第九、十章淋巴细胞
一、是非题
1．免疫活性细胞包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞。（）
2.巨噬细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞都是抗原递呈细胞。（）
3.T细胞有辅助或抑制B细胞功能的作用。（）
4.巨噬细胞递呈抗原给T细胞受MHC-Ⅰ类抗原的限制。（）
5.白细胞分化抗原只存在于T、B淋巴细胞上。（）
6.CD4分子可表达于Th细胞上，某些条件下可表达于B细胞上。（）
7.CD28/B7分子与T细胞活化无关。（）
二、填空题
1.T细胞表面标志包括________、__________、_________、________和_______等。
2.T细胞介导_____________免疫，例如_____________反应、____________反应。
3.提供共刺激信号的CD分子包括_______、________和________等。
4.对特异抗原发生免疫应答的淋巴细胞表面有_______受体。
5.特异的免疫活性细胞有___________和_________。
6.B细胞分化的终末效应细胞是_________，介导________免疫。
7.TCR可分为__________和__________两型。TCR又与__________结合形成复合体。
8.淋巴细胞表面多种粘附分子与其相应配体的结合可提供细胞活化的_________ ，其中认为最重要的是_________与其相应配体_______分子结合所产生的刺激信号。
9.T细胞表面的__________受体有PHA和__________的受体。
10.__________细胞主要识别内源性抗原，并受__________分子限制。
11.__________细胞主要识别外源性抗原，并受__________分子限制。
12.与T细胞识别活化有关的CD分子有_______、_______、________和_______等。
13.与B细胞识别活化有关的CD分子有_______、_______、________和_______等。
三、A型选择题
1.免疫系统是指（）
A.中枢免疫器官和外周免疫器官
B.免疫器官和免疫细胞
C.免疫细胞和免疫分子
D.免疫器官，免疫细胞和免疫分子
E.细胞因子
2.组成BCR复合体的成分是（）
A.mIg、CD21和CD19
B.mIg、CD80和CD86
C.mIg、CD79а和CD79β
D.CD81、CD21和CD19
E.mIg、CD40和CD40L
3.关于T，B细胞，下列哪项不是共同的（）
A.存在于淋巴结中
B.存在于外周血中
C.存在于胸腺中
D.存在于脾脏中
E.存在于扁桃体中
4.CD5+ B细胞产生的抗体类别是（）
A.IgA
B.IgD
C.IgG
D.IgE
E.IgM
5.具有细胞毒作用的淋巴细胞是（）
A.B淋巴细胞和NK细胞
B.Tc细胞和NK细胞
C.Tc细胞和B淋巴细胞
D.B淋巴细胞
E.B淋巴细胞和LAK细胞
6.新生期小鼠切除胸腺后可以出现（）
A.体液免疫缺陷
B.补体缺陷
C.细胞免疫缺陷
D.巨噬细胞缺陷
E.K细胞缺陷
7.CR识别抗原的信号传递是通过（）
A.CD2
B.CD8
C.CD4
D.CD79
E.CD3
8.Tc的CDAg是（）
A.CD2＋、CD3＋、CD4＋
B.CD2＋、CD3＋、CD5＋
C.CD2＋、CD4＋、CD8＋
D.CD2＋、CD8＋、CD20＋
E.CD2＋、CD3＋、CD8＋
9.B细胞不具备的特征是（）
A.能形成E花环
B.具有smIg
C.能形成EA花环
D.不产生淋巴因子
E.能产生抗体
10.B淋巴细胞识别抗原的受体是（）
A.绵羊RBC受体
B.IgG的Fc
C.C3受体
D.SmIg
E.促有丝分裂受体
11.抗体主要由下述哪种细胞产生（）
A.嗜酸性粒细胞
B.浆细胞
C.胸腺细胞
D.吞噬细胞
E.肥大细胞
12.同时表达CD3和CD4抗原的细胞有（）
A.Tc细胞
B.Ts细胞
C.B淋巴细胞
D.T H细胞
E.巨噬细胞
13.CD4的配体是（）
A.MHC-II类分子
B.MHC-I类分子
C.CD28
D.B7
E.CD32
14.B-1细胞识别的抗原主要是（）
A.颗粒性抗原
B.蛋白质抗原
C.脂类抗原
D.碳水化合物类抗原
E.胸腺依赖性抗原
15.细胞膜上识别抗原的成分是（）
A.Ig的Fc受体
B.C3受体
C.PHA受体
D.绵羊红细胞受体
E.膜表面免疫球蛋白
16.同T细胞无关的表面标记是（）
A.E受体
B.SmIg
C.FC受体
D.PHA受体
E .HLA抗原
17.关于B细胞的错误解释是（）
A.是在骨髓内发育成熟的
B.是受抗原作用后可分化为浆细胞
C.可产生抗体
D.有绵羊红细胞受体
E.受抗原作用后可分化成记忆细胞
18.能特异性杀伤靶细胞的免疫细胞是（）
A.T淋巴细胞
B.NK细胞
C.巨噬细胞
D.嗜中性细胞
E.B淋巴细胞
19.T细胞有下列哪些膜分子（）
A.CD2和CD3
B.CD56和CD16
C.mIg和CD2
D.SPA和ConA
E.PHA和ConA
20.能与MHCⅡ类分子的非多态部位结合的膜分子是（）
A.CD2
B.CD4
C.CD8
D.CD3
E.抗原多肽
21.被称为MHCⅠ类分子受体的膜分子是（）
A.抗原多肽
B.CD4
C.CD2
D.CD3
E.CD8
22.以下关于TCR的叙述哪项是错误的（）
A.是T细胞识别抗原的受体
B.它由α、β链（或γ、δ链）经二硫键连接成异二聚体
C.其胞浆区有ITAM
D.它与CD3分子结合成复合体
E.同一T细胞克隆内的各个T细胞具有相同的TCR
23.以下关于γδT细胞的叙述哪项是错误的：（）
A.也称为TCR2T细胞
B.约占外周血T细胞的1%～5%
C.对抗原的识别不受MHC限制
D.有一定的抗感染作用
E.有一定的抗肿瘤作用
24.恒定的表达于成熟B细胞上的协同刺激分子是（）
A.CD40
B.CD40L
C.CD152
D.CD28
E.CD5
25.人成熟T细胞表面均有（）
A.CD4
B.CD1
C.CD3
D.CD8
E.CD16
26.以下哪项关于ITAM的叙述是错误的（）
A.它又称为免疫受体酪氨酸活化基序
B.它存在于CD3分子的胞浆区
C.它与转导TCR结合抗原的信息有关
D.它可与蛋白酪氨酸激酶结合
E.它是特异性结合抗原的膜分子
27.HIV壳膜蛋白gp120的受体是（）
A.CD2
B.CD3
C.CD4
D.CD8
E.CD25
28.初始T细胞表达的CD分子是（）
A.CD45RA
B.CD44
C.CD45RO
D.CD40
E.CD28
29.通过分泌TGF-β对免疫应答发挥负调节作用的T细胞是（）
A.Th1
B.Th2
C.Th3
D.CTL
E.Tr
30.通过分泌IL-10抑制巨噬细胞功能的细胞是（）
A.Th1
B.Th2
C.Th3
D.Tc
E.Tr1
31.B细胞表面的膜分子有（）
A.绵羊红细胞受体
B.CD4
C.PWM受体
D.CD3
E.C3受体
32.T、B细胞重要鉴别点是（）
A.是否参与免疫应答
B.是否参与再循环
C.是否有抗原受体
D.是否有E受体
E.是否对PWM作出反应
33.B细胞上的EB病毒受体是（）
A.CD5
B.CD19
C.CD22
D.CD21
E.CD35
四、B型选择题：
A.Tc细胞
B.Th2细胞
C.Th1细胞
D.NK细胞
E.活化的巨噬细胞
1.无需抗原预先刺激,可直接杀伤靶细胞的是（）
2.活化后分泌细胞因子,引起迟发型超敏反应的是（）
3.迟发型超敏反应中非特异性效应细胞是（）
4.需要特异性抗原刺激才能杀伤靶细胞的
是（）
A.B7
B.LFA3
C.CD40L
D.CD4
E.CD8
1.CD21的配体是（）
2.CD40的配体是（）
3.MHCⅠ类分子受体是（）
4.CD28的配体是（）
5.MHCⅡ类分子受体是（）
A.Th细胞
B.Tc细胞
C.B细胞
D.巨噬细胞
E.嗜碱性粒细胞
1.分泌穿孔素、溶解靶细胞的细胞是: （）
2.表面具有高亲和力IgE受体的细胞是（）
3.再次免疫应答中的抗原呈递细胞主要是（）
4.可参与ADCC作用的细胞是: （）
五、C型选择题
A.T细胞
B.B细胞
C.两者皆有
D.两者皆无
1.绵羊红细胞受体（）
2.补体C3b受体（）
A.T淋巴细胞
B.B淋巴细胞
C.两者都是
D.两者都不是
1.在淋巴结的滤泡和生发中心中大量存在（）
2.对抗原刺激产生特异应答（）
3.在胸腺中最多的淋巴细胞（）
4.在其表面可富集抗原（）
5.在骨髓中占优势（）
6.产生和分泌大量免疫球蛋白（）
A.SmIgM
B.SmIgD
C.两者都有
D.两者都无
1.未成熟的B细胞表面有（）
2.成熟的B细胞表面有（）
3.成熟的T细胞表面有（）
A.需补体介导
B.需抗体参与
C.两者都有
D.两者都无
1.NK细胞通过ADCC杀伤靶细胞（）
2.Tc细胞杀伤靶细胞（）
3.经补体经典激活途径杀伤靶细胞（）
A.MHC限制性
B.自身耐受性
C.两者都有
D.两者都无
1.T淋巴细胞通过阳性选择获得（）
2.T淋巴细胞通过阴性选择获得（）
3.成熟T淋巴细胞具有的特性（）
A.调理作用
B.ADCC作用
C.两者都有
D.两者都无
1.巨噬细胞具有（）
2.NK细胞具有（）
3.T淋巴细胞具有（）
六、X型选择题
1.关于T与B细胞，下列哪项是共同的
（）
A.存在于外周血中
B.存在于胸导管中
C.存在于淋巴结中
D.存在于法氏囊中
2.下列哪些标志表达在小鼠的B淋巴细胞上（）
A.PWM受体
B.LPS受体
C.IgG-FC受体
D.SRBC受体
3.细胞毒性T细胞（）
A.可识别带有抗原肽-MHCⅠ类分子复合体的靶细胞
B.与靶细胞接触后，可释放穿孔素
C.是γδT细胞
D.可非特异性杀伤靶细胞
E.与靶细胞接触后，可释放颗粒酶
4.以下关于γδT细胞的叙述哪项是正确的（）
A.在肠道黏膜和皮肤中含量较多
B.大部分为CD4-和CD8-
C.可识别非多肽类抗原
D.大部分为CD4+
E.有天然免疫作用
5.与CD28结合的CD分子是（）
A.CD40
B.CD80
C.CD86
D.CD21
E.CD152
6.B细胞的主要功能是（）
A.产生抗体
B.提呈抗原
C.参与细胞免疫
D.参与免疫调节
E.发挥细胞毒作用
7．成熟B细胞表达的mIg主要为（）
A.mIgA
B.mIgM
C.mIgD
D.mIgG
E.mIgE
8.与B细胞活化第二信号产生有关的膜表面分子是（）
A.CD40
B.CD40L
C.CD28
D.CD80
E.CD86
9.T淋巴细胞的生物学作用包括: （）
A.介导细胞免疫
B.辅助体液免疫
C.参与免疫调节
D.ADCC
E.CDC
10.有关B-1细胞的特点,正确的说法是: （）
A.具有自我更新的能力
B.产生的抗体亲和力低
C.主要识别细菌多糖类抗原
D.不需要T细胞辅助
E.主要分布于肠道派氏集合淋巴结
11.组成B细胞信号复合物的分子是（）
A.CD20
B.CD19
C.CD40
D.CD21
E.CD81
七、名词解释：
1.B细胞抗原受体（BCR）
2.T细胞抗原受体（TCR）
3.γδT细胞
4.协同刺激分子
八、问答题：
1.试述T细胞亚群及T细胞各亚群的功能。
2.简述T、B细胞主要表面Ag、表面受体及意义。
3.试述B细胞的亚群以及B细胞的功能。
4.试比较TCR和BCR的基本特征（存在部位、组成和功能）。
体外刺激淋巴细胞增殖试验 1 样品配制 精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。 2 小鼠淋巴细胞的制备 选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。 3 细胞培养 将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。于37℃、含5%的CO 条件下培养3d，加入相应试剂测定 2 4 淋巴细胞增殖率的测定 4.1 Alamarblue试剂测定法 在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。计算公式为： 增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)] /[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100% 4.2 MTT法测定 4.2.1 MTT 溶液的配制方法 称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。在配制和保存的过程中容器最好用铝箔纸包住。在用酶标仪检测结果的时候为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7 范围
#生殖医学# 淋巴细胞培养后主动免疫治疗反复自然流产疗效评价 武美丽 柳肃芬 作者单位:730050 甘肃,甘肃省妇幼保健院生殖免疫诊疗 反复自然流产(recurrent sp i n taneous abo rtion,RSA )是妇科常见病之一,除遗传、内分泌、感染、自身免疫、解剖因素外,80%以上原因不明 [1] ,成为临床难治性不育症。近年来国内外学 者根据Beer 等[2] 在1981年创立的淋巴细胞主动免疫疗法,对原因不明的反复自然流产(unexpla i n ed recurrent spontaneous aborti o n ,URSA )患者大胆采用丈夫和无关个体淋巴细胞进行主动免疫治疗,大大提高了URSA 的临床诊治水平。2006年3月~2007年6月,我们运用配偶淋巴细胞培养后皮内注射法对40例URSA 患者进行治疗,并观察妊娠预后,取得了较好的治疗效果,现报道如下。 对象与方法 11对象:2006年3月至2007年6月,就诊本院生殖免疫诊疗中心门诊的RSA 患者。详细询问病史、经妇科检查、子宫输卵管造影或宫腔镜检查证实无生殖器器质性病变,内分泌化验正常,体温双相,黄体期不少于12d,且较平稳,夫妻染色体核型正常,TORC H 常规检查无异常,排除血型不合,自身免疫无异常(抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体、抗透明带抗体等阴性),配偶精液常规在正常范围者诊断为URSA 。对其符合条件的66例URSA,经征求意见表示愿意参加研究,并签知情同意书,根据患者的自愿分为3组,孕前实行主动免疫治疗(孕前治疗组)20例,确诊妊娠后实行主动免疫治疗(孕后治疗组)20例,对照组26例。对照组采用黄体酮保守治疗。3组年龄(23~35岁,平均年龄29岁)、健康状况、流产次数(既往曾发生自然流产2~10次,平均流产次数314次)及流产时间(流产时孕周为5~12周,平均孕周7周),差异无统计学意义(P >0105)。 21淋巴细胞的培养:全部采用RSA 患者配偶 为供血对象,身体健康,传染病4项正常(甲肝病毒、乙肝病毒、梅毒螺旋体、爱滋病病毒检测阴性)。无菌技术抽取配偶外周抗凝全血30m ,l 常规肝素抗凝,与等量磷酸缓冲液(phosphate ba-l anced so l u ti o n ,PBS)混合,使用Fico ll-H ypaque 法密度离心分离外周血单个核细胞(periphera l b l o od m ononuc lear cel,l PB M C)。用RP M I 1640培养液洗涤离心2次,加入培养液后置于培养瓶中于37e 5%CO 2培养箱内。培养液配制,每1m l 含RP M I 1640为0173m ,l 其中含重组人C -干扰素0105万U /m ,l 植物血凝素(phytohe m agg l u ti n i n ,P HA )0102m g /m ,l 5%小牛血清(012m l)。培养细胞内毒素和细菌培养阴性,酚红染色细胞活率\85%,培养72h 后的细胞再用019%氯化钠溶液洗涤2次,调整至细胞数为20~30@106 /m l 方可用于治疗。 31免疫治疗方法:孕前治疗组20例孕前治疗3次后嘱其妊娠,如3月内未受孕,行输卵管通液,并在排除不育症的情况下重新加强1次主动免疫治疗。妊娠35d 加强免疫1次,此后每3周治疗1次。孕后治疗组20例在确定怀孕后开始主动免疫治疗。2组均每3周给患者双侧前臂皮内多点免疫注射1次,每次每点为013~015m ,l 直至妊娠14周。课题组人员固定,接受本免疫疗法者不接受对该病的其它治疗。对照组26例URSA 患者再次妊娠后仅以黄体酮常规保胎药物治疗到妊娠12周停药。 41疗效判断标准:妊娠达28周以上,或分娩正常新生儿为成功妊娠,再次流产、死胎及新生儿畸形作为妊娠失败。 51统计学处理:采用SPSS 1010软件进行数据 分析,分析方法为V 2 检验,P <0105判定差异有统计学意义。 结果 40例URSA 患者经配偶淋巴细胞免疫治疗后,
行业信息[石油化工] 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 05 25 2005 10:34AM 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 胡显文1** 陈惠鹏1 汤仲明2 马清钧1 (1. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100850) 美国、欧盟和中国的药管部门每年批准的药物中有很大一部分是已上市药物的新适应症，有一部分是不同公司生产的相同产品，许多相同药物重复计算，造成了统计上的很多混淆，使人误认为现在已批准上市的生物技术药物有几百种，而实际上只有不到100种，即人们想象的生物技术药物数量要远高于实际的数量。本文按照以下原则合并归纳生物技术药物，试图全面、准确、科学地统计欧美和中国已批准上市的生物技术药物，以期令人对生物制药有一个详尽准确的了解： （1）本文归纳的生物技术药物是文献定义的狭义生物制药产品，即基因工程产品、抗体工程产品或细胞工程产品，如用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的重组蛋白、用杂交瘤技术生产的治疗性抗体、用细胞培养技术制备的组织工程产品等，但不包括用细胞培养方法生产的减毒或灭毒疫苗。 （2）本文的生物技术药物不包括从血液、尿液或组织中提取的生物活性物质，如人血清白蛋白Albutein 、血源性凝血因子Alphanate (Factor VIII)、AlphaNine（Factor IX）、血源性CMV特异性免疫球蛋白CytoGam、血源性乙肝免疫球蛋白Nabi-HB、AVENTIS公司生产的链激酶Streptase?（非基因重组产物）等生物制品，也不包括FDA定义的New Biotech Drug中可引起细胞凋亡的物质，如三氧化砷注射液（Trisenox）、硝酸镓注射液（Ganite）等无机盐、Fuzeon等化学合成多肽，小分子有机物质Gleevec、Hepsera、Leustatin等。 （3）由于目前全球只有一种反义寡核苷酸药Vitravene，并且它是化学合成药物，不在本文统计范畴。（4）用同一系统表达的蛋白质序列完全一致的产品视为一种产品，如用E coli.表达的有8个品牌的生长激素产品BioTropin、GenoTropin、Humatrope、Norditropin、Nutropin Depot等，用CHO表达的2个品牌的EPO- 产品Epogen、Procrit等，统计时当作一种产品。 （5）用不同细胞或细菌表达的同一产品视为不同产品，如生长激素，有的用E coli.表达如BioTropin，有的用小鼠C127细胞表达如Saizen；又如胰岛素，有的用E coli.表达如Humulin，有的用Yeast表达如Novolin；再如凝血因子VIII，有用CHO表达的ReFacto，有用BHK表达的Helixate。 （6）突变体视为不同产品，如胰岛素突变体Humulog、Lantus、NovoLog等；又如EPO产品Epogen和EPO突变体产品 Aranesp。 （7）剂型的改变、添加其他成分或化学修饰都视为一种产品。如Novo Nordisk公司生产的速效、中效、长效、混合胰岛素系列产品Novolin、Novolin L、Novolin N、Novolin R、Novolin 70/30等，都是剂型的改变以改变胰岛素的生物吸收和药代动力学。又如干扰素a2b 的产品为Intron A，而在Intron A 中加入病毒唑就成为Rebetron，这两种产品都视为干扰素a2b一种生物技术药物；再如许多PEG修饰的药物如PEG-Intron（PEG化干扰素a2b），都与未修饰的产品归为一种产品。 本文所列的生物技术药物，几乎涵盖了所有美国、欧盟和中国的批准上市的生物技术药物，主要资料来源为美国食品药品管理局(FDA，https://www.doczj.com/doc/153984523.html,)、美国制药协会(https://www.doczj.com/doc/153984523.html,)、美国生物技术产业协会(https://www.doczj.com/doc/153984523.html,)、欧盟医药管理局(EMEA, www.emea.eu.int)，以及每个生产厂商的网站及产品说明书，并且参考了文献。 1 美国FDA批准的生物技术药物
（一）项目的意义、必要性和依据 近年来大量的研究证实间充质干细胞（MSCs）是骨髓微环境细胞的起源细胞，是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSCs因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能：在体内/外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞； (2)造血支持和促植入：作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长，与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入；(3)免疫调控：MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制：MSCs作为干细胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。 在造血干细胞移植治疗恶性血液病的应用研究 促进造血干细胞移植的造血重建：近年来有关MSCs体内、外支持造血，抑制免疫功能的报道有很多，提示MSCs可以作为造血干细胞移植的共移植手段以及应用于临床相关疾病的治疗，可提高造血干细胞移植患者的存活率和移植后生存质量，从而大大提高移植治疗的有效性和适应症，具有良好的应用前景。MSCs经静脉回输后广泛分布于骨髓、肝脏、脾、胃肠道、肾脏、肺脏及肌肉等器官组织，对受体BM-MSCs来源的检测结果发现，供体来源的MSCs能够定植于受体骨髓。Maitra等体外扩增人MSCs，与造血干细胞（HSC）共移植给NOD/SCID小鼠，对照研究结果显示，当HSC数量有限时，只有同时给予MSCs输注才能获得更为有效的造血植入。黄绍良等进行了自体和异基因MSCs联合脐血移植的I期临床试验，结果显示异基因MSCs联合UD-UCBT具有明显促进造血恢复的作用。Lazarus等对MSCs 自体输注进行了I期临床试验，从23例造血系统肿瘤包括急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤缓解期患者中分别抽取骨髓10ml-15ml，体外培养扩增MSCs，15例患者经2-3次传代后给与3个
人的外周血淋巴细胞培养 摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析 前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
小鼠淋巴细胞分离方法 一、实验用品的准备： 1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20μl枪头、200μl 枪头、1000μl枪头。摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒； 2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个； 200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个； 5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10 把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）； 注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。 二、相关实验： （一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞 实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。 实验动物：BABALB/c小鼠；雌性 实验材料： 1．小鼠淋巴细胞分离液, 2．60mm玻璃培养皿 3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌 4．气管切开包 5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机 6．1640培养基 实验方法 1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。注意无菌操作。 3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。 4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。 5. 3000转离心15分钟。（病毒室离心机） 6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。 7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。 8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。
几种细胞混合培养特点及应用 高征 摘要：混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。本文介绍了几种常见的细胞混合培养方法及其特点。 关键字：混合细胞；培养；淋巴细胞；兔成骨细胞；兔骨髓基质干细胞；肝癌细胞；大鼠皮层神经元细胞；大鼠胶质细胞；表皮细胞；纤维细胞；U937；鼻咽癌细胞 混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。 1.混合淋巴细胞培养 1.1混合淋巴细胞培养定义 混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture）是指同种异体的淋巴细胞在体外共同培养的现象。若一方(通常为供者)淋巴细胞经灭活处理，则称“单向混合淋巴细胞培养(one-way mixed lymphocyte culture)”。 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC)。若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。 1.2混合淋巴细胞培养用途 混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR) 常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多
第四大组实验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1.了解动物细胞培养的方法。 2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 3.学会对人类染色体的组型分析。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。 核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。 染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。 对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个： 1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。 2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~ 3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体 3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在 37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。 正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22
淋巴细胞分离 淋巴细胞分离与计数 淋巴细胞分离 原理： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 tZz3a1Ui实验材料： 淋巴细胞分离液 肝素 稀释液（生理盐水） RPMI1640粉末 实验设备：1ml移液器、移液管、5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜 操作流程： 1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加 0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝 3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀） 4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2） 5.放入离心机1500r/min离心20min（注:缓慢加速1-4档个3分钟）
6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。 7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。 8.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞 9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度. 10.取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数 ────────── × 10４×2(稀释倍数) 4 11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。 注意事项: 1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞 2. Ficoll应适量，外周血应充分稀释 3.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 4.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 淋巴细胞计数： 实验流程： 1.准备计数板：
混合淋巴细胞培养 混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。 (一) 实验原理 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原(淋巴细胞鉴定的抗原,SD抗原)不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或３H-TdR 掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell,HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D 抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。 (二) 操作步骤 1. 刺激细胞的准备常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴母细胞(如N23细胞株，经过克隆化)、HTC或PBMC。取处于对数生长期的N23细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为1～2×10６／ml，移置塑料培养瓶或50ml离心管中，用６０Co照射3000rad。 2. 反应细胞的准备分离纯化待检个体的PBMC（方法参见"密度梯度离心法分离PBMC"）。 3. MLC按2×10６PBMC: 1×10５照射的N２３细胞／4ml 10％ FCS RPMI1640 比例在培养瓶中进行MLC，培养瓶保持直立，培养4天内不要晃动，第5天加入1ml新鲜培基。如要测定３-TdR掺入率，一般可在MLC的第5天进行；如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞(犆TL)，一般在7～10天左右终止培养，收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见"自然伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的杀伤功能"，所不同的是在96孔培养板中靶细胞数为5×10３／孔。CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N２３细胞。 (三) 试剂器材 1. 细胞刺激细胞N23细胞系，反应细胞：外周血单个核细胞。 2. 10％FCS RPMI1640培养基。 3. 照射源：６０Co、X射线装置。 4. 细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。 5. 孵箱、超净台。 (四) 注意事项 1. 注意无菌操作。 2. 刺激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。 3. 可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。
B淋巴细胞分离技术 一、实验原理 膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B细胞特有的表面标志，它既是B细胞识别抗原的受体，与相应抗原特异性结合；又是表面抗原，能与相应的抗Ig的抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig抗体作免疫荧光镜检，以查出B淋巴细胞。由于B淋巴细胞在分化过程中最先出现SmIg，所以该法可以检出全部B淋巴细胞。B淋巴细胞表面最先出现IgM，以后相继出现IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能与许多哺乳动物IgG 的Fc段发生结合，并且这种反应也发生于膜表面的IgG，所以亦可以用荧光标记的SPA菌体(FITCSPA)替代FITC抗IgG检测SmIg阳性B淋巴细胞，凡于FITCSPA结合的细胞，在荧光显微镜下，可见到B淋巴细胞表面或周围布满许多呈黄绿色荧光的菌体，即为SmIg 阳性细胞即为B淋巴细胞。现将荧光标记SPA法介绍如下： 二、实验材料 1 冻干荧光金黄色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌体试剂，用时按要求稀释。 2 pH值72 Hank s液，含5%小牛血清。 3 淋巴细胞分层液，20℃时比重为1077±0002 4吸管、移液管、台式离心机、载玻片、盖玻片 三、实验步骤 1、取肝素抗凝血2ml，用Hank s液稀释1～2倍，轻轻加入到装有3ml淋巴细胞分层液的试管中，2000～2500 r/min水平离心20～25min，获取淋巴细胞。 2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最终配成细胞数为2～25×106/ml的淋巴细胞悬液。用pH值72Hanks液稀释FITCSPA菌体试剂，然后将淋巴细胞液与等量的FITCSPA菌体悬液混合，充分混匀后，放4℃冰箱30min。
收稿日期：2009-05-22 作者简介：韩铮(1982-)，硕士，E-mail:allenhz520@https://www.doczj.com/doc/153984523.html, 脂肪来源干细胞免疫原性和免疫调节作用的实验研究 韩铮，姜平，高建华，鲁峰，付冰川，陈晓炜（南方医科大学南方医院整形外科，广东广州510515） 摘要：目的探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)在体外的免疫原性，以及ADSCs 在家兔同种异体皮片移植中的免疫调节作用。方法将家兔淋巴细胞分别与自体和异体ADSCs 混合培养48h 后加入CCK-8试剂，并用酶标仪检测OD 值；在家兔同种异体移植皮片下注射自体ADSCs ，观察移植皮片的坏死时间，并于术后第7日切取移植皮片的周边组织进行组织学观察。结果家兔淋巴细胞与自体、异体ADSCs 混合培养后用酶标仪检测OD 值分别为（1.527±0.402）和（1.615±0.351），两组OD 值差异无统计学意义；家兔同种异体移植皮片下注射ADSCs 的移植皮片的坏死时间为（7.170±1.472）d ，未注射ADSCs 的对照组移植皮片的坏死时间为（5.830±1.169）d ，两组皮片坏死时间差异具有统计学意义；术后第7日组织学观察见实验组皮下浸润的炎症细胞较少，皮下组织结构完整、清晰；对照组皮下浸润的炎症细胞较多。结论脂肪来源干细胞在体外的免疫原性低，对家兔同种异体皮片移植有免疫调节作用。关键词：脂肪来源干细胞；免疫原性；免疫调节；组织工程中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2009)10-2144-03 脂肪来源干细胞(ADSCs)是成体干细胞的一种，自Zuk 等［1］报道以来，以其来源广泛、取材简便的特点和可多向分化的潜能，成为干细胞及组织工程研究领域的热点［2］。近年来有关ADSCs 的研究主要集中于其多向分化潜能［3-6］，而对其免疫学特性仍未展开较深入的研究。本实验以家兔作为动物模型，对家兔 ADSCs 的体外免疫原性及体内的免疫调节作用开展 初步探讨，试为扩充组织工程种子细胞的来源及拓展ADSCs 的应用领域提供实验基础。1材料和方法 1.1实验动物与试剂 健康新西兰大白兔10只，雌雄兼有，体质量 2.0~2.5kg ，由南方医科大学SPF 级动物实验中心提供并饲养。DMEM 高糖培养基，RPMI 1640培养基， 胰酶，FBS （Hyclone ），Ⅰ型胶原酶，CCK-8试剂盒， Percoll 淋巴细胞分离液，PHA （植物凝集素）。1.2方法 1.2.1家兔ADSCs 的分离及体外培养取家兔腹股 沟皮下脂肪5ml ，PBS 缓冲液反复冲洗后剪成约1 mm 3大小的脂肪颗粒，0.1%胶原酶在37℃条件下消化30min 左右。使用等量完全培养基（含10%FBS 的DMEM 高糖培养基）中和，离心（1200r/min ）5min 后 去除上清，沉淀混悬后尼龙网过滤并接种于细胞培养瓶中，于37℃、5%CO 2孵箱培养。于24h 后更换培养液，此后每3d 换液1次。观察细胞生长情况，待 6~7d 细胞生长融合达80%~90%后，0.1%胰酶消化后按1∶3进行传代培养。1.2.2体外实验 1.2.2.1家兔淋巴细胞的刺激增殖实验取家兔耳缘静脉血5ml ，用Percoll 淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血淋巴细胞，计数后与PHA 混 合培养于96孔培养板，具体实验分组如下，实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和PHA （100μg/ml ，20μl/孔）混合培养；对照组：单独家兔淋巴细胞培养组（1× 104/孔）。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续混合培养4h 后用酶 标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.2.2家兔ADSCs 体外免疫原性检测实验通过前 述方法分离出家兔淋巴细胞，将其分别与自体 ADSCs 和同种异体ADSCs 混合培养于96孔培养 板，具体实验分组如下，对照组：家兔淋巴细胞（1× 104/孔）和自体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养；实验组：家兔淋巴细胞（1×104/孔）和同种异体家兔的ADSCs （3×103/孔）混合培养。实验组与对照组各培养孔均培养48h 后加入CCK-8试剂（10μl/孔），继续 混合培养4h 后用酶标仪检测培养板上各孔的OD 值。 1.2.3体内实验家兔10只，随机分成5组（记为A 、B 、C 、D 、E 组），每组2只互为同种异体皮片移植对象。在每只家兔的两侧臀部设计直径为3cm 的圆形 皮片，切取后组内、同侧之间交互移植。实验组（左侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射含自体ADSCs （1×106/kg ）的完全培养基2ml ；对照组（右侧臀部）：皮片移植的同时在皮片下注射不含自体ADSCs 的完全培养基2ml 。术后每天观察各组家兔臀部移植皮片的存活情况并记录移植皮片的坏死时间（移植皮片红润，质地柔软，视为皮片存活良好；若皮片变为暗褐色且质地坚硬的面积>2/3，视为皮片坏死），于术后第7日将C 组和E 组两组家兔的实验组及对照组移 南方医科大学学报(J South Med Univ)2009;29(10) 2144··
MD PACIFIC 淋巴细胞分离液说明书 主要用途： 淋巴细胞分离试剂是一种旨在通过葡聚糖和泛影酸钠混合液，达到特定比重，然后离心分层以获得纯化完整的单核细胞/淋巴细胞的权威而经典的技术方法。可以被用于动物（大鼠、小鼠等）单核细胞/淋巴细胞的分离、鉴定、染色、标记、培养、 DNA萃取、线粒体分离、细胞因子测定和细胞流式仪分析等研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，分离出色，性能 稳定，细胞活性保证。 技术背景： 全血溶液含有血清、各种蛋白因子、无核血红细胞、血小板、多核白细胞和单核白细胞等。为了获得纯化完整的单核白细胞 /淋巴细胞，采用Boyum（1968）的离心技术，可以方便快速地从全血和骨髓中分离。 产品内容： 淋巴细胞分离液（200）毫升 产品说明书1份 产品特点： -密度变化率依照 Ficoll400泛影酸和氢氧化钠。-最佳分离溶液的密度为参照具体产品的标签-生理学参数-在 低粘度时高密度-无菌-即用型-溶液产品规格
检测标准： 热源检测结果：＜0.5EU∕ml 无菌检测结果：已检测 应用 人外周血中分离出淋巴细胞的最佳试剂。这种分离液同样可被用作从其它途径分离人的淋巴细胞，包括骨髓血细胞、脐带血 细胞及组织匀浆。 实验步骤 实验开始前，室温预热淋巴细胞分离液。然后进行下列操作。（注：上述方法适用于从外周血中分离淋巴细胞。如从骨髓、脐带及组织匀浆中分离，需要先去除红细胞后再进行上述步骤分离淋巴细胞。 1．准备无菌的锥形离心管 2．加入淋巴细胞分离液 3. 用hank’s 液或用户自备的PBS缓冲液1：1比例（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。 3．小心沿着管壁，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴分离液上面。 （注意：切记不要搅浑淋巴细胞分离液） 4．小心放进台式离心机离心30分钟，速度为400g 5．小心取出离心管，切记不要震动 6．可见，最上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的致密白色环
MLR混合淋巴细胞反应 混合淋巴细胞培养（MLC）或称混合淋巴细胞反应（MLR）常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原（HLA抗原）相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。 一、实验原理 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原（淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养（two way MLC）；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C（mytomycine C）处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养（one way MLC）。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞（Homozygous typing cell，HTC）作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。 二、实验方法 这里介绍多年前做过的MLR的方法，绝对正宗，传统的标准方法： 1、方法 分别取C57BL（H-2b）和Balb/C（H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液，Balb/C小鼠脾细胞悬液（2X107/ml）加丝裂霉素C（50微克/ml）处理，37oC，30min，培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液（5X106/ml），作为刺激细胞，加入96孔培养板，5X105/0.1ml/孔；再加入C57BL脾细胞悬液，为反应细胞，也是5X105/0.1ml/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为三复孔。CO2孵葙培养5天，加3H-TdR 0.5 微居/孔，再培养12~16h
离心分离技术与淋巴细胞分离及鉴定 【实验目的】 1.了解离心分离技术的原理与分类。 2.掌握应用密度梯度离心法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的方法。 【实验原理】 1.利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分。因此 用比重与被分离细胞比重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集到所需要的单个核细胞。 2.用过氧化物酶标记的抗IgM，在一定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与 B细胞表面的IgM结合，通过DAB显色，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染色。 【实验步骤】 一.细胞分离 1.将小鼠用颈椎脱臼法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。 2.将脾脏置于培养皿内100目筛网上，加入8ml的生理盐水，用磨棒磨碎脾脏后过滤，即 获得脾细胞混合悬液。 3.1500rpm,5min,离心细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积至4ml,重悬细胞。 4.取盛有3ml细胞离心液（比重1.088）的试管一支，用移液器加入细胞混合液4ml。 5.将试管离心1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。 6.离心后取出试管，观察细胞分层，底层为红色的红细胞，依次向上为细胞分离液和生理 盐水，在此之间可见一层淡淡地白色细胞层。 7.用尖吸管小心取出中层间的细胞到另一洁净离心管，并加2ml PBS洗涤一次，1500rpm 离心5min后去上清。 8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片上，自然干燥后， 可进行细胞类型鉴定。 二.细胞鉴定 1.分离出单个核细胞并取出10μl滴于黏附剂处理的载玻片左右各一滴涂片，自然干片 2.在室温条件下，用甲醇固定细胞，自然干燥后用蜡笔标出细胞范围，蒸馏水洗三次。 3.配制封闭液。室温浸泡30分钟，PBS洗3次。 4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgM抗体于左侧涂片，滴加适量 的封闭液于右侧涂片（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。 5.滴加DAB显色液，37 ℃显色30分钟，蒸馏水洗3次，干片后，显微镜下观察。 【注意事项】 1.向分离液管加脾细胞混合悬液时应沿试管壁缓缓加入，使脾细胞混合悬液与分离液形成 明显的界面，小心放取试管，保持界面完整，避免打乱界面，影响分离效果。 2.在滴DAB显色液前要彻底去除游离的抗体，以免假阳性结果。 3.DAB潜在致突变作用，请注意适当防护,请穿实验服并戴一次性手套操作。 【实验结果】 如下图：
高中生物人教版选修3综合训练 陕西省柞水中学翁泽锋 专题一、基因工程 1.(15分)天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转人酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题： （1）将淀粉酶基因切割下来所用的工具是，用将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子，以完成工程菌的构建。 （2）若要鉴定淀粉酶基因是否插人酿酒酵母菌，可采用的检测方法是；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用检测。将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈，请解释该现象发生的原因。 （3）如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小? （4）微生物在基因工程领域中有哪些重要作用? 2.（15分）下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①～⑦表示基因的不同功能区。 据图回答： ⑴上述分子杂交的原理是；细胞中β-珠蛋白基因编码区不能翻译的序列是（填写图中序号）。 ⑵细胞中β-珠蛋白基因开始转录时，能识别和结合①中调控序列的酶是。 ⑶若一个卵原细胞的一条染色体上，β-珠蛋白基因编码区中一个A替换成T，则由该卵原细胞产生的卵细胞携带该突变基因的概率是。 ⑷上述突变基因的两个携带者婚配，其后代中含该突变基因的概率是。 3.【生物－现代生物技术专题】 为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处， DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”） （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成 植株需要利用技术。该技 术的核心是 和。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育 成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。 4.将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。