反刍动物源枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
青岛农业大学
毕业论文
题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名：
学院：动物科技学院
专业：动物医学
班级： 1001
学号：20105254
指导教师：温建新
2014年6月5日
反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
动物医学专业袁如意
指导教师温建新
摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。
关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定
Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from
Ruminants
Student majoring in veterinary medicine Yuan Ruyi
Tutor Wen Jianxin Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin,
penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.
Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification
引言
枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌[1]，可降低肠道内氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体内致病菌[2]，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活[3-5]。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，可将淀粉转化为单糖，能提高动物对饲料中营养的消化和吸收率；其还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参加机体新陈代谢，利于动物机体吸收，使动物保持健康状态；还具有降解碳水化合物的酶如纤维素酶、葡聚糖酶[6-7]。
枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥了巨大作用，并且已经得到广泛的应用。针对鸡、猪、水产等已有大量报道，丁祥力等利用枯草芽孢杆菌WH-5净化水产养殖厂的水[10]，魏姗姗等从健康仔猪空肠黏膜分离到23 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌[11]，虽然枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物中还没有广泛应用，但近年来，枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物养殖中的研究越来越多。本试验从健康奶牛粪便中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考，并为枯草芽孢杆菌作为反刍动物微生态制剂的研制和应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 样品来源
新鲜的荷斯坦成年牛牛粪便，取自青岛某奶牛养殖场。
1.2 主要试剂
MYP、LB培养基、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、细菌微量生化鉴定管、三糖铁琼脂、
革兰氏染色试剂盒均购自北京陆桥技术有限责任公司。细菌微量生化反应管、药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。0.5%沙黄、5%孔雀绿溶液自配。
1.3 仪器和设备
SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司LED-2）、电热恒温培养箱（山东龙口市先科仪器公司YY0027-90）、XSP-2C生物显微镜。
1.4 方法
1.4.1 菌株的分离纯化
取菌液接种于MYP培养基平板上，置于37℃恒温培养箱培养18 h；挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落进行纯化培养，将分离纯化后得到的菌株命名为“菌K”。
1.4.2 染色镜检
1.4.
2.1染色
采用革兰氏染色法，见文献[13]。
1.4.
2.2 芽孢染色
采用孔雀绿沙黄染色法，见文献[13]。
1.4.3 生化试验
按照常规试验方法对菌K进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、产类淀粉化合物测定试验、柠檬酸盐试验、TSI试验、过氧化氢酶（触酶）试验、KOH试验、脲酶试验、明胶液化等试验。
1.4.4 16S rDNA的PCR扩增和序列分析
将菌K接种于5 mL LB肉汤中摇菌10 h，取4mL菌液10000r/min离心2min，参考《精编分子生物学实验指南》的方法提取DNA。
在参考了国内外相关文献后[19]，由华大生物工程有限公司合成了一对芽孢杆菌属特异性引物：Primer 1：5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，Primer 2：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'，预期扩增片段长度为1436 bp。
PCR反应体系：总体系25μL ，DNA模板2μL，上下游引物各加1μL，10 ×buffer 2.5μL，dNTP2.5μL，Taq酶0.5μL，ddH2O15.5μL。PCR反应条件为：94℃预变
性2min，95℃变性45s ，58℃退火50s，72℃延伸1min，72℃，10min，共32个循环，4℃保存。
PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果采用BLAST 软件和GenBank数据库中的国内外相关芽孢杆菌16S rDNA 的序列对比，用Clustal X Method 进行同源性比较。
1.4.5药敏试验
按照扩散法在MYP培养基上进行药敏试验，见文献[13]。
1.4.6安全性试验
选取体重为30~40 g的小白鼠10只，每组5只。取菌液浓度约为1011cfu/mL 的LB肉汤，对空腹8 h的试验小鼠每天一次经口灌胃0.3 mL，同时设空白营养肉汤对照组。每天观察和记录，14 d后结束试验，剖检观察内脏及组织器官变化。
2 结果
2.1 形态学观察
观察MYP培养基，为干燥型菌落，灰白色，无光泽，表面粗糙。革兰氏染色阳性，菌体呈长杆状，芽孢中生，椭圆形，染色为绿色，菌体呈红色。
芽
孢
图2-1 菌K菌落形态（1000×）。图2-2革兰氏染色（1000×）。图2-3 菌K芽孢染色（100×）。
2.2 生化试验结果
菌K的生化试验结果见表2-1。
表2-1菌K生化试验结果
菌K 菌K 菌K 葡萄+ 山梨醇+ 明胶液+
蔗糖+ MR试验+ 触媒试+
乳糖+ VP试验- KOH试-
甘醇+ 淀粉水+ 脲酶试+
麦芽糖+ 产类淀
粉化合
+ TSI试
验
A/A
+；-
蜜二- 吲哚试+
木糖+ 柠檬酸-
注：“+”表示阳性，“”表示阴性；TSI（三糖铁培养基）上反应情况：斜面/底面，A：产酸（黄色）；K：产碱（红色）；+：阳性；-：阴性。产气；H2S
根据《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌鉴定手册》[15]，上述结果均属于芽孢杆菌属的生化特性，证明分离菌为芽孢杆菌属。
图2-4甘醇、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵试验阳性，蜜二糖发酵试验阴性。
1. 接种菌K
2.未接菌K对照
2
1 2
1
图2-5 山梨醇发酵试验阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K对照
图2-6木糖发酵试验为阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K对照
1 2
图2-7 接种菌K的培养基呈红色，MR试验为阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K对照图 2-8 枯草芽孢杆菌VP试验为阴性。
1. 接种菌K
2.未接菌K对照
图2-9在淀粉培养基培养的菌K菌落处滴加革兰氏碘液。图2-10 5min后，革兰氏碘液消失，菌K淀粉水解试验为阳性。
2
1 2
1
滴加碘液碘液消
图2-11接种菌K 的试管戊醇层呈玫瑰红色，吲哚试验为阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K 对照
图2-13 接种菌K 的西蒙氏培养基仍为草绿色，柠檬酸盐试验为阴性。 1. 接种菌K 2.未接菌K 对照
图2-14 接种菌K 的三糖铁培养基斜面和底面
均为黄色，并且产气。 1. 接种菌K 2.未接菌K 对照
图2-12 接种菌K 的培养液滴加碘液后为淡蓝色，产类淀粉化合物测定试验阳性。 1. 接种菌K 2.未接菌K 对照
2
1
1
2
空白对照
2
1 2
1
2.3 PCR 鉴定结果
对菌K 进行16S rDNA 的PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500bp 左右有特异性条带（如图2-29）。
图2-17 接种菌K 的尿素酶发酵管呈浅粉红色，脲酶试验阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K 对照
3.阳性对照
图2-18 接种菌K 的明胶20℃时为液体，明胶液化试验为阳性。
1. 接种菌K
2.未接菌K 对照
图2-15 菌K 使过氧化氢分解产生气泡，触媒试验阳性。1. 接种菌K 2.未接菌K 对照
图2-16 KOH 试验阴性。无拉丝现象，
2
1
2 1
3
2
1
M 1 2
2：菌K 将分离的菌株K的PCR产物送北京华大生物公司测序，测序结果与其他从GenBank下载的芽孢杆菌属的相关序列进行同源性比较。结果显示菌株K的核酸序列与Bacillus subtilis strain CICC 10023 (GU980947.1)的同源性最高，达到了99.9 %，因此该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。
2.4 药敏试验结果
对菌K进行了药敏试验，得到菌株对多种抗生素的药敏结果，如图2-19，图2-20，图2-21，图2-22，图2-23，图2-24，图2-25，并判断菌K的耐药性，如表2-2。
图2-19 1、2、3、4、5、7对菌K有抑制作
用，6对菌K无抑制作用。
图2-20 7、80对菌K有抑制作用，6、9、
10对菌K无抑制作用。
图 2-29 菌K的
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
图2-21 11、12、13、14、15、16、17对
菌K均有抑制作用。
图2-22 18、19、20、21、23、○1、○2对
菌K均有抑制作用。
图2-23 ○4、○7、○8、○9对菌K有抑
制作用，○3、○5、○6对菌K无抑制作用。
图2-24 ○
11、○12、○13、
○
14对菌K有抑制作用，○10对菌K无抑
制作用。
图2-25 ○
15、○
16、○
17、○
18、○
19对菌K均
有抑制作用。
注：在“图2-19，图2-20，图2-21，图2-22，图2-23，图2-24，图2-25”中，1乳酸环丙沙星，2盐酸环丙沙星，3甲磺酸培氟沙星，4硫氰酸红霉素，5乙酰甲喹，6甲硝唑，7氟苯尼考， 8盐酸多西环素，9盐酸林可，10克林霉素，11延胡索酸泰妙菌素，12粘菌素，13头孢他啶，14头孢克肟，15头孢噻肟钠，16头孢曲松钠，17硫酸阿米卡星，18硫酸链霉素，19单硫卡，20安普霉素，21庆大霉素，23硫酸TMP，○1克拉霉素，○2链霉素，○3洁霉素，○4氟苯尼考，○5青霉素，○6万古霉素，○7新霉素，○8丁胺卡那霉素，○9复方新诺明，○10杆菌肽，○
11强力霉素，○
12庆大霉素，○
13红霉素，○14多粘菌素B，○
15阿奇霉素，○
16诺氟沙星，○17麦迪霉素，○
18四环素，○19先锋霉素Ⅳ。
表2-2 枯草芽孢杆菌的药敏试验结果
抗菌药物名称纸片含药
量（ug/
片）
抑菌圈直径判断
标准（mm）
枯草芽孢
杆菌
试验结果
R I S
乳酸环
丙沙星
5 ≤15 16-20 ≥21 27mm S
盐酸环
丙沙星
5 ≤15 16-20 ≥21 26mm S
氟苯尼
考
30 ≤12 13-17 ≥18 22mm S
克林霉
素
2 ≤14 15-20 ≥21 7.8mm R
多粘菌
素
300 ≤8 9-11 ≥12 19mm S
头孢噻
肟钠
30 ≤14 15-22 ≥23 27mm S
头孢曲
30 ≤13 14-20 ≥21 30mm S 松钠
30 ≤14 15-16 ≥17 19.8mm S 硫酸阿
米卡星
10 ≤12 13-14 ≥15 21mm S 庆大霉
素
克拉霉
15 ≤13 14-22 ≥23 8.9mm R
素
链霉素10 ≤11 12-14 ≥15 0 R 青霉素10IU ≤28 ≥29 0 R
30 ≤15 ≥16 19.5mm S 万古霉
素
新霉素30 ≤13 14-17 ≥18 19mm S
10 ≤11 12-13 ≥14 23mm S 丁胺卡
那霉素
3.75 ≤24 25-31 ≥32 7.2mm R 复方新
诺明
杆菌肽10 ≤8 9-12 ≥13 16mm S 红霉素15 ≤13 14-22 ≥23 14mm I 300 ≤8 9-11 ≥12 18.2mm S 多粘菌
素B
阿奇霉30 ≤13 14-17 ≥18 18mm S
素
诺氟沙
星
10 ≤12 13-16 ≥17 0 R
四环素30 ≤14 15-18 ≥19 0 R 先锋霉
素Ⅳ
30 ≤14 15-17 ≥18 17.2mm I
注：R耐药、I中敏、S敏感
由表看出，枯草芽孢杆菌对克林霉素、克拉霉素、链霉素、青霉素、复方新诺明、诺氟沙星、四环素等有一定的耐药性，其中对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性较强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等几种抗生素表现敏感。2.5 安全性试验结果
经14 d的灌服观察，小鼠生长状况良好，无死亡现象将小鼠剖检后内脏组织器官无异常变化（如图2-26，2-27，2-28），说明枯草芽孢杆菌对小鼠无毒性。
图2-26 灌服菌液的小鼠剖检后胸腔内脏器心
脏、肺无异常变化。
图2-27灌服菌液的小鼠剖检后腹腔内
脏器胃、肠、肝、肾、脾无异常变化。
图2-28 灌服LB肉汤的小鼠内脏器官对照。
3 讨论
3.1生物学特性分析
本试验通过对疑似芽孢杆菌的菌落进行形态观察、革兰染色、芽孢染色和生化试验等传统鉴定，证明该菌属于芽孢杆菌属。通过分离的菌株K进行16S rDNA的PCR扩增，得到特异性条带，测序结果和同源性分析表明，该菌鉴定结果为枯草芽孢杆菌。证明我们从奶牛粪便中分离到的菌K为枯草芽孢杆菌，此前，张红英等[16]从人工饲养的健康三黄肉鸡的盲肠和大肠中分离出的枯草芽孢杆菌。目前，牛用微生态制剂鱼龙混杂，动物专属性不强，常常将人、猪、禽的菌种用于牛，结果效果不明显，我们从反刍动物的新鲜粪便分离到一株枯草芽孢杆菌为开辟反刍动物专用产品做一尝试。
3.2 耐药性分析
为了进一步为研制牛专用微生态制剂奠定基础，我们分别对此菌的药敏特性进行试验研究。通过对枯草芽孢杆菌40种抗生素的药敏耐药性试验，发现此菌药敏谱和耐药谱清楚，可以看出枯草芽孢杆菌对常用抗生素敏感，如环丙沙星、氟苯尼考、红霉素、阿奇霉素等。这提示我们在临床上使用枯草芽孢杆菌做微生态制剂时，应注意其与抗菌药物的配伍禁忌，以防止由于细菌对抗菌药物的敏感作用而影响枯草芽孢杆菌作为添加剂的活性和功效。
3.3 安全性分析
枯草芽孢杆菌在大多数动物肠道内被认为是过路菌[17]，但在牛粪中分离到该
菌，说明该菌对反刍动物的消化吸收有一定作用。为了验证枯草芽孢杆菌作为微生态试剂的安全性，利用该菌做了安全性试验，用浓度约为1011cfu/mL菌液灌服空腹8h的小鼠，两周后小鼠没有死亡，剖检观察小鼠腹腔和胸腔的器官也无病变，说明我们分离得到的枯草芽孢杆菌有较高的安全特性，为此菌作为微生态制剂的研究提供了有利的依据[18]。
4 结论
本试验从健康奶牛粪便中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，命名为K，为反刍动物专用微生态制剂的研究奠定良好基础。
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本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。 由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。 在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。 杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。 除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。 苏云金芽孢杆菌 杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。 苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从
苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定 09级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏指导教师—韩磊) 内容提要 本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。 关键词 苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1玻璃器皿 烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等 1.1.2实验仪器 超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等 1.1.3其他用具 研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等 1.1.4实验材料 土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉 1.2方法与步骤 1.2.1选择性培养及扩大培养 1.2.1.1灭菌前准备 1)PBA培养基的制备 PBA培养基配方（1L） 配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。
注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠） 2）灭菌器材的准备 将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 1.2.1.2灭菌 1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水； 2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟； 3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖 好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的 过程； 4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压 强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到 0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再 次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接 通电源；此后为升压保压的过程； 5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程； 6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出； 1.2.1.3样品的预处理 三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置 1.2.1.4超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。 1.2.1.5无菌操作 1）培养基的完善及分装（对照试验）
实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三实验材料 1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。 2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，
青岛农业大学 毕业论文 题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名： 学院：动物科技学院 专业：动物医学 班级： 1001 学号：20105254 指导教师：温建新 2014年6月5日
反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定 动物医学专业袁如意 指导教师温建新 摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。 关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定
Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from Ruminants Student majoring in veterinary medicine Yuan Ruyi Tutor Wen Jianxin Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations. Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
苏云金芽孢杆菌生物农药的制备伴胞晶体的分离纯化及杀虫活性 集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-
JIUJIANG UNIVERSITY 实验论文 题目苏云金芽孢杆菌生物农药(Bt制剂)的制备、伴 孢晶体的分离纯化及杀虫活性 院系生命科学学院 专业生物技术 姓名樊晓乐、严学芬、王伟、 周明宣、邹红虹 班级 B0933 指导教师张炳火 二零一一年十一月
摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。本试验采用固体培养，对一株苏云金芽孢杆菌进行了发酵，制备了Bt制剂，对伴孢晶体进行了分离纯化，采用菜地试验，检测了Bt制剂和伴孢晶体对白菜虫害的防治效果。 关键词：苏云金芽孢杆菌（Bt）；伴孢晶体；杀虫活性 前言 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，其菌体为短杆状，生鞭毛，单生或形成短链。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上），这些蛋白具有很高的杀虫活性。Bt由于具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、生物降解无残毒、所用原料简单等优点，在虫害防治中发挥着越来越重要的作用，随着对Bt研究的深入，Bt 的基因改造、毒理学研究、杀虫机理、对人类的安全性等方面的研究都对高纯度的Bt伴胞晶体提出了极大的需求。 因此，Bt伴胞晶体的分离纯化方法逐步得到了发展，如等密度梯度离心法、液体双相分离法、等电点沉淀法、离子交换分离法、碱裂解法、高速离心法和生物物理法等。 本实验采用2种液体培养基、2种培养条件对苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90％以上的芽孢脱落时处理菌体，经碱液裂解后比较等电点沉淀和液体双相分层法提取Bt蛋白的收率和纯度。 1 材料与方法
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208 专题介绍Review 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况 谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2* 1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@https://www.doczj.com/doc/1b7189662.html, 摘 要 迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在 进行测序中。已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一 直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。 关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组 Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensis Tan Shouhu 1,3 Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2* 1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@https://www.doczj.com/doc/1b7189662.html, Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.Keywords Bacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome 基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助 随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(https://www.doczj.com/doc/1b7189662.html,/genomes/lproks.cgi)。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类 第18群中的芽孢杆菌属。与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。 Bt 广泛存在于土壤、 虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病 原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、 双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho － moptera )、 直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、 螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
微生物设计性实验 枯草芽孢杆菌的分离及筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3 实验材料 3.1 选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方： 牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2 溶液或试剂 牛肉膏1.25g 蛋白胨2.5g 氯化钠1.25g 可溶性淀粉2.5g 琼脂5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。 3.4 仪器或其他用品 平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程 倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克
枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程
枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定 一、目的： 掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。 二、原理： 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。 三、材料和器皿： 显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基 孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇 四、操作步骤 菌种的分离和纯化 （1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。 （2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。 （3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。吸取上层液0.5ml 加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取 10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种 稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。 （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆 菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2 天备用。 菌种的鉴定 1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等） （1）单个菌种的形态 （2）菌种形态的观察 2.革兰氏染色 3.芽孢染色 4.菌体大小测验 5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
发酵工艺学作业 题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学院 班级学号 姓名
苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望 Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类
芽孢杆菌的分离与鉴定 实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。 实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸 牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂； 一、土壤中芽孢杆菌的筛选 A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中； （2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量； （3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6； （4）过滤：用滤纸过滤； （5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分； （6）分装与包扎：摆斜面 （7）灭菌：121℃，灭菌20min B.实验步骤： （一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。 （二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。 （三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。 （四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。 （五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。 （六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。 （七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。 (八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。 二、纯化菌株的鉴定： （一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：