CRISPR-Cas9植物基因敲除
试剂盒说明书
Cat. No. GP0138
Protocol No. PT140730-1
出版日期July.2014
南京市汉中门大街301号
南京国际服务外包产业园01栋13层A座
电话：+86-25-66776700/66776718
传真：+86-25-66776701
邮编：210036
网址：https://www.doczj.com/doc/1711810168.html,
CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒
目录
I．组份列表 (2)
II．产品概要 (2)
III．操作步骤 (3)
1. 设计Oligo DNA 序列 (3)
2. 线性化pP1C.2载体 (3)
3. 重组pP1C.2载体的构建 (3)
4. 重组pP1C.1载体的构建 (3)
IV．附录pP1C系统质粒图谱..................................................................................4-5 V．参考文献. (6)
图
Figure 1. CRISPR-Cas9工作原理示意图
Figure 2. pP1C.1质粒图谱
Figure 3. pP1C.2质粒图谱
表
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
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I．组份列表
CRISPR-Cas9基因敲除试剂盒组份如下：
Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表
组份列表含量
pP1C.1 Vector2μg
pP1C.2 Vector 2μg
贮存条件
※注意：在收到货后，请您将pP1C.1 Vector 和pP1C.2 Vector瞬时离心后再保存。
将pP1C.1 Vector、pP1C.2 Vector置于-20℃保存，且避免污染；
II．产品概要
CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒是一款高效、精准的基因编辑试剂盒，它是基于最新代的人工核酸内切酶CRISPR-Cas9而研发的，相对于传统敲除技术和TALENs\ZFNs技术而言，其操作更加简便，敲除效率最高，基因的编辑更加的精准，大大降低了脱靶机率。CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒能够适用于几乎所有植物细胞的基因修饰研究。
pP1C系列载体是CRISPR/Cas9系统在植物中应用的载体，支持使用农杆菌介导进行的随机整合以及原生质体共转的瞬时表达系统。pP1C载体系列中使用的Cas9基因及其核定位信号已经文献报道能够正常发挥其作用，并在水稻等植物中得到实践。限于CRISPR系统中trancrRNA的结构需要，以及pP1C载体中结构限制，难以将所有元件置于一个载体中并使其易于操作，因此，每一套pP1C载体至少包含两个载体，如pP1C.1、pP1C.2。
Genloci公司为您提供完整的基因敲除解决方案，从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→敲除检测→结果分析，让您的实验一次成功！
Figure1. CRISPR-Cas9工作原理示意图
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III．操作步骤
实验前，请您务必做好以下验证实验：
A．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析
靶基因的活跃度。
1. 设计Oligo DNA序列
首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：
●麻省理工学院的CRISPR Design：https://www.doczj.com/doc/1711810168.html,/
●德国癌症研究中心的E-Crisp：https://www.doczj.com/doc/1711810168.html,/E-CRISP/designcrispr.html
引物合成模板：
上游：5’_GCAA（20bp靶位点正向）_3’
下游：3’_（20bp靶位点反向）-CAAA_ 5’
其中上游的GCAA，下游的CAAA为Bbs I酶切形成的粘性末端。
示例：
正链oligo：GCAATGTACGGGAGGGACCCGTGC
负链oligo：AAACCACGGGTCCCTCCCGTACAG
将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。
2. 线性化pP1C.2载体
使用Bbs I酶切pP1C.2（氨苄抗性）载体，回收3.2kb的片段；
3. 重组pP1C.2载体的构建
将正负链oligos（100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。
然后EcoR I、Nhe I双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp的DNA片段；
4. 重组pP1C.1载体的构建
使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA 片段与酶切后的pP1C.1进行T4 DNA酶连接，转化大肠杆菌，得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体。后续可进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，农杆菌介导植物转化，筛选阳性克隆，测序验证，敲除效率检测及敲除序列比对分析等。
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IV．附录pP1C系列质粒图谱
Figure2. pP1C.1质粒图谱
pP1C.1部分序列（片段转移位置）
5’-......GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAC ACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GAATTC GAGCTCGGTACCCGGGGATCC TCTAGA GTCGACC TGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT ACC (3)
EcoR I位点：GAATTC
Xba I位点：TCTAGA
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Figure3. pP1C.2质粒图谱
pP1C.2部分序列（靶点插入位置）
5’-……CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAAC AAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGAT GATCCGTGGCA
TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCC GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTC GAATTC TGCAGTCGACGGTACCCGTTACA TAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGA TCTAGA GTCGAC (3)
转录起始位点：A
双BbsI 位点：gggtcttcgagaagacct 绿色标示的序列：sgRNA （trancrRNA ） EcoR I 位点：GAATTC Xba I 位点：TCTAGA
CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒
V. 参考文献
1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmable dual-RNA-guided DNA
endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science, 2012,337: 816～821.
2. Horvath P., Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science, 2010, 327 (5962): 167～
170.
3. Hale CR, Zhao P., Olson S., et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell, 2009, 139
(5): 945～956.
4. Zhang F., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819～823
5. Westra ER., Swarts DC., Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how
prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012, 46: 311～339.
6. Marraffini LA., Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Rev
Genet, 2010, 11 (3): 181～190.
7. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraf?ni, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas
systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233～239.
8. Hwang WY., Fu Y., Reyon D., Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficient genome
editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31:227～229
9. Liu P, Long L, Xiong K, Yu B, Chang N, Xiong JW, Zhu Z, Liu D. Heritable/conditional genome editing in C. elegans using
a CRISPR-Cas9 feeding system. Cell Research. 2014, 24(7):886～889.
10. Barrangou R. RNA events. Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science. 2014, 344(6185):707～708.
11. Nishimasu H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014,156(5)935～949.
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一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
植物基因功能诠释研究方法的新进展 (东北农业大学，150030) 摘要：本文通过阅读大量的文献，总结了植物基因功能注释研究方法的最新进展。对每种方法的原理及优缺点做了综述，拟供初学者和作相关研究者参考。 关键词：基因功能；研究方法；新进展 基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学(struc tural genomics)和以基因功能鉴定为目标的功能基因组(functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法以及统计与计算机分析为特征。功能基因组学(functional genomics)又往往被称为后基因组学(postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。[1,2]这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析，cDNA微阵列，DNA芯片等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体。 自华大基因启动“千种动植物基因组参考序列谱构建计划”和“千种植物转录组研究”以来，已完成水稻、黄瓜、马铃薯、白菜等植物的基因组序列图谱绘制，并通过对大豆的重测序研究建立了高密度分子标记图谱。这将是21世纪生命科学研究的重要领域。[3]本文将对研究基因功能的新技术及其新进展作一综述。 1 利用生物信息学方法分析基因的功能 生物信息学是利用生物信息学和电子技术(互联网技术)寻找并克隆新的未知功能的基因,着重于技术和操作层面,利用生物信息学对新基因进行电子克隆,及克隆该新基因的序列后对其进行简单的功能分析,如基因的编码区、启动子区、内含子/外显子、翻译启始位点和翻译终止信号预测,基因的同源比对,编码的氨基酸辨识蛋白质,蛋白质的物理性质,蛋白质的二级/三级结构、特殊局部结构以及功能预测等[4]。 1.1 通过序列比对预测基因功能
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
第9卷 第1期2007年3月 衡水学院学报 J o u r n a l o f H e n g s h u i U n i v e r s i t y V o l.9,N o.1 Ma r.2007植物功能基因组学及其研究技术 崔兴国 (衡水学院 生命科学系,河北 衡水053000) 摘 要:植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究.植物功能基因组学研究是利用结构基因组学积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述D N A序列的功能,从而对所有基因如何行使其职能并控制各种生命现象的问题作出回答.近年来植物功能基因组学的研究技术主要包括表达序列标签、基因表达的系列分析、D N A微阵列和反向遗传学等.对植物功能基因组学的研究将有利于我们对基因功能的理解和对植物形状的定性改造和利用. 关键词:植物;功能基因组学;研究技术 中图分类号:Q3-3 文献标识码:A 文章编号:1673-2065(2007)01-0023-04 基因是细胞的遗传物质,决定细胞的生物学形状,细胞的生物学功能最终是由大量的基因表达完成的.随着人类基因组“工作框架图”的完成,生命科学研究的重点已经从结构基因组学转移到了功能基因组学的研究,特别是模式植物拟南芥(A r a b i d o p-s i s t h a l i a n a)和水稻(O r y z a s a t i v a)基因组测序的完成,公共数据库中已经积累了大量基因序列信息,获得了许多与植物发育相关的功能基因,在此基础上应用实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能,并相应诞生和发展了一批新的研究技术,为功能基因组学的研究提供了必要而有效的技术支撑.功能基因组学研究的最终目标是解析所有基因的功能,即从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能,进而全面研究控制植物生长发育及响应环境变化的遗传机制,在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用,共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任. 1 植物功能基因组学研究 植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分形态建成和功能按一定次序而进行的一系列生化代谢反应的总合,反应在分子水平上,它要求相应的遗传代谢途径必须按照特定的时空次序严格进行以保证正常发育.植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息,通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用;研究基因组的结构、组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系;从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究.当前植物功能基因组学研究主要集中于一年生的拟南芥与水稻两个物种上,这主要是由于它们的遗传背景清楚,基因组较小,基因结构简单而且易于进行分子生物学操作.拟南芥研究组“2010计划”的宏伟目标是充分利用拟南芥基因组计划获得的序列信息并结合功能基因组研究技术来获知其25000个基因的全部功能,例如开花的诱导过程是植物生活周期中最奇妙的过程,目前从拟南芥中鉴定了提早开花和延迟开花的多种突变体,显示植物开花受多个遗传基因的控制,如延迟开花的两个突变体是由等位基因 C O(C O N S T A N S)和L D(C O L D L U M I N I D E P E N- D E N S)突变引起,这两个基因均已被克隆,并使其在转基因植物的叶片中进行表达,将C O基因转移到拟南芥中,高效表达C O蛋白的转基因植株即使处于短日照条件下也会开花,这说明C O基因具有激活开花基因的作用.对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究. 目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)c D N A全长克隆与测序;(2)获得D N A芯片 ①收稿日期:2006-10-12 作者简介:崔兴国(1963-),女,河北冀州市人,衡水学院生命科学系副教授.
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
植物功能基因组学概述 XXX* (XXXXX) 摘要：植物功能基因组学是从整体水平研究基因的功能及表达规律的科学。对植物功能基因组学的研究将助于我们对基因功能的理解和对植物性状的定性改造和利用。本文简要介绍了植物功能基因组学的概念、研究内容和研究方法。 关键词：植物；功能基因组学；ESTs；SAGE Summarize of Plant Functional Genomics XXX （XXXXX） Abstract：Plant functional genomics studies provide a novel approach to the identification of genome-wide gene expression. It is currently being widely focused on the gene expression by transcript profiling and takes us rapidly forward in our understanding of plant biological traits. In this review, comprehensive of concepts, research contents and methodologies regarding plant functional genomics and transcript profiling are described. Key words: Plant; functional genomics; ESTs; SAGE 1 植物功能基因组学 基因组学(Genomics)是20世纪最后10年研究最活跃的领域之一。基因组学是指对所有基因的结构和功能进行分析的一门学科, 1986年由美国科学家Thomas Roderick提出, 兴起于20世纪90年代[1]。基因组学研究分为结构基因组学( structural genomics) 和功能基因组学( functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主, 以研究基因序列为目标。功能基因组学(Functional genomics)的研究又被称为后基因组学(Post genomics)研究，它是利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。 植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容,它强调发展和应用整体的(基因 组水平或系统水平)实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能,其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本策略是从研究单一基因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植物。目前, 功能基因组学在水稻、拟南芥等模式植物中取得了较快进展, 主要原因在于这两种植物已完成全基因组测序工作[2], 获得了结构基因组数据, 且遗传背景清楚, 易于开展分子生物学研究, 已率先步入后基因组时代。 2 植物功能基因组学研究内容 2、1基因组多样性研究[1] *联系人Tel：XXXXX；E-mail：XXXXX
植物基因工程的重要意义 关键词：植物基因工程技术，转基因 正文： 作为21世纪科技的重要发展项目，基因工程技术在植物方面应用的意义主要体现在以下五个方面。 1．植物基因工程技术可以实现超远缘育种,克服不亲和障碍 我们知道，在作物育种中最早应用的是植物组织培养技术，这种技术已在花卉、药材、森林和农作物育苗得到广泛的应用，我国已在甘蔗、人参和马铃薯等方面收到显著经济效益。此外，还可从培养细胞或再生植株选择所需要的突变体。如Shepard(1983)从马铃薯培养物中选出一种能抗腹疫病(Phytophthorainfectans)的抗性植株以及利用培养细胞生产诸如喜树碱等化合物。但以上方法只是同类植株的基因改变。此外人们还对植物原生质体融合进行了研究。但是植物细胞融合后性状的表达，取决于它在以后有丝分裂时染色体是否发生交换或丢失情况。[1]但到目前为止，由融合的细胞而能培养成植株者容寥寥无几，这可以说是克服远缘杂交不亲和障碍的最早例子。如果说细胞融合可以克服种属之间不亲和性，而基因重组则可在更大范围内进行了。动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因,蛇、蝎的毒液基因等也已转移给作物,分别获得能发光的转基因烟草,抗寒的转基因甜菜、转基因番茄和抗虫的转基因棉花等。[2]由此可见，外源基因导入植物细胞后引发的改变是巨大的。 2．植物基因工程技术可以增强作物改良力度,促进品种更新换代 作物改良基本有两方面，其中提高作物品种的光合与养分效率、病害与虫害抗性正在成为植物基因工程的研究重点,促使作物品种适应低温、干旱、雨涝、土壤瘠薄和盐碱以及温室效应等新旧灾害从而提高作物产量，也已成为基因工程育种的主要内容。 农业生产中，增加粮食产量无非依靠两种途径:一是提高作物品种的生产能力;二是减轻环境因素对作物生长的不利影响。据报道，全世界每年因虫害、病害、草害以及寒冷、干旱、盐碱等灾害对粮食生产所造成的损失令人惊叹：全球每年因虫害与病害所造成的作物减产达30%以上，因杂草所损失的粮食至少在10%以上，再加上低温、干旱和盐碱等各种因素，全世界每年至少要损失粮食产量的一半以上。[3～5] 同时，为了防治病虫害及杂草等，还要施用大量的化学农药，这不仅消耗大量的能源，更严重的是对生态环境造成了极大的甚至是不可逆的破坏。为了摆脱上述困境，从20世纪80年代起，人们开始研究和利用转基因抗性植物来预防病虫害和杂草等，并收到了良好的效果。与传统作物育种技术相比，利用基因工程技术进行遗传育种有其自身的优势，一方面由于它可以将特定的抗性基因定向转移，因而成功率较高，可大大提高选择效率，在很大程度上避免了传统育种工作的盲目性；另一方面是其基因来源打破了种属的界限，除了植物基因以外，动物和微生物的抗性基因都可以作为外源基因转人植物基因组中，并获得表达。[6] 3．植物基因工程技术可以拓宽应用研究,扩大生产领域 随着转基因植物技术日益成熟,利用植物的生物反应器作用,进行贵重药品、人畜疫苗和精细化工等的生产,因具有成本低,竞争力强的吸引力,正在成为高技术及其产业化的新兴热门领域。现已成功地将干扰素、胰岛素、多肽抗体、人血清白蛋白等基因转给植物进行这些药物的生产。美国现已得到多肽抗体转基因烟草,美国还在通过转基因植物研制麻疹、乙肝、艾滋病等疫苗,甚至成功地获得了口服植物疫苗。现国际上正在出现研制营养药物的新思路。此外,现还大量进行用于塑料、染料、涂料、洗涤、香料、润滑剂等的转基因植物研究。据
植物基因工程真题(2011-2013) 一、名词解释 1. Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。 2. cis-acting elemen t顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 3. subcloing: 4. Gene libray 5. Yeast Two-Hybrid Assays: 6. qRT-PCR 7. Shuttle plasmid vector 8. insert in activati on 9. cDNA library 10. RNAi 11. Gene kn ockout 12. Tran sducti on and tran sfect ion 13. DNA probe 14. En zyme-li nked immuno sorbe nt assay 15. Tran spositi onal recomb in ati on 16. EST
17. Fluoresce nee in situ hybridizati on 18. q-per 19. SNP 1. Per 反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍 温度和时间设臵间的关系? PCR 反应原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种 酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成 同样的两分子挎贝。在实验中发现， DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又 可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物， DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。 步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经 加热至（90-96C ）左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）： 模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至（ 25-65C ）左右，引物与模板 DNA 单链的互补 序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在（70-75C ）、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原 理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就 可获得更多的 ？半保留复制链？，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环 需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的反应体系： 10 X 扩增缓冲液 4种dNTP 混合物 引物 模板DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+ 加双或三烝水至 5ul 各 200mol/L 各 10?100pmol 0.1 ?2 ig 1?2 U 1.5?2.0mmol/L 50 il 反应条件：为温度、 时间和循环次数。 温度和时间设臵间的关系： 基于PCR 原理三步骤而设臵变性-退火-延伸三个温度点。 在 标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在90?95 C 变性，再迅速冷却至 40?60 C,引物 退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70?75 C,在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物 链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300bp 时）可采用二温度点法， 除变性温度外、 退火与延伸温度可合二为一， 一般采用94 C 变性，65 C 左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶 仍有较高的催化活性）。 ① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情 况下，93 C ?94 C lmi 足以使模板DNA 变性，若低于93 C 则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 致PCR 失败。 ② 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。 变性后温度快速 简单题 PCR 产物完全变性，就会导
植物分子生物学实验技术 班级：研122班 专业：作物生物技术 姓名：陕建国 学号：20122419 授课教师：红英老师
实验一：植物DNA和RNA提取方法的讨论 一、提取植物DNA和RNA的用处 提取植物组织的DNA和RNA，分析其序列，了解序列的排列顺序可以更好的从分子水平上进行研究，从分子水平上改良植物或者说农作物的一些性状、品质等。 （一）提取植物DNA的用处 DNA的提取在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，DNA 的提取效率直接决定着后续实验的成败。另外，提取植物DNA在分子育种方面也有很重要的用处。（二）提取植物RNA的用处 提取RNA 可以进行 Northern 杂交、原位杂交、RT-PCR 以及 cDNA 文库构建等很多分子生物学实验。提取RNA也是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础。 二、植物组织DNA的提取方法 提取植物DNA的试验原理： 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl 溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。 （一）植物DNA的SDS提取法：（来自You are so late的新浪空间） 试验试剂： 1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。 4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。 5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/L HCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6 氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7、 5mol/L 高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7 0.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9、1mol／L HCl。 10、0.2mol/L NaOH。 11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。
植物功能基因组学研究技术的发展 摘要：随着植物基因组学的发展，植物研究的热点转向了功能基因组学。如何确定大量的基因序列的功能，并进而了解基因与基因之间通过其代谢产物而形成的控制生物体代谢和发育的调控网络是功能基因组学研究的核心问题。在植物功能基因组学研究中，多摒弃原来传统的技术而采用新发展的方法，既省力又节源的研究基因的功能。 关键词：功能基因组学；表达序列标签技术；代谢组学；RNA干扰 二十一世纪以来，基因组学在各种模式生物基因组测序的完成的基础上发展迅速。基因组学已经产生很多个分支，比如结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学等。其中，结构基因组学是基因组学发展的初级阶段，以建立生物的高分辨率遗传图和物理图为主。功能基因组学则代表基因组学发展的新阶段，是利用结构基因组学所提供的信息，发展和应用新的研究方法，从单一基因或蛋白质的研究转向多基因和多蛋白质的综合研究的一门学科，又被称为“后基因组学”。植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能，其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式生物，近年来小麦的功能基因组学研究也在进行，主要集中于基因组中转录表达的部分。 1 植物功能基因组学中的分子标记 如何快速高效的从基因组中获取生物信息，是一个急迫并且有挑战性的课题。然而，表达序列标签（Express Sequence Tags，EST）的出现成为结构基因组学和功能基因组学连接重要依据。EST是从cDNA序列中获得的有特异性特征，能特指某个基因，它的发展成为功能基因组学发展的基础，Genbank中积累的大量EST序列不仅为新基因的发现提供帮助，而且为开发基于PCR的各种分子标记提供资源，如EST-SSR，CAPS，SNP，SRAP和TRAP等。截止2000年数据库dbEST中的主要信息统计如表1所示。
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-
基因组学课程论文 题目：植物基因组学的的研究进展姓名：秦冉 学号：11316040
植物基因组学的的研究进展 摘要：随着模式植物——拟南芥和水稻基因组测序的完成，近年来关于植物基因组学的研究越来越多。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模式植物在结构基因组学、比较基因组学、功能基因组学等领域的研究进展以及研究所使用的技术方法进行简单介绍。 关键词：植物；基因组学；研究进展 The recent progress in plant genomics research Abstract: With the completion of genome sequencing ofthe model plant-- Arabid opsis and rice，more and more researches on plant genomics emerge in recent yea rs. The research progress of the 2 important model plant--Arabidopsis and rice in structural genomics,comparative genomics,functional genomics and technology methods used in this research are introduced briefly in this paper. Keywords:plant; genomics; research advances 前言 基因组是1924年提出用于描述生物的全部基因和染色体组成的概念。1986年由美国科学家Thomas Roderick提出的基因组学是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。自从1990年人类基因组计划实施以来，基因组学发生了翻天覆地的变化，已发展成了一门生命科学的前沿和热点领域。而植物基因组研究与其他真核生物和人类基因组研究有很大的不同。首先，不同植物的基因组大小即使在亲缘关系非常近的种类之间差别也很大; 其次，很多植物是异源多倍体，即便是二倍体植物中有些种类也存在较为广泛的体细胞内多倍化( endopolyp loidy）现象[1]。基因组研究主要包括三个层次:①结构基因组学，以全序列测序为目标，构建高分辨率的以染色体重组交换为基础的遗传图谱和以DNA 的核苷酸序列为基础的物理图谱。②功能基因组学，即“后基因组计划”，是结构基因组研究的延伸，利用结构基因组提供的遗传信息，利用表达序列标签，建立以转录图谱为基础的功能图谱( 基因组表达图谱），系统研究基因的功能，植物功能基因组学是当前植物学最前沿的领域之一。③蛋白质组学，是功能基因组学的深入，因为基因的功能最终将以蛋白质的形式体现。 近来，以水稻( Oryza sativa）和拟南芥(Arabadopsis thaliana）为代表的植物基因组研究取得了很大进展，如植物分子连锁遗传图谱的构建，在此基础上，已经在植物基因组的组织结构和基因组进化等方面得到了有重要价值的结论; 植物基因组物理作图和序列测定的研究集中于拟南芥和水稻上; 植物比较基因组作图证实在许多近缘植物甚至整个植物界的部分染色体区段或整个基因组中都存在着广泛的基因共线性，使得我们可以利用同源性对各种植物的基因组结构进行研究、分析和利用。本文主要对拟南芥、水稻2种重要的模
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。 农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期