中药注册分类8 药学研究资料7
药学研究资料综述
(十味降糖丸（浓缩丸）)
课题名称十味降糖丸（浓缩丸）
研究单位 xxxx制药有限公司
申报单位 xxxx制药有限公司
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药学研究资料综述
一、工艺研究资料及文献资料
（一）药材的分拣去杂质及质量验收
处方各中药材，经分拣去杂质，按中国药典20xx年版一部有关规定检验; 其余各原辅料药按中国药典20xx年版二部有关规定检验，符合规定者备用。
（二）配料与掺混
符合规定的药材根据生产批量大小，按处方称量配伍，将拟用不同方法提取的药材及粉碎的药材分别掺混，分开放置。
（三）粉碎
根据生产工艺需要，将需粉碎药材用中药粉碎机粉碎，过100目筛，备用。经对三批中试产品粉碎工艺考查，结果表明常规粉碎方法即可符合本品生产需要。
（四）提取工艺选择试验
根据处方中各药材所含主要成份的理化性质选择不同的提取方法，葛根、五味子适宜乙醇溶液提取，其余黄芪等六味适宜水提取。
（1）葛根、五味子的提取工艺
提取药材葛根、五味子。根据各药味所含成分的理化性质，适宜采用乙醇溶液提取，故采取正交试验优化乙醇溶液提取工艺条件。
取提取药材，按原处方量配伍，制备工艺正交试验用样品。每正交试验样品药材重525g，其中葛根300g、五味子225g。
表1、因素水平表 L9（34）正交表头
水平因素
因素
A加溶剂量（倍） B浓度（℅） C提取次数（次） D提取时间（小时）
1 2 3 10 95 3 3
8 75 2 2 6 50 1 1
表2、正交试验设计表
试验号
因素
A加溶剂量（倍） B浓度（℅） C提取次数（次） D提取时间（小时）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 95 3 3 10 75 2 2 10 50 1 1 8 95 2 1 8 75 1 3 8 50 3 2 6 95 1 2 6 75 3 1 6 50 2 3
取每正交试验样品525g，依表2设计加溶剂量、回流时间、回流次数，分别提取，放冷，滤过，合并滤液，静置，取上清液浓缩，干燥至恒重后以干膏与葛根素的积作为评价指标。
由上述极差分析数据表明：加溶剂量为显著因素，其次为回流次数、回流时间、溶剂浓度，因此最佳提取方法为A1B2C1D1，由于C1和C2、D1和D1、B1和B2相差甚微，考虑到实际生产的能源问题，采用加75%乙醇溶液10倍量，回流提取二次，每次2小时。
确证实验：
取两份确证实验样品，每份样品中葛根300g、五味子225g，适当破碎，加10倍量75%乙醇溶液回流提取二次，每次2小时，滤过，合并滤液，静置，取上清液浓缩，烘至恒重，称量。按质量标准测定干膏中葛根素含量。由两份确证实验数据表明：加75%乙醇溶液10倍量，回流提取二次，每次2小时的提取方法与最优方法相当，且重复性良好。
（2）黄芪等六味药的提取工艺
提取药材黄芪、地骨皮、知母、山药、天花粉、鸡内金。根据各药味所含成分的理化性质，适宜采用水提取，故采取正交试验优化水提取工艺条件。
取提取药材适当破碎，按处方量配伍，制备工艺正交试验用样品。每正交试验样品药材重
2325g，其中黄芪450g、地骨皮750g、知母300g、山药300g、天花粉375g、鸡内金150g。表1、因素水平表 L9（34）正交表头
水平
因素
A煎煮时间（小时） B加水量（倍） C煎煮次数（次）
1 2 3 2 10 1 1.5 8 2 1 6 3
表2、正交试验设计表
试验号
因素
A（小时） B（倍） C（次）
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2 10 1 2 8 2
2 6
3 1.5 10 2 1.5 8 3
1.5 6 1
1 10 3 1 8 1 1 6 2
取每正交试验样品2325g，依表2设计加水量，煎煮时间，次数，分别煎煮，放冷，滤过，合并滤液，静置，取上清液浓缩，干燥至恒重后以干膏量作为评价指标。
由极差分析结果可得出，其中因素C (次数)为显著因素，其次为B（加水量），而A（时间）影响最小，即C> B > A。最优条件为A1B1C3；由于煎煮三次与二次相差较小，煎煮2小时与1.5小时差别也不大，又考虑到时间因素及实际生产因素，确定提取工艺为10倍加水量，提取2次，每次1.5小时。
正交结果确证实验
取两份样品，每确证实验样品药材重2325g，其中黄芪450g、地骨皮750g、知母300g、山药300g、天花粉375g、鸡内金150g，适当破碎，加10倍量水，提取2次，每次1.5小时，流水冷却，滤过，合并滤液，静置，取上清液浓缩，干燥至恒重，评价。实验结果重复性及稳定性均好。干膏量与正交表中最优者相当。说明正交选定的工艺可以在生产中采用。
（五）成型工艺条件的选定
1.格列本脲混合方法的选择
处方中格列本脲属于低含量原料，采用将格列本脲用等量递增法与药粉混匀，再与其它原料混匀。经此方法混合后的药粉，对格列本脲进行含量测定，混合均匀，可以满足要求。
2.制丸工艺研究
制丸常规的方法是将药粉与稠膏混匀制成软材，用制丸机制丸，由于本品稠膏量太大，无法制成软材；故将稠膏与人参细粉及适量淀粉混匀，干燥，用纯化水制成软材，制丸，结果能制出理想的丸剂。
干燥取2份样品，采用微波干燥，置70℃温度下分别在18分钟、20分钟、22分钟、24分钟、26分钟、28分钟、30分钟、32分钟，取样送检，测量水分、溶散时限。结果干燥24分钟即能使水分、溶散时限符合要求，硬度适中。
包衣、打光采用药用炭和明胶为包衣材料，按照常规的方法包衣打光，结果药丸色泽均匀，光亮，可以符合生产需要。
(六) 中试生产
取处方十倍量药材，在中试设备上试验，考核工艺稳定性，三批数据表明，工艺稳定，具可重复性和再现性。
二、质量研究资料及文献资料
十味降糖颗粒收载于国家药品监督管理局《国家中成药标准汇编》（中成药地方标准上升国家标准部分内科气血津液分册），十味降糖丸（浓缩丸）是根据十味降糖颗粒改变剂型的中药8类新药（减免临床研究），现将质量标准起草说明报告如下：
【名称】十味降糖丸（浓缩丸）
【处方】除辅料外，与原剂型标准一致。
【制法】除成型工艺外，与原剂型标准一致。
【性状】以三批中试产品的实际性状描述。
【鉴别】(1)为处方中人参的显微鉴别。三批中试产品均检出。与原剂型标准一致。
（2）为处方中人参和黄芪的薄层鉴别，经与人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品、黄芪甲苷对照品；缺人参阴性对照样品、缺黄芪阴性对照样品对照，斑点显色清晰，Rf值适宜，专属性强。予以采用。本鉴别项与原剂型标准一致。
（3）为处方中五味子的薄层鉴别，经与五味子甲素对照品、缺五味子阴性对照样品对照，斑点显色清晰，Rf值适宜，专属性强。予以采用。与原剂型标准一致。
（4）还进行了天花粉的薄层鉴别试验：取本品6g，研细，加稀乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取瓜氨酸对照品，加稀乙醇溶解，制成每1ml含1mg的溶液，作为
对照品溶液。照层色谱法（中国药典20xx年版一部附录VIB）试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，点于同一硅胶G薄层板，分别以正丁醇-无水乙醇-冰醋酸-水（8：2：2：3）和正丁醇-冰醋酸-水（5：2：3）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，与瓜氨酸对照品、缺天花粉阴性对照样品对照，阴性样品、样品、瓜氨酸对照品在相同位置均有相同颜色斑点，本品中天花粉尚未找到具特异性的薄层鉴别方法。
【检查】依照《中国药典》20xx年版一部附录(ⅠD)的有关规定对三批中试产品检查（重量差异、崩解时限、微生物限度），均符合药典有关规定。
重金属依《中国药典》20xx年版一部(附录Ⅸ E第二法)检查，三批中试产品重金属均低于百万分之五，暂不设定重金属检查项。
砷盐检查依《中国药典》20xx年版一部(附录Ⅸ F第二法)检查,三批中试产品砷盐均低于百万分之二，暂不设定砷盐检查项。
【含量测定】采用高效液相色谱法（中国药典20xx年版一部附录VI D）测定。
1.葛根的含量测定
原标准收载了葛根的含量测定方法，经验证，原方法样品制备合理，且峰形对称，分离度好，阴性无干扰，故采用原标准收载的方法作为含量测定方法。
葛根素中国药品生物制品检定所752-20xxxx
仪器与试剂
高效液相色谱仪 xx xxxx 型高压恒流泵
xxxx紫外可见波长检测器
伊利特色谱数据工作站
色谱柱 xxxxkromasil C18 5um 4.6×250mm
柱号 131********
色谱甲醇天津四友
磷酸、三乙胺为分析纯
标准曲线:
精密称取葛根素对照品适量,加甲醇制成每1ml含100μg的溶液,作为对照品溶液。
以100μg/ml的对照品溶液为母液，分别配制成50μg/ml、25μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml 的对照品溶液。
分别精密吸取上述各对照品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算，即得。
回归曲线为Y(峰面积)=26.050X(浓度)+26.995 r=0.99987
线性范围为2.5～100μg/ml,标准曲线近似过圆点,采用外标一点法定量。
供试品溶液制备方法的选择
1. 取本品适量，研细，取1g，精密称定，加甲醇40ml，回流30分钟，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.取本品适量，研细，取1g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
经试验方法②较方法①重现性好且方法简单，故采用此方法制备供试品。
精密度同一样品连续进样测定5次，相对标准偏差为1.81%,小于3.0%。
稳定性同一样品,制备后在30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时后分别测定，相对标准偏差为2.10%，小于5.0%,样品放置24小时内稳定。
重现性同一样品，取5份，各约1g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。相对标准偏差为1.85%，小于5.0%。
加样回收率取已知含量的样品5份(约1g),精密称定，分别置50ml量瓶中,各精密加入每1ml 含0.1mg的葛根素对照品溶液3ml，蒸干，精密加甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。取上述供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪，测定,平均回收率为99.94%。
样品测定对三批中试产品,采用原标准的含量测定方法测定，其结果如下。
【含量测定】葛根照高效液相色谱法(中国药典20xx年版一部附录Ⅵ D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇—磷酸盐(1：4)为流动相；检测波长为250nm；理论板数按葛根素峰计算应不低于7000。
对照品溶液的制备取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各lOμl，注入液相色谱仪，测定，即得。
原剂型标准十味降糖颗粒每袋6g，规定每袋含葛根以葛根素(C21H2009)计，不得少于2.0mg。新标准十味降糖丸（浓缩丸）每袋6g，根据原剂型标准规定及三批中试含量测定数据确定每1g含葛根以葛根素(C21H2009)计，不得少于0.35mg。
2.格列本脲的含量测定
原标准收载了格列本脲的含量测定方法，经试验，原方法峰形分离不好，格列本脲峰没有回到基线，调整流动相为甲醇—磷酸盐(12：8)，结果峰形对称，分离度好，格列本脲峰能回到基线，阴性样品无干扰，故采用修定过的方法作为含量测定方法。
仪器与试剂
高效液相色谱仪 xx xxxx 型高压恒流泵
xxxx紫外可见波长检测器
伊利特色谱数据工作站
色谱柱 xxxxkromasil C18 5um 4.6×250mm
柱号 131********
色谱甲醇天津四友
磷酸、三乙胺为分析纯
标准曲线:
精密称取在105℃烘干至恒重的格列本脲对照品适量,加甲醇制成每1ml含308μg的溶液,作为对照品溶液。
以308μg/ml的对照品溶液为母液，分别配制154μg/ml、77μg/ml、38.5μg/ml、15.4μg/ml、7.7μg/ml 的对照品溶液。
分别精密吸取上述各对照品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,计算，即得。
回归曲线为Y(峰面积)＝17.0366X(浓度)＋3.1799 r＝0.99979
线性范围为7.7～154μg/ml，标准曲线近似过圆点,采用外标一点法定量。
供试品溶液制备方法的选择
1．取本品，研细，取1g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。
2. 取本品，研细，取1g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，用加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。
同一样品按上述两种方法，每种方法制备三个供试品，分别取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，经比较三种方法测定得的含量基本一致，第一种方法重现性好，操作简单，故选用第一种供试品溶液制备方法。
精密度同一样品连续进样测定5次，相对标准偏差为1.07%，小于3.0%。
稳定性同一样品，制备后在30分钟、1小时、4小时、12小时、24小时后分别测定，相对标准偏差为1.51%，小于5.0%，表明样品放置24小时内稳定。
重现性同一样品，取5份，各约1g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。相对标准偏差为1.63%，小于5.0%。
加样回收率取已知含量的样品5份(约1g)，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入每1ml含38.5μg的格列本脲对照品溶液5.0ml，蒸干，精密加入甲醇20ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用加甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。取上述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，平均回收率为99.81%。
样品测定对三批中试产品，采用新制订的含量测定方法测定，其结果如下。
【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典20xx年版一部附录ⅥD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：甲醇—磷酸盐(12：8)为流动相；检测波长为300nm。理论板数按格列本脲峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取格列本脲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
测定法分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
原剂型标准十味降糖颗粒每袋6g，每袋相当于格列本脲1.5mg，规定每袋格列本脲应为1.2mg～1.8mg，新标准十味降糖丸（浓缩丸）每袋6g，每袋相当于格列本脲1.5mg，根据原剂型标准规定及三批中试含量测定数据确定本品每1g含格列本脲应为0.2mg～0.3mg。
【功能主治】益气养阴，生津止渴。用于非胰岛素依赖型糖尿病中气阴两虚证者，表现为倦怠乏力，自汗盗汗，气短懒言，口渴喜饮，五心烦热，心悸失眠，溲赤便秘，舌红少津，舌体胖大，苔薄或花剥，脉弦细或细数。与原剂型标准一致。
【用法用量】口服，一次1袋，一日3次。与原剂型标准一致。
【不良反应】个别患者可见低血糖反应。与原剂型标准一致。
【禁忌】妊娠妇女、糖尿性昏迷患者禁用。与原剂型标准一致。
【注意事项】 (1)本品含西药成分格列本脲，如合并使用其它化学药物应在医生指导下使用；
（2）定期复查血糖；
（3）肝、肾功能不全者慎用。
与原剂型标准一致。
【规格】每袋装6g
【贮藏】密封。与原剂型标准一致。
【有效期】暂定二年。
三、稳定性试验研究
依据《中药新药质量稳定性研究的技术要求》，将拟上市复合膜包装的十味降糖丸（浓缩丸）用十味降糖丸（浓缩丸）质量标准（草案）及《中华人民共和国药典》20xx年版一部和《中华人民共和国药典》20xx年版一部附录ⅩⅢ C微生物限度检查法对三批中试产品进行试验。经对拟上市复合膜包装的十味降糖丸（浓缩丸）置常温下放置考查六个月；又经对拟上市复合膜包装的十味降糖丸（浓缩丸）置温度40±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月(相当于常温下二年)，按稳定性重点考察项目（性状、鉴别、水分、装量差异、溶散时限、含量测定、微生物限度检查等）检测。实验结果都表明该品种放置过程中质量稳定，包装材料对质量无影响。
主要参考文献
《中国药典》20xx年版一部国家药典委员会
《中国药典》20xx年版二部国家药典委员会
《中国药典》20xx年版一部国家药典委员会
《中国药典》20xx年版二部国家药典委员会
《现代实用中药鉴别技术》人民卫生出版社
《中成药中的药材薄层色谱鉴别》人民卫生出版社