2 100 (1)
82 (1)
LITMUS 39
LITMUS 39
EcoRI
EagI
NotI7
4
1 100 (2)
100 (1)
98 (2)
Bluescript SK-
Bluescript SK-
Bluescript SK-
SpeI
KspI
XbaI
NsiI 3
3
2 100 (2)
77 (4)
95 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
LITMUS 28
BssHII
BglII
BssHII
PacI176 (3)pNEB193BamHI PmeI194 (2)pNEB193PstI
PstI 3
2
1 98 (1)
50 (5)
37 (3)
LITMUS 29
LITMUS 39
LITMUS 29
EcoRV
HindIII
EcoRI
SacI199 (2)LITMUS 29AvrII
SalI 3
2
1 89 (2)
23 (2)
61 (3)
LITMUS 39
LITMUS 39
LITMUS 38
SpeI
SphI
SphI
SfiI9
4
1 81 (2)
97 (2)
93 (2)
LITMUS 38
LITMUS 38
LITMUS 38
BamHI
MluI
EcoRI
SpeI 2
2 100 (2)
100 (2)
LITMUS 29
LITMUS 29
Acc65I
KpnI
SphI 2
2
1 99 (1)
97 (1)
92 (2)
LITMUS 39
LITMUS 39
LITMUS 38
SalI
BsrGI
SalI
XbaI 1
1 99 (2)
94 (1)
LITMUS 29
LITMUS 29
AgeI
PinAI
XhoI197 (2)LITMUS 29EcoRI
XmaI 2
2 98 (1)
92 (1)
pNEB193
pNEB193
AscI
BssHII
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Home > Technical Reference > Restriction Endonucleases
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)
To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment.
The experiment was performed as follows: 0.1 A 260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and γ-[32P] ATP. 1 μg of 5′ [32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20 units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs.
As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops. | A | B | C | E | H | K | M | N | P | S | X |
Enzyme Oligo Sequence
Chain Length
% Cleavage 2 hr 20 hr AccI G GTCGAC C CG GTCGAC CG CCG GTCGAC CGG
8 10 120 0 00 0 0AflIII C ACATGT G CC ACATGT GG CCC ACATGT GGG
8 10 120 >90 >900 >90 >90AscI GGCGCGCC A GGCGCGCC T TT GGCGCGCC AA
8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90AvaI C CCCGGG G CC CCCGGG GG TCC CCCGGG GGA
8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamHI C GGATCC G CG GGATCC CG CGC GGATCC GCG
8 10 1210 >90 >9025 >90 >90BglII C AGATCT G GA AGATCT TC GGA AGATCT TCC
8 10 120 75 250 >90 >90BssHII G GCGCGC C AG GCGCGC CT TTG GCGCGC CAA
8 10 12
0 0 50
0 0 >90
BstEII G GGT(A/T)ACC C9010
BstXI AACTGCAGAA CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 22
24
27
25
25
50
>90
ClaI C ATCGAT G
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
8
8
10
12
>90
50
>90
50
EcoRI G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HaeIII GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
HindIII C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
8
10
12
10
75
KpnI G GGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
MluI G ACGCGT C
CG ACGCGT CG
8
10
25
50
NcoI C CCATGG G
CATG CCATGG CATG
8
14
50
75
NdeI C CATATG G
CC CATATG GG
CGC CATATG GCG
GGGTTT CATATG AAACCC
GGAATTC CATATG GAATTCC
GGGAATTC CATATG GAATTCCC
8
10
12
18
20
22
75
75
>90
>90
NheI G GCTAGC C
CG GCTAGC CG
CTA GCTAGC TAG
8
10
12
10
10
25
50
NotI TT GCGGCCGC AA
ATTT GCGGCCGC TTTA
AAATAT GCGGCCGC TATAAA
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 12
16
20
24
28
10
10
25
25
10
10
90
>90
NsiI TGC ATGCAT GCA
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 12
22
10
>90
>90
>90
PacI TTAATTAA
G TTAATTAA C
CC TTAATTAA GG
8
10
12
25
>90
PmeI GTTTAAAC
G GTTTAAAC C
GG GTTTAAAC CC
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG
8
10
12
24
75
25
50
>90
PstI G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT
8
14
22
24
26
10
>90
>90
10
>90
>90
PvuI C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA
8
10
12
10
25
10
SacI C GAGCTC G81010
SacII G CCGCGG C
TCC CCGCGG GGA
8
12
50
>90
SalI GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28
30
32
10
10
50
75
ScaI G AGTACT C
AAA AGTACT TTT
8
12
10
75
25
75
SmaI CCCGGG
C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
6
8
10
12
10
>90
10
10
50
>90
SpeI G ACTAGT C
GG ACTAGT CC
CGG ACTAGT CCG
CTAG ACTAGT CTAG
8
10
12
14
10
10
>90
>90
50
50
SphI G GCATGC C
CAT GCATGC ATG
ACAT GCATGC ATGT
8
12
14
10
25
50
StuI A AGGCCT T
GA AGGCCT TC
AAA AGGCCT TTT
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
XbaI C TCTAGA G
GC TCTAGA GC
TGC TCTAGA GCA
CTAG TCTAGA CTAG
8
10
12
14
>90
75
75
>90
>90
>90
XhoI C CTCGAG G
CC CTCGAG GG
CCG CTCGAG CGG
8
10
12
10
10
25
75
XmaI C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
CCC CCCGGG GGG
TCCC CCCGGG GGGA
8
10
12
14
25
50
>90
75
>90
>90
产品价目表产品资料 订货说明各地代理NEB 新产品 技术资料NEBcutter HOME
限制性内切酶技术资料综述
怎样建立酶切反应
质量控制
限制性内切酶识别序列的十字索引
内切酶活性表
内切酶37°C下的活性
内切酶PCR反应中的活性内切酶的稀释兼容性
双酶切反应
内切酶在反应中的存活性内切酶的热失活
星号活性
甲基化酶改变内切酶识别性寡核苷酸近末端位点的酶切线性载体近末端位点的酶切切割超螺旋DNA
单链DNA的切割
Dam、Dcm和CpG甲基化(新)
CpG甲基化对内切酶的影响E.coli的dam/dcm甲基化酶切割后片段的平均长度
创造新的酶切位点
琼脂糖包埋法切割DNA
位点优势效应
大分子DNA图谱
遗传标记
NEB提供的菌株
其他E.coli菌株基因型
遗传密码表
氨基酸结构
DNA碱基对结构
核酸数据
同位素酸碱蛋白质数据
常见质粒中的基因产物寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
酶寡核苷酸序列链长
切割率%
2 hr20 hr Acc I G GTCGAC C
CG GTCGAC CG
CCG GTCGAC CGG
8
10
12
0 Afl III C ACATGT G
CC ACATGT GG
CCC ACATGT GGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90 Asc I GGCGCGCC
A GGCGCGCC T
TT GGCGCGCC AA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90 Ava I C CCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
8
10
12
50
>90
>90
>90
>90
>90 BamH I C GGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC GCG
8
10
12
10
>90
>90
25
>90
>90
Bgl II C AGATCT G
GA AGATCT TC
GGA AGATCT TCC
8
10
12
75
25
>90
>90
BssH II G GCGCGC C
AG GCGCGC CT
TTG GCGCGC CAA
8
10
12
50
>90
BstE II G GGT(A/T)ACC C9010
BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 22
24
27
25
25
50
>90
Cla I C ATCGAT G
G ATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
8
8
10
12
>90
50
>90
50
EcoR I G GAATTC C
CG GAATTC CG
CCG GAATTC CGG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hae III GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA
8
10
12
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Hind III C AAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
8
10
12
10
75
Kpn I G GGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG
8
10
12
>90
>90
>90
>90
Mlu I G ACGCGT C
CG ACGCGT CG
8
10
25
50
Nco I C CCATGG G
CATG CCATGG CATG
8
14
50
75
Nde I C CATATG G
CC CATATG GG
CGC CATATG GCG
GGGTTT CATATG AAACCC
GGAATTC CATATG GAATTCC
GGGAATTC CATATG GAATTCCC
8
10
12
18
20
22
75
75
>90
>90
Nhe I G GCTAGC C
CG GCTAGC CG
CTA GCTAGC TAG
8
10
12
10
10
25
50
Not I TT GCGGCCGC AA
ATTT GCGGCCGC TTTA
AAATAT GCGGCCGC TATAAA
ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT
AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 12
16
20
24
28
10
10
25
25
10
10
90
>90
Nsi I TGC ATGCAT GCA
CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 12
22
10
>90
>90
>90
Pac I TTAATTAA
G TTAATTAA C
CC TTAATTAA GG
8
10
12
25
>90
Pme I GTTTAAAC
G GTTTAAAC C
GG GTTTAAAC CC
AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG
8
10
12
24
75
25
50
>90
Pst I G CTGCAG C
TGCA CTGCAG TGCA
AA CTGCAG AACCAATGCATTGG
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT
8
14
22
24
26
10
>90
>90
10
>90
>90
Pvu I C CGATCG G
AT CGATCG AT
TCG CGATCG CGA
8
10
12
10
25
10
Sac I C GAGCTC G81010
Sac II G CCGCGG C
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8
12
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>90
Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28
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10
10
50
75
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8
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25
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双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 (2011-04-29 10:42:22) 转载▼ 质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定 实验目的 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法 7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法 实验原理 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。 DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常
实验三、酶切与连接 一、实验目的与原理简介 限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。 制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带； 而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面： 1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况； 4）切割与连接方式；5）接头状态。 酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种： 1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。 2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。 二、材料和试剂 限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪 三、实验步骤 1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下： 2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。 3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。 4）回收产物电泳检测后进行连接： 连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl 目的基因 6μl 质粒载体 2μl 产物酶切体系 pPI9K 质粒酶切体系 DDW 4.6μl DDW 7μl 10×H Buffer 1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段 4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut 0.2μl(37 ℃15min)
双酶切： 载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。 我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。 我的酶切体系如下： 质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng） (NEBlack Eye SfiⅠ1ul (NEBlack Eye BssHⅡ1ul 10×buf 2.2ul 100×BSA 0.2ul 水14.8ul 总体积20ul 50度，2小时。切出了370bp左右的片段，回收载体。 然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。50度3小时我试过，但是质粒有降解。酶量应该说是过量的。请问有什么办法可以酶切完全？ 粘性连接 （一）外源DNA和质粒载体的连接反应 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
植物保护２００３年１２月塑垫鲞蔓！塑！丛蔓！堕堕旦坚！型堕竺．２００ｔ！堕．！！。奠！：！ Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（北京鼎国生物技术公司）１：ＥｃｏＲＩ（０２ｐＬ）／Ｍ删Ｉ（０２ｐＬ）２：ＥｃｏＲＩ（Ｏ．３ＰＬ）／ＭｓｅＩ（０３止）３：６７一『ＹＪＲＩ．（０４￡ｔ１．）／ＭｍＩ（０．４ｖＬ）４：Ｆ“，ＲＩ（０．５ｖＬ）／Ｍ∞Ｉ（０５／ＬＬ）５：ＥｃｏＲＩ（０６ｐｌ。）／Ｍ．∞Ｉ（０．６ｐＬ）６：ＥｃｏＲＩ（ｆ）７ｆｍ）／ＭｓｅＬ（０７“Ｌ）７：ＥｃｏＲＩ（Ｏ８¨Ｌ）／Ｍ，ｅｌ（０８ｇＬ）８：ＥｃｏＲＩ（Ｏ９ｖＬ）／ＭｓｅＩ（０９ｔｚＬ） 圄１小麦基因组ＤＮＡ不同酶切用量的酶切效果 从图１可看出，５泳道的ＥｃｏＲＩ（０．６＂Ｌ）和Ｍｓｅｌ（０、６“Ｌ）的酶切效果比较理想，基因组１００～ｌ８００ｂｐ问的ＤＮＡ片段都有出现。ＥｖｏＲＩ和ＭｓｅＩ两种酶用量各为０．２ｕＬ时酶切ＤＮＡ片段为７００～Ｉ８００ｂｐ之间，各Ｈｊ０．３“Ｌ的酶切片段在５００～一Ｉ８００ｂｐ之间，各用０．４“Ｌ的酶切片段在４００～１８００ｂｐ之间，各用０．５＂Ｌ的酶切片段在２５０～１８００ｂｐ之间。由此可见，由于限制性内切酶』甘量太少，酶切不完全，基因组多态性不丰富。在６、７、８泳道则酶用量太多，既造成浪费，也容易出现酶切过头现象，产生许多低于１００ｂｐ的ＤＮＡ片段，导致接头连接不上，ＰＣＲ反应失败的结果。６、７、８泳道的两种酶总用量分别是１．４、１．６、１．８ＨＬ，都接近或超过总反应体系１５止的ｌ／１０（１，５止）。显而易见，一般两种酶的总量不能超过反应体积的ｌ／１０。２限制性内切酶的缓冲液选择 在双酶切过程中，如果两种酶反应温度一致而缓冲液不同时，可查阅内切酶供应商提供的各种酶在不同缓冲液中的话力表。如果一种缓冲液能同时使两种酶的活力都超过７０％，便可用这种缓冲液作为反应缓冲液。如果两种酶厂家不同，可比较其缓冲液成份，倘若相似，可各取一半中和，也可使用通用缓冲液。例如，作者在进行小麦抗锈基因的ＡＦＬＰ标记研究中，选用Ｅ∞Ｒｌ（上海生工）和ＭｓｅＩ（纽英伦生物有限公司）两种限制性内切酶，分别查阅并比较了卜述公司的酶在不同缓冲液中的活力表，确定用ＢｕｆｆｅｒＹ＋／ＴＡＮＧＯ…（表１）。 从表１可见，ＥｃｏＲＩ和Ｍ”Ｉ两种酶在２倍Ｂｕｆｆｅｒｙ＋／ＴＡＮＣｒ）ＴＭ中括力均为１００％，而且没有过度消化现象。因而选用２倍液Ｂｕｆｆｅｒｙ＋门＂ＡＮＧＯ＂‘” 寰１限制性内切酶ＥｃｏＲ［和ＭｓｅＩ在苇同缓冲液中韵酶活力情况 １）ＨｕｆｆｅｒＢ＋（蓝）Ⅲ１０ＩＩｍｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）。１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；２）ＢｕｆｆｅｒＧ＋（绿）：１０ｍｍｏ］／Ｉ，ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）．１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，５０ｍｍｏ］／Ｉ。ＮａＣＩ，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；３）ＢｕｆｆｅｒＯ＋（橘）：１０ｍｍｏ［／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７５）?１０ｎｍａｏｌ／ＬＭｇＣＩｚ，１００ｍｍｏ［／ｌ—Ｎ《１．０１ｍｇ／ｍｌ。ＢＳＡ；４）ＢｕｆｆｅｒＲ’（红）：ｉｏｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８５），１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌｚ，１００ｍｍｏｌＡ—ＮａＣ［。０１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；５）ＢｕＨｅ“＋，ｌ＇ＡＮＧＯⅢ：３３ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ８ｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７９），１０ｍｍｏｌ／Ｉ，Ｍｇａｅｅｔｓｔｅ，６６ｍｍｏｌ／ＬＫＲｅＳｔａｔｅ，０１ｒａｇ／ｍＬＦＫｑＡ。 作为２种内切酶的通用缓冲液。 ３酶切时间 酶切时间是双酶切时较易忽略的问题，但却是酶切成败的关键。酶切时问过长，许多酶可能出现新的活性，就不能在原定的酶切位点切割，使接头连接不上，ＰＣＲ反应无结暴。在作琼脂糖检测时，Ｍａｒｋｅｒ１００ｂｐ条带下方出现一片弥散，很可能就是酶切时间太长所致。因为ＡＦＬＰ经过ＰＣＲ反应扩增出的产物主要在１０００ｂｐ左右，范围可在１００～１５００ｂｐ之间，小于１００ｂｐ的小分了量片段，接头可能连接不ｒ。这是引起ＰＣＲ扩增不出结果的原因之一。酶切时间太短，酶坷Ｊ不完全，酶切片段就不能覆盖整个基因组，影响ＰＣＲ扩增的多态性。 一般来讲，酶切时间长短与酶的性质有关，具体
DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析
酶切、片段回收与连接 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。 关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收 基因文库的建立为重组DNA研究工作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。 基因工程(gene engineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coli B一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coli DNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA 片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。 1 材料与设备 1.1 试供材料 大肠杆菌、质粒DNA 1.2 试剂准备 质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4 Buffer、LB 固体培养基、等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 2 实验步骤 2.1 提取质粒DNA 这个步骤由老师完成 2.2 酶切
1、DNA纯度 一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度： (1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白 发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中 呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。 (2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质， 就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生 非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结 合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA 片段的定性分析。 (3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 (4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂 质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现 酶的第二活性。 2、DNA甲基化 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在 的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。Dam甲基化酶在5’GATC3’ 的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。若出现甲基 化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限 制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜 使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。 3、星号活力 又称第二活力，是指该改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。 由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。如EcoRI的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。 高浓度甘油、高PH、低离子强度、β-巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星号活力。厂家提供的酶一般存放在50%甘油溶液中，若酶量站反应体系的1/10以上，将可能导致星号活力。小的反应体系若长时间在恒温水浴锅中进行酶切反应，因Eppendorf管里的内外温差将导致水分蒸发，蒸气凝结在盖子上而使反应体积缩小非常明显，将改变反应体系的组成，而容易产生星号活力，因此长时间进行酶切反应，宜使用空气恒温箱为保温设备，可避免水分蒸发和凝结。 4、终止限制性内切核酸酶反应的方法 (1)加EDT A以Mg2+,使酶失去辅助因子而终止酶切反应； (2)65℃下保温5-10min而使酶失活。但是有些酶在此温度下仍有活性，这种酶就不能 用高温失活方法来终止酶切反应； (3)加SDS至终浓度0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变形； (4)用等体积酚抽提酶解产物，这种方法使酶活性丧志最彻底，灭火后的样品用乙醇沉 淀法回收DNA；
酶切反应建议 一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 二、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 四、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容， 五、缓冲液 对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 六、反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的
双酶切编辑 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 目录1简介 2连接反应 3注意事项 1简介编辑双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。 2连接反应编辑1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基
③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化 一、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定 碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 2.DNA的酶切反应 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3.DNA的连接 在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步： ①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷 化 ③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 二、实验器材与处理方法（参照） 1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒 2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液 3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液 4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I 5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水 6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭 菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备 7、恒温水浴槽 三、实验步骤 先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法） 1.酶切反应（按情况加大反应体系） 取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂 ↓ 混匀；4000rpm离心30s,甩至管底 ↓ 37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）
原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 转自医学教育网的一篇贴子，很精彩，希望大家有做到的一定仔细看看，也添加了一些自己的体验。希望大家继续补充 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： https://www.doczj.com/doc/1c18131947.html,/upload/2006/08/13/31219184.pdf。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA 的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl 的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题