朱闳等：中心组台优化重组毕办酵母生产ｓ＿腺苷甲硫氨酸崩发酵培养壮
中心组合优化重组毕赤酵母生产Ｓ．腺苷甲硫氨酸用发酵培养基①朱闪②储炬③胡晓清庄英萍张嗣良袁ｑ－一”
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，国家生化工程技术研究中心上海２００２３７）
（。中国科学院上海生命科学研究院生物化学如细胞生物学研究所上海２０００３１）
摘要利用统计学实验设计方法优化了重组毕赤酵母生产ｓ一腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ）的发
酵培养基。采用中心组合设计和响压面分析对涝导相培养基中硫酸铵、甲醇和Ｌ－甲硫氨
酸三个关键因素的浓度进行了优化，使ＳＡＭ在全合成培养基上的摇瓶产量提高了６０％，
达到１．９９／Ｉ。，并考察了胞内ＳＡＭ合成酶活性的变化与ＳＡＭ积累的相关性。
关键词响应面分析，ｓ一腺苷甲硫氨酸，培养基优化，重组毕赤酵母，ＳＡＭ合成酶
ｓ一腺苷甲硫氨酸（Ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌ—Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，ＳＡＭ）是广泛存在Ｊ。动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，可用Ｊ：治疗抑郁症、关节炎、肝功能紊乱等疾患。｜】ＪＳＡＭ的制备方法主要有化学合成法、酶促转化法和发酵法三种。化学合成法得到的是消旋体，但消旋体难以被分丌；酶促转化法尽管能提高产物纯度，但成本高，一般只合成同位素标记的ＳＡＭ２。Ｓｈｉｏｚａｋｉ等筛选到一菌株．１０ｍｌ培养基小量发酵．ＳＡＭ的最终浓度为１．５５９／ＬＬ“。在培养基设计和优化过程中，与传统的单冈素实骑相比，中心组合设计和响应面分析能大大简化实验并Ｈ能反映凶子之间的交互作用１４，５］。本文利用中科院袁?｝、一等构建的表达ｓ一腺苷甲硫氨酸合成酶重组毕赤酵母６Ｉ发酵生产ＳＡＭ。根据ＳＡＭ发酵的特点，菌体先在胞内强化表达ＳＡＭ合成酶，再利用合成酶的活性催化外源Ｌ广甲硫氨酸和胞内ＡＴＰ发生合成反应生成ＳＡＭ，将整个发酵过稗分成两个阶段，即菌体生长期和诱导合成期。木文通过中心组合没计和响应面分析，对诱导台成期培养基巾的三个关键成分——硫酸铵、甲醇和酶厦Ｊ、ｉ底物卜甲硫氨酸进行了优化．并分析了胞内酶量与酶活的变化规律，有效地提高了ＳＡＭ的积累量。
１材料和方法
１．１菌株
表达ＳＡＭ合成酶的莆组巴斯德毕赤酵母
蓦鹭：蟊裂牮嬖ｊ簧呈臻巍要篙？激Ａ２牛ｚ３物４５发Ｄ酵Ｎ调ｆｔ。控Ｎ。ＶＩ
③凝瀚疑Ｎ。Ｉ：。ｊｕｃｈ．。＠）““。““（Ｐｗｈｉｚ＊ｐａｓｔｏｒｉｓ），由中科院上海生化所提供№Ｉ。南带有ＳＡＭ合成酶基因的胞内表达质粒ｐＨＣ３．５Ｋ转化ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒＬＩ菌株ＧＳｌ１５获得。
１２培养基
ＹＰＤ斜而培养基：蛋白胨２％（Ⅵ＿／ｖ），ＹＥ１％（Ｗ／Ｖ），葡萄糖２％（ｗ／ｖ），琼脂粉４％（ｗ／ｖ）。
ＢＭＧＹ摇瓶生ｉ乏相培养基：（Ｎｌｈ），ｓ０４５９／ｉ．，ＣａＳ０４Ｏ．４６５∥Ｌ，Ｉ＜２Ｓ０４９９／Ｌ，Ｍ毋０４。７Ｈ２０７．４５９／Ｌ，ｇｉｎｔ１２ｍＬ／Ｌ，ＫＩｂＰ０４６．８９／Ｔ儿｜甘油ｌ％，调节ｐＨ军５．５。５００ｍＬ摇瓶装液量５０ｍｌ。
ＢＭＭＹ摇瓶诱导相培养基：ｃａｓ０４０４６５９／Ｌ，Ｋ＾Ｓ０４９９／Ｌ，Ｍｇｓ０４‘７Ｈ１０７４５９／Ｌ，ｌＹＩ］ⅥＩ１２ｍＩ／Ｉ，ＫＨ：Ｐ０４６．８９／Ｌ，（ＮＩＬ）２ｓ０４和甲醇按不同浓度添加，凋节ｐＨ至５５。５００ｍＬ摇瓶装液量５０耐。
ＰＴＭ．：按文献［７］提供的配力配制。
１３培养条件
活化菌株，接种生长相培养，于３０％，２２０ｒｐ－ｎ，培养２４ｈ，然后补加５０％甘油（Ｗ／Ｗ）Ｉｍｌ，待甘油消耗完毕，取发酵液，于３０００ｒｐｍ离心，去上清，菌体接人诱导相培养基，进入厉导期培养。首先添加（ＮＨ４）２ｓ０４，Ｉ司时开始分批补加甲醇，每１２ｈ添加１次，共７次。培养１２ｈ后，然后开始分批补加Ｌ－甲硫氨酸，每２４ｈ补加１次，共３次。蘼导培养８４ｈ后，放瓶，测ＳＡＭ浓度。
通过预实验发现，菌体对甲醇具有一定的耐受性，当甲醇１次补加量为Ｏ．５“（１％）时，菌体可以刹片ｊ甲醇生长，使发酵液中的甲醇浓度Ｆ降。结合摇
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瓶试验的可操作性，选择每隔１２小时补加甲醇。
对诱导阶段｝ｂ）Ｊｉｌ的甲醇、（ＮＨ４），Ｓ０４和Ｌ一甲硫氨酸这三个因素进行中心组合优化。
１４分析方法
小量快速抽提细胞内ＳＡＭ：耿?定量发酵液，３０００，ｐｒｏ离心去上清，加入和发酵液等体积的１０％＝三氯乙酸于４℃抽提过夜，经离心后．将上清液过滤后从?ＩＪ取２０１３，上样ＨＰＬＣ。
ＳＡＭ的ＨＰＩ．Ｃ法定量Ｌ８Ｊ：惺ｍ离子型离ｆ交换柱Ｈｙｐｅｌｒｉｌ１０ＳＣＸ（４６ｉ１１１１１×２５０ｎｍａ），流动相为０５ｍｏｌ／Ｌ甲酸铵（ｐＨ４０），流速２ｍｌ／ｍｌｎ，检测波长２５４ｎｍ。采用外标法即根据不同浓度的ＳＡＭ标准品的峰面积所作标准曲线来定量样Ｉ帚ＳＡＭ含量。
细胞密度ＯＤｅｏｏｉ）１０定方法：菌液稀释后于波长６００ｒａｎ处以去离『．水为对照进行比色测定ＯＤ（ｓ０＝０１）读数×稀释倍数。
发酵液中甲醇浓度的测定：发酵液离心取上清，用ＧＣ一９２０气相色谱仪测定。填料为ｃｆｕ?ｏｎＤｓｏｆｂｌ０１型，色谱柱长１ｍ，内径２ｎｍ，柱温１３５℃，汽化窒温度１７０％，检测器温度１７０％：，ＣＤＭＣ色谱工作站进行分析。
胞内ＳＡＭ合成酶活力测定：将发酵液离心，取菌体用ｐｌＩ？４的磷酸缓冲液洗涤两遍，用趟声波破碎细胞，获得细胞内蛋白质抽提液，按照文献［６：测定ＳＡＭ合成酶活力。
ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析：取细胞内蛋白抽提液，１２（Ｄ０ｒ１）ｍ离心１０ｍｉｎ，【。清５１ｔ１进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。运用珥ｍａｔｍ丑１１Ｂｉｏｍｅｔｒｃ凝胶成像系统和ＢｉｏＤｏｅＡｎａ—ｌｙｚｅ对蛋白进行定量分析。
２结果与讨论
２１响应面分析法在优选培养基适宜浓度中的应用分析培养基中各绗成分的主效应，即其他因素不变时，某单个因素的变化对响应值的影响。实骑结果表明，在诱导培养期，甲醇、（ＮＨ４）２ｓ０４和Ｌ一甲硫氨酸对菌体内ｓ一腺苷甲硫氢酸在胞内的积累量有显著影响。闵此，利用中心组合设计对甲醇、（ＮＩＧ）２ｓ０４和Ｌ．甲硫氨酸＿＝三个凶素进行了更深入的研究。试验的培养基浓度与编码水平设置如表１（ｒ取１６８２…）所示。
在考虑三因素对毕赤酵母生产ＳＡＭ的影响时，采用ｒＢｏｘ－Ｗｉｌｓｏｎ的中心组合设计，用表１设置的三凼素五水平方式分别进行ｊ，１６组试验（结果见表２），建市二次响应面同归模型
Ｙ＝Ｐｌ＋Ｐ２‘Ｘ１＋Ｉ）３’Ｘ２＋１７４’Ｘ３
＋Ｐ５‘Ｘｌ‘Ｘ１＋Ｐ６。ｘＪ。Ｘ３
＋Ｐ７?Ｘ２?Ｘ３＋Ｐ８－ｘ１２
＋Ｉ号?Ｘ，２＋ＰｌＯ?Ｘ：２
其ｔＩｔＹ为发酵液中ＳＡＭ的浓度（ｇ／Ｌ），Ｘ１为（ＮＩＬ）２Ｓ０４的浓度（∥Ｌ），＆为甲醇补加量（ｍｌ／次），ｘ３为Ｌ．甲硫氨酸的浓度（ｇ／ｌ。），Ｐｌ～ＰＩＯ为各相系数。
表１试验的培养基浓度与编码水平设置
对试验结果进行回归，得到同归方程：
Ｙ＝１．８７０３１＋０．０５２８８Ｘ－＋００６６８５Ｘ２
＋０１００９１Ｘ３—０．０２２５ＸｌＸ２
＋０．００７５ｘ】ｘ３＋００１７５ｘ２Ｘ３
０．０４３６６Ｘ．２—０２０８７６Ⅺ２
０１３４９４Ｘ，２
其中复相关系数的平方Ｒ＾＝０．９５４，模型预测值与试验值的相对误差很小（见表２）．说明由这■个因素同归得到的模型拟合程度很好，该方程适用下刘ＳＡＭ发酵产量高低的预测。
表２ＳＡＭ摇瓶发酵的试验设计和结果
２．２最佳培养条件的获取和验证
由图１响腑面分析立体图ｎＪ＿以看出ｘ１，ｘ二，墨
朱Ｎ等：中心组合优化重组毕赤酵母生产年腺抒甲硫氨酸用发酵培养基
存在极值点、对已回归的方程求一阶偏导，令其为０。口，以得到曲面的最大位点。此时三冈素（ＸＩ，Ｘ２，
Ｘ，）的最优试验点为（ｏ．６，０．１４，０．４），Ｙ为１．９１１。当诱导相培养基中的（ＮＨ４）２ｓ０４浓度为６．５９／Ｉ…Ｌ甲硫氨酸的浓度为５．８ｅ－．／ｃ（分三次补加，每次补加１９３９／Ｌ），每次补加０．３１４ｍ１．甲醇（０．６２８％Ｖ／Ｖ）时，理沦ｆ：诱导培养８４小时ＳＡＭ的浓度可以达到１９１１９／Ｉ．，。
图１响应面分析图
为验证预测的结果，用以卜得到的最优方法重复二＝次，摇瓶发酵ＳＡＭ的最终浓度为１．９９／Ｌ，试验值与模型预测值（１９儿∥Ｌ）的柏对误差为０．５７６％。预测值与实验值之问良好的拟合性证实了模型的有效性．回灿方程为ＳＡＭ的发酵提供ｒ一个合适的模型。
‘Ｉ优化前相比，硫酸铵浓度４，５９／Ｌ、Ｌ广甲硫氨酸浓度５９／Ｉ．、每次补加０．２ｍＬ甲醇的培养力式，在全合成培养基上ＳＡＭ摇瓶积累量提高了６（）％。
２．３讨论
利用毕亦酵母高密度培养来转化牛产ＳＡＭ与直接表达其他外源蛋白不同，它是利用强化表达具有?定活性的ＳＡＭ合成酶，冉利用胞内ＡＴＰ将外源添加的Ｌ一甲硫氨酸催化合成生成ＳＡＭ。其最终的积累量由两力面决定：（１）酶促转化合成的ＳＡＭ的量；（２）体内代谢消耗的ＳＡＭ的量。ＳＡＭ是胞内产物，只有当合成速率人于消耗速率时，才能在菌体内积累。为进一步探讨导致最终优化结粜的生物学原因，分析了巾心组合试验中９～１５号、刘照和优化后的实验结果，这９组摇瓶的发酵参数见表３。并将胞内蛋白进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析（见网２）。ＳＡＭ合成酶的分子量为４２ｋＤ，设】０泳道Ｍａ＠ｅｒ在４２ｋＤ的蛋白量为１，其它各泳道相对蛋白含量址表４。
表３优化前后摇瓶发酵参数对比
川马菌浓残留甲醇浓度Ｓ．４２，１产量ＳＡＭ合成酶酶活
出’
（ＯＤ曲）（％）（∥１．）（ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｍｌｂｒｏｔｈ）
９。４９０．４Ｉ６２０１１３
１０“６００．３８１７７０１３４
１ｌ’４６０ｌ，１２００８７
１２。５８２１３４０１２４
１３１５８０４１１２５０１４５
１４。５９０５３６３０１５ｌ
１５‘５６０４１．８８Ｏ１４５
对照５０００１１２０ｌｌＪ
优化后５７０．５ｌ９０１４３
＊９、１０、１１、１２、１３、１４、１５为中心组台设计中的实验组号
１８３～
高技术通讯２００６年２月第１６卷第２期
～７道：表３中９～１５组的胞幽垄白．８、９道：对照和优化后胞内噩［』
ｌＯ遭：蛋白质分子量标准；ｓＡⅥ合成酶几约为４２ｋ１）
图２摇瓶优化前后胞内ＳＡＭ合成酶Ｓ１Ｘ＇Ｓ．ＰＡＧＥ分析
表４ＳＡ３，＇Ｉ台成酶酶量相对含量
泳道
臻白柑对虽
由优化结果可知，硫酸铵的添加量为６５９／Ｌ时，ＳＡＭ的积累量最高，其原凶ｎｒ能为：硫酸铵较低时．导致氮源１：足。从表３ｑｔ９”看到，由于硫酸铵不足（０．８∥Ｌ），使得单位体积发酵液中的ＳＡＭ合成酶酶活低，影响了ＳＡＭ的积累。硫酸铵过量时，义町能刺激菌体过度生长，ＳＡ＇Ｖｌ作为代谢中问体被绌胞利用，从而影响ｒＳＡＭ在胞内的积累：，从表３中１０＋看到，硫酸钱过量（９２９／Ｌ），发酵液中的菌体浓度高，但单位发酵液－｝，的胞内累积的ＳＡＭ却比优化后ＳＡｔ＇，Ｉ积累量少。
由优化结果可知，每次补加０．３１４ｍｌ甲醇时，ＳＡＩＶｌ的积累量最高，其原凼Ｈｒ能为：甲醇是ＡＣ，Ｘ肩动子的诱导物，又是诱导合成期的唯一碳源。甲醇补加量不足时，可能会使诱导不充分，限制ｓＡＭ合成酶的表达；而日．导致碳源不足，影响细胞的正常代谢，从表３巾ｌｌ。、图１中的１１‘电泳条带和表４中第３泳道对应的蛋白含量看到，甲醇补加量少，发酵液广ｒｌ的甲醇残留量为０，细胞内的ＳＡＭ合成酶量少，对应的发酵液中的酶活也低．使得最终的ＳＡＭ浓度小高。甲醇过量时，ｎｒ能会造成甲醇中毒。从表３中１２一看到，发酵液中的甲醇残留浓度很高，达２％，但Ｓ？ｄＶＩ最终浓度不高。
由优化结果可知，Ｌ一甲硫氢酸的添加量为５．８９／Ｌ时，ＳＡＭ的积累量最高，其原因可能为：Ｉ．．甲硫氢酸是ＳＡＭ合成酶的底物，其只有一个适当的浓度才会让Ｔ程蔚有充分的酶反应底物。从表３中１８４一】３１看到，该组发酵液中的酶活高，可能是因为补桶的Ｌ广甲硫氮酸少（１．６４ｄＥ）．使得胞内酶反应的底物Ｌ一甲硫氨酸不足，导致ＳＡＭ的终浓度低，从表３１，１４”看到，Ｔ，甲硫氨酸补加量大（８．３６９／Ｉ．），可能是凼为过量的Ｌ。甲硫氨酸会对酶反应或者相关代埘不利，发酵液中的ＳＡＭ浓度只达到１，６３９／Ｌ。
硫酸铵、甲醇和Ｌ－甲硫氢酸这三个关键崮素Ｈ有都处在?个合适的浓度时才能使工程菌的ＳＡＭ合成酶得到克分表达，表达的酶蛋白活性高，进而、止ＳＡＭ大量积累。罐发酵培养和摇瓶发酵培养存在一定的差异，如罐发酵培养是通过补加氨水来提供氮源但是秤罐发酵培养时，运用摇瓶优化的结果，根据摇瓶发酵时甲醇和Ｌ一甲硫氨酸的比消耗速率米控制甲醇和Ｉ．一甲硫氨酸的补加速牢．取得Ｊ’良好结果，使ＳＡＭ的积累量达到】４∥Ｌ，比目前文献报道的最大积累量１０＿８∥Ｕ“提高了２８％左“。
３结论
雹组毕赤酵母构建可以影响ＳＡＭ合成酶的挺达量，而发酵培养条件则会综合影响ｓＡＭ合成酶的表达量和活陛。实验汪明，运用中一ｔ２＇组合设计和响应面分析对毕赤酵母发酵生产ＳＡＭ培养壁优化是非常有效的。运用模型优化出的发酵培养基，ＳＡＭ的最终浓度可以达到１．９９／Ｌ，比未优化前的最终浓度１
２９／Ｉ．提高，近６０％；比用复合培养基发酵的最
朱闪等：中心组合优化重组毕赤酵母生ｔ乱ｓ＿腺苷甲硫氨酸片ｊ发酵培养基
终浓度ｌ７２９／Ｌ也提高ｒ近１５％，且培养基更为经济，而有利于后续的分离提取。
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ｓｙｎｔｈｅｌａｓｅ
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中心组合优化重组毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸用发酵培养
基
作者：朱闪， 储炬， 胡晓清， 庄英萍， 张嗣良， 袁中一， Zhu Shan， Chu Ju， Hu
Xiaoqing， Zhuang Yingping， Zhang Siliang， Yuan Zhongyi
作者单位：朱闪,储炬,胡晓清,庄英萍,张嗣良,Zhu Shan,Chu Ju,Hu Xiaoqing,Zhuang Yingping,Zhang Siliang(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,国家生化工程技术研究中心,上海
,200237)， 袁中一,Yuan Zhongyi(中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞生物学
研究所,上海,200031)
刊名：
高技术通讯
英文刊名：CHINESE HIGH TECHNOLOGY LETTERS
年，卷(期)：2006，16(2)
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