间充质干细胞培养方法
1. 间充质干细胞MSC基本形态
2. 干细胞应用与干细胞调控。
3. 间充质干细胞MSC生长过程
4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境
5. 细胞培养板的选择
6. 如何选用细胞培养基
7. 如何维持培养液p H
8. 血清与干细胞的培养
9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活
10. 细胞的细菌、真菌污染及排除
11. 细胞培养污染的预防
12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么
13. 胶原酶的种类和选型
14. 胶原酶V S胰酶
15. 干细胞的种类和表面标记
16. 间质干细胞培养原理概述
17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化
18. 干细胞老化的表现和处理
19. 细胞传代消化过程指导
20. 冷冻保护剂作用和选择
21. 细胞冻存指导
22. 干细胞冷冻和复苏
23. 移植细胞的基因修饰
1．间充质干细胞MSC基本形态
体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。
2．干细胞应用与干细胞调控
干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。
2.1内源性调控
干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。
（1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控
干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
（2）转录因子的调控
在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。
2.2外源性调控
除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。
（1）分泌因子
间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止
β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。
（2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用
有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch 信号都起着非常重要的作用。当Notch 与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；当Notch 活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。
（3）整合素（Integrin）与细胞外基质
整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。比如当β1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。此外细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。
2.3干细胞的可塑性
越来越多的证据表明，当成体干细胞被移植入受体中，它们表现出很强的可塑性。通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。1999 年Goodell 等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5 天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation ）。关于横向分化的调控机制目前还不清楚。大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。
3．间充质干细胞MSC生长过程
潜伏期→指数增生期→停滞期
（1）潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形，然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束。细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基
成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需
6-24 小时。
（2）指数增生期(logarithmic growth phase)
这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI ）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5% ，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。
（3）停滞期(Stagnate phase) 细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateau phase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH 下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡，因此，应及时传代。
4．间充质干细胞MSC培养的合适气体环境
干细胞相关的培养液都必须在5％CO2 的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。
5．细胞培养板的选择
细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底（U 型和V 型）；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki 板和普通细胞培养板。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。
（1）平底和圆底（U 型和V 型）培养板的区别和选择
不同形状的培养板有不同用途。培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTT 等实验时，无论是贴壁和悬浮细胞，一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特別注意材质，标示“Tissue Culture (TC) Treated”是养细胞用的。U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养時，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U 型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内內。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U 型板替代
（加入细胞后，低速离心)。
（2）Terasaki 板和普通细胞培养板的区别
Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting 和handing drop 两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface
（3）细胞培养板与酶标板的区别
酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，需要更高的要求和特定的酶标工作液。
（4 ）常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量
不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm 范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量（参考下表）。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。
常用的培养器皿
培养器皿底面积（cm2）加培养液量（mL）可获细胞量
96 孔培养板0.32 0.1 105
24 孔培养板2 1.0 5×105
12 孔培养板4.5 2.0 106
6 孔培养板9.6 2.5 2.5×106
4 孔培养板28 5.0 7×106
3.5cm 培养皿8 3.0 2.0×106
6cm 培养皿21 5.0 5.2×106
9cm 培养皿49 10.0 12.2×106
10cm 培养皿55 10.0 13.7×106
25cm 塑料培养瓶25 5.0 5.2×106
75cm 塑料培养瓶75 15~30 2×107
25cm 玻璃培养瓶19 4.0 3×106
100cm 玻璃培养瓶37.5 10.0 6×106
250cm 玻璃培养瓶78 15.0 2×107
2500cm 旋转培养瓶700 100~250 2.5×108
注：各种单层生长的细胞在培养皿中长满的细胞数，主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。上表以293 细胞为例给出的可获细胞量仅作参考。
6．如何选用细胞培养基
培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养时最重要的条件。细胞培养基大致有：
（1）合成培养基
主要成分为：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。常用的有：
①199细胞培养基及其改良品种。1950年由Morgan 等设计，除BSS 外，含有53 种成分，添加
适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。199 （HB）细胞培养基，主要应用于Vero 细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗，具有高缓冲性能，能够有效提高病毒滴度。
②BME细胞培养基。基础Eagle 培养基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 设计，BSS＋
12 种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM 等。
③MEM细胞培养基。低限量Eagle 培养基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，适合多种细胞单层生长，是一种最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。需要注意的是，MEM 细胞培养基有含Earle's 平衡盐的类型，也有含Hanks'平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有含非必需氨基酸的类型。生产和科研时，应根据实际情况注意选择合适的MEM 细胞培养基。另外，因MEM 培养基营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。
④DMEM细胞培养基及其改良品种。DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA 转染的转化细胞培养。例如CHO 细胞表达生产乙肝疫苗、CHO 细胞表达EPO。
⑤IMDM 细胞培养基。IMDM 是由Iscove's 改良的Eagle 培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。
⑥RPMI-1640 细胞培养基。Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11 种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。
⑦Fischer’s细胞培养基。用于白血病微粒细胞培养。
⑧HamF10、F12 细胞培养基。1963 年、1969 年由Ham 设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12 适用于CHO 细胞。
⑨DMEM/F12细胞培养基。DMEM 和F12 细胞培养基按照1:1 比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。
（2）低血清细胞培养基
主要应用于VERO 细胞、BHK21 细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。
（3）无血清培养基
是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。
（4）替代天然培养基
培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。面对如此多的细胞培养基，对细胞培养基的选用，建议：
①可以查阅相关文献，或在购买细胞株时咨询选用最适合细胞株的培养基，或购买相配套的细胞培养基产品。
②许多培养基都适合多种细胞株的培养，可以采用现有的培养基进行试验。
③根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。
④结合细胞特性及培养基的培养效能，用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、克隆形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基。
注：目前也有不少商业化的msc培养基，如百恩维的间充质干细胞无血清培养基，间充质干细胞培养基（低血清）
7．如何维持培养液p H
配好的培养液变碱（变紫红）是正常的现象。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，培养液中的HCO3 -被渐渐耗掉，培养液的pH值也逐渐升高，变成了紫红色。如果培养基pH值偏碱的程度不大，可将装培养液的瓶口拧松，放置于二氧化碳培养箱中一段时间，让培养箱中的CO2进入培养液，pH值就可以纠正。如果pH值偏离的程度很大，可以通过添加少量无菌的H Cl 或者NaOH调节pH，便可以使用。将配制好的培养基小剂量分装，可以避免反复开盖引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同时因NaHCO3遇热不稳定，会分解释放出CO2 ，而使培养基的pH升高，偏碱。因此在配置使用培养的过程中应注意：
（1）动作迅速，不可使培养液长时间处于较高室温下；
（2）配置过程中，混匀时切不可加热。混匀后应立即放入4°C 冰箱，待过滤时再取出；
（3）使用完毕应尽快将瓶口封好，放于4°C 冰箱保存。
通过在培养液中同时添加Hepes 也可以有效的稳定pH 值。Hepes （羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液,它在pH 7.2～7.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH 值。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。该缓冲液使用的终浓度为10～50mmol/L，一般培养液内含20mmol/L Hepes 便可达到缓冲能力。Hepes 的使用方法有以下两种：
（1）Hepes 可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中，再过滤除菌。每1000ml 培养液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 调pH 至7.2，过滤除菌后使用。此时HEPES 的使用浓度为10 mmol/L。
（2）配成100x 贮存液（1 mol/L），使用前取99mL 培养液加入lmL 贮存液，最终应用浓度仍为10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 贮存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 双蒸水中，用1N NaOH 调pH 至7.5～8.0，然后用水定容至100mL，过滤除菌，分装小瓶（2mL/瓶），4℃或-20℃保存。
8．血清与干细胞的培养
干细胞在体内存在的量很少，处在一个个环境相对稳定的“niche”中，所以一旦完成分离进入体外环境，最重要的就是保证细胞的活力不受影响，那么就必须提供一个相对稳定的培养环境。这些环境就是靠培养基和培养箱来提供了。培养液中最重要的莫过----血清，特别是对干细胞来说。所以为了最优的干细胞培养效果，推荐选用对应的干细胞专用血清。牛血清是最常用的，但是根据血清的来源不同又可以分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24 小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30 天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少，所以也成为了干细胞培养的首选。培养中如何正确的使用血清？避免不好的影响呢？
血清的浓度：对大部分的干细胞，最佳的血清浓度是10%。过高的血清浓度会导致细胞出现分化的现象，如果是需要高浓度的血清，培养的时间也不能超过两周，否则会导致细胞分化能力下降。过低的血清会导致细胞的增殖速度下降。血清的溶解：必须在4℃进行，最好过夜溶解。这样可以减少沉淀的产生，避免营养物质的流式。同时也要避免血清的过滤，如果需要过滤可以和培养基一起过滤。细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清
的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。
血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。注意以下几点：（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃或-80℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
（2）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20 ℃或-80 ℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20 ℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。影响使用效果！
（3）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement ）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。
（4 ）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破坏而影响血清质量。
（5）血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。
9．胎牛血清（F B S ）是否需要灭活
灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒害作用。胎牛血清（FBS）对许多细胞系均有促生长作用，主要适用于细胞株的保藏及特殊用途的细胞株的体外培养。胎牛血清是取自剖腹产的胎牛。因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞生长有害的成分最少，质量是最高的。所以不必要灭活。
10．细胞的细菌、真菌污染及排除
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml 细胞悬液以100rpm 离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h 可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜
11．细胞培养污染的预防
溶液处理（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5～10 倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液，有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。
常用抗生素用量和效应
抗生素抗菌谱浓度（量/mL）
细菌真菌支原体
青霉素G+ 100～1000μg
链霉素G- 100～1000μg
庆大霉素G+ /G- + 50～200μg
四环素G+ /G- + 10～50μg
卡那霉素G+ /G- + 100～1000μg
两性霉素+ 常用2μg/mL
制霉菌素+ 常用25μg/mL
+表示效应程度
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素 B 和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
（2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B 推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。（3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3 代。（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
（6）重复步骤4 。
（7）在无抗生素的培养基中培养4～6 代，确定污染是否以已被消除。
12．使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么
体外培养的细胞受到严重污染时，有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此，防止污染，预防是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的始终，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：
（1）添加抗生素各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好（但迄今尚无对抗支原体特效抗生素）。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有
一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。（2）从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%
的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml 的饱和硫酸铜加3L 灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。
（3）从操作者做起
①进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
②操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。
③使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。
④操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。
⑤吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。
⑥操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。
（4）防止细胞交叉污染所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。
（5）无菌室的彻底消毒
①新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。
②甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。
13．胶原酶的种类和选型
在细胞的取材中，各种消化酶经常用于组织的分散，在组织中取得目的细胞。例如脂肪间质干细胞（ADSCs ）、软骨细胞培养等。其中胶原酶是最常用的一种。
种类：I-IV 型选择：结缔组织I，III 型；骨组织、脂肪组织I 型；软骨组织II 型；胰岛细胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增强胶原酶的消化能力，对细胞损伤最小。
14．胶原酶V S胰酶
胰蛋白酶（Trypsin ），简称胰酶，可使细胞间的蛋白质水解从而达到细胞离散的目的，是目前应用最为广泛的消化剂，主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶适用于细胞间质较少的软组织（如胚胎、上皮、羊膜、肝、肾等软组织）及传代细胞的消化，但对于纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常见有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。组织培养用胰酶溶液一般配制成0.1~0.25%浓度，常用0.25%，特别敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、温度、胰酶的浓度、组织块的大小和硬度有关。胰酶作用及溶解的最佳pH 是8~9，配制胰酶溶液可将液体调至pH8 左右，充分溶解，过滤除菌，过滤后再调至pH7.4 左右。胰酶作用的最适温度为37℃，在夏季室温25℃以上对一般传代细胞也能达到消化效果。一般新鲜配制的胰酶消化能力较强。消化时间要根据不同的情况而定，胰酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说，温度低，组织
块大、胰酶浓度低者，消化时间长，反之则相应减少时间。酶的浓度过大或消化时间太长，会导致消化过度，对细胞的活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，被消化掉；消化时间太短，消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性，也达不到分散细胞的目的。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶进行消化时，可改变不同参数以确定出最佳消化效果。
胰酶的配置方法：
（1）称取胰酶：按胰酶液浓度为0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入PBS 或D-hanks 中，低速搅拌3~4小时或者置于4℃过夜混匀（低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫严重，有可能导致酶的变性）。
（0）调节pH 值为7.4 左右。用注射滤器过滤除菌，因蛋白制剂不宜4℃长期保存，忌反复冻融，建议分装成小瓶（离心管）于-20℃冻存或置4℃保存备用。
注意事项：
①是否需要4℃放置过夜，取决于胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要4℃过夜。而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要4℃过夜。从理论上来说，4℃放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以除去细菌，但除不掉其代谢产物。
②如果胰酶不溶、有絮状物，考虑可能的原因有：胰酶过期或是已经部分变性；溶液pH 值不对；在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可。
③Ca2+、Mg2+、血清和蛋白质对胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、这些离子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 来配制。正是这个道理，开始消化前，需用PBS 将培养液冲洗干净后方加入胰酶进行消化，否则会大大影响胰酶的作用效果。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
④对于一些贴壁特别牢固的细胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，将胰酶与EDTA （乙二胺四乙酸）混合来进行消化。EDTA 可通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞连接从而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS 彻底冲洗培养瓶（板），使得更好的再次利用培养瓶（板），否则再培养时可能会导致细胞容易脱壁。EDTA在常温下难溶于酸，微溶于水（20℃时溶解度只有0.02g ），但在碱性溶液中溶解性较大。因此为了更快的溶解EDTA 可采取调节PH或者是加热的办法。但须注意：由于胰酶不耐高温，因此待EDTA 溶解后，温度有所下降才能加入胰酶。如果是单独配置EDTA 溶液，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。
胶原酶（collagenase ）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度
200U/ml （约为1mg/mL ）或0.03%~0.3%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。具体可见胶原酶的种类和选型。胶原酶消化缓和、无须机械振荡，因而可进一步提高细胞成活率，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的配置胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。关于胰蛋白酶配置方法可见：胰蛋白酶消化法。
注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培养液配制。
胶原酶的使用：
（1）将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块
（2）将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50 倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。（3）将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min 振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。
（4）收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100 目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者无血清培养液离心漂洗1~2 次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。
胶原酶Vs 胰蛋白酶胰蛋白酶和胶原酶消化时间与浓度上的差异，依消化温度而异。另外这两种酶也可混合应用，浓度为：胰蛋白酶0.1mg+胶原酶0.25mg/mL。两酶相比的差别见表1 和表2。
表1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
项目胰蛋白酶胶原酶
消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织
用量0.01%~0.5% 0.1~0.3 mg/mL（200 U/mL）
消化时间0.5 ~ 2h 1 ~ 12h
pH 8~9 6.5~7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清抑活有无
Ca2+和Mg2+ 有影响无影响
表2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块（0.5~1cm3 ）时所需时间（h）
酶种类和用量较硬组织软组织
4℃室温37℃ 4℃室温37℃
胰蛋白酶（0.25%）24~48 1~6 1~2 12~24 1~2 0.5~1
胶原酶（1200 U/mL）24 6 0.5 12 3 0.25
胰蛋白酶（0.25%）+胶原酶（200 U/mL）12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2
15．干细胞的种类和表面标记
通过流式细胞仪分析，间充质干细胞特异性表面抗原有：SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干细胞，骨髓中绝大多数是HSC，BMSC 只占骨髓有核细胞的0.001%～0.01% 。因此鉴定BMSC 的方法是在骨髓的干细胞中排除HSC——BMSC：CD45-、CD34-、CD29+、CD14+/ HSC：CD34+。
16．间质干细胞培养原理概述
间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，在适宜的培养条件下可分化成多种组织细胞，包括成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。
间质干细胞最早是从骨髓中分离得到的，正常情况下，它在骨髓中的比例非常低，仅占单核细胞的
1/105 ~1/104 。骨髓中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，
红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090 g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/ml，血小板为1.030~1.035 g/ml。为此利用一种密度介于1.075~1.092 g/ml之间而近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。
在骨髓的原代培养物中，除了贴壁生长的成纤维细胞样的间质干细胞外，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的间质干细胞，必须除去其他细胞。根据其他细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去。对于贴壁的单核巨噬细胞，可根据其黏附能力的不同，通过调整Trypsin/EDTA 的消化时间，保证间质干细胞在短暂的作用时间内与塑料培养瓶壁分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养瓶壁，从而使间质干细胞与其他的贴壁细胞得到分离。
在传代培养中，接种密度是影响体外培养间质干细胞增殖潜能的重要因素。低密度接种时，间质干细胞的增殖能力明显提高，而诱导细胞分化时则需要较高的细胞密度，这可能与分化时细胞与细胞间的相互作用有关。而在培养过程中，若细胞过度融合会促进其分化趋向，故要保持干细胞未分化状态，要及时传代。
17．间质干细胞成脂和成骨诱导分化
成骨和成脂诱导是鉴定干细胞的一种重要的方法，也是最常用、报道见得最多的方法。成骨最常用的染色方法是茜素红染色（碱性磷酸酶），成脂诱导最常用是Oil Red O （油红O）染色法。下面我介绍一下这两种染色方法的原理和步骤。茜素红染色方法和原理：成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，这就是我们常说的“钙结节”。鉴定钙结节的染色方法常用“茜素红”。
步骤：
（1）吸去诱导液，再PBS 洗一到两次；
（2）加入10％中性甲醛，固定30min-60min；
（3）吸去固定液，加入0.1%的茜素红染色液，染色6-10min；
（4）用PBS 洗两次，去处残留的染色液；
（5）加入PBS，完成染色；
茜素红：茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。橙黄色或黄棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 为2.15，其水溶液呈浅黄褐色，加盐酸后变成黄色，加氢氧化钠后则变成蓝紫色。有刺激性。能与许多金属离子生成带色化合物，能与锆、钍、铝、钛及铍和钙的显色反应。染色的原理就是茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。
Oil Red O（油红O）染色的方法和原理：成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。Oil Red O染色的方法是对油滴的染色的一种方法。
步骤：
（1）吸去诱导液，再PBS 洗一到两次；
（2）加入10％中性甲醛，固定60min；
（3）吸去固定液，加入现配和过滤后的Oil Red O 染色液，染色60min；
（4）用PBS 洗2-5 次，去处残留的染色液和残渣；
（5）加入PBS，完成染色；
Oil Red O（油红O）：1-［2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯偶氮)苯偶氮］-2 萘酚，苏丹红5B，溶剂红27。红色粉末。是一种油溶性偶氮染料。易溶于苯，溶于乙醇(呈浅黄色红色)和丙酮。生物染色剂,
淀粉凝胶电泳中作类脂和脂肪染色。显微技术中用作脂肪染色剂。作为脂肪细胞的染色剂的原理是使
用Oil Red O 的油溶性，对其它的细胞结构着色性差。
18．干细胞老化的表现和处理
干细胞在培养过程中如果环境不适合其生长就会出现部分细胞的老化现象。这是干细胞培养的一个难点也是经常出现的问题。干细胞老化表现：细胞胞浆内特别是在核区附近出现黑色颗粒，表示细胞开始出现老化；细胞胞浆内出现空泡，则表明该细胞已老化或者已经开始分化（在全部细胞中出现少数老化细胞是正常的）；细胞立体感逐渐消失，细胞间的间隔不清，部分细胞扁平状，细胞的形状趋向多样；贴壁性减退，出现一些漂浮的细胞；部分分泌强的细胞分泌物增多，细胞表面会比较脏；细胞增殖速度明显下降，分裂相的细胞明显减少。
干细胞老化的原因和预防：接种密度的影响：部分干细胞具有一定的分泌性能，能够分泌一些对细胞有支持能力的因子类物质；所以必须维持一定的接种密度，否则会导致细胞增殖减慢，最后出现老化；消化过度：消化细胞时会对细胞的表面蛋白有较强的损伤，所以消化的时间不能过长，使用合适浓度和pH 值的消化酶，否则会导致细胞老化和分化；
合适的密度的时候就要传代：细胞如果过密，接触抑制作用会导致细胞的活力减弱并影响增殖导致老化；
使用合适的血清和培养基：不同的干细胞对培养基特别是血清的要求不同，所以使用不同的培养用的血清进行筛选，寻找最适合该干细胞培养的血清是预防细胞老化，维持细胞正常生长的重要保证。
19．细胞传代消化过程指导
干细胞的培养中，消化传代对细胞的影响最大，所以合适的消化操作会大大减小胰酶对干细胞的伤害。应该仔细摸索后确定目的细胞最佳的消化时间。确保大部分细胞都能消化下来，而消化时间最少。
注意要点：
（1）切忌过度消化（包括胰酶浓度过高、消化时间过长），会导致细胞死亡、分化、状态变差，分化能力丢失。所以不熟练的操作者，宁可消化不彻底，也不能消化过度；要确保细胞不消化过度，最好在显微镜下观察消化的过程。
（2）在加入完全培养液终止胰酶作用前，可以在细胞培养瓶的左右两侧和底部轻轻拍打，使细胞脱壁悬浮。加入完全培养基后，再用吸管轻轻吹洗几次培养瓶的底面；
（3）细胞的差异：不同种类的干细胞的差异很大，特别与肿瘤细胞株的差异更大，很多经验不可以直接使用，要仔细摸索最佳的时间；
（4）接种的密度不能过低，否则会导致细胞增殖缓慢，甚至导致细胞老化，
20．冷冻保护剂作用和选择
冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～600℃/min 的冷冻速率降温冷冻，98% 以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98% 以上的细胞都可存活。
冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO
的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4℃下进行，一般需要40～60分钟。
非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。
21．细胞冻存
21.1细胞悬液的制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
(2)将细胞悬液以800～1000r/min 离心5min，去上清液；
(3)向细胞沉淀物中加入细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml ；
(4)按每管0.5-1ml 的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(5)在冻存管上做好标记，包括细胞名称、代次及冻存日期等内容。
21.2冻存
为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。标准的降温速度是1-2℃/min ，当温度到达-25℃，降温速度可加快至5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。
分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约30min；
(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～-20℃），约1-2 小时；
(3)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；
(4)最后将冻存管投入液氮中保存。
降温过程也可使用专为细胞冻存设计的程序冷冻仪，我们采用的是将冻存管放入冻存盒里，再放入
-80℃过夜，由于聚氯乙烯导热比较慢，所以温度可慢慢降下来，次日可直接放入液氮罐。这样可以保证细胞的活力不受到温度变化速率的影响。
21.3注意：在使用DMSO前，不用进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。也不能使用普通的砜类材料的过滤膜来进行过滤。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。冻存液最好现用现配。在将细胞冻存管投入液氮时，操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出，对皮肤造成冻伤。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，可复苏1～2 管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。
22．干细胞冷冻和复苏
冷冻速率：冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至
-5～-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。Luyet （1973）证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。
不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.6℃/min、7℃/min 和200℃/min 。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.6℃～300℃/min ，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
复苏速率：冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1-2 分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。
所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。
水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2 分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。
冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复苏温度变化速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
细胞复苏步骤和注意要点：
（1）准备37°C水浴和预热到37°C 的完全培养液；准备好一个15ml 的离心管，同时加入9ml 的完全培养液；
（2）准备好这些后，将细胞从液氮中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在3min 内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中（可能由水引起污染）。注意要点：溶解的时间过长会影响细胞的活力，导致死细胞多，细胞状态差；如果从液氮中取出，管内有少量液氮要先-80℃放置10-30 分钟，使液氮完全挥发再复苏，避免危险。
（3）溶解完全的细胞要快速转移到无菌超净台中，用75％酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15ml 的含有培养液的离心管中，同时用培养液洗2 次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫。注意要点：细胞吸出后，用培养液再洗 2 次冻存管，把细胞全部转移，否则会损失细胞。吹匀时如果很多泡沫会影响细胞活力，导致复苏后死细胞偏多。
（4）250 g 离心 5 minutes；弃上清液，加入2-3ml 预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。注意要点：离心的作用是去除细胞冻存液中DMSO 对细胞的影响，否则会导致干细胞分化。重悬务必保证所有的细胞均匀分开，否则会导致细胞成团或者细胞还在贴在底部，损失细胞。去除上清时，要小心（特别是使用5-10ml 移液管）避免将细胞吸走，导致细胞数损失，操作熟练的人员，可以直接倒去上清。
（5）将重悬的细胞接种到T25 或者是T75 的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，放入37°C 、5% CO2 培养箱中。注意要点：接种到T25 可以比较安全的复苏，推荐新手操作。这样必须在24-48 小时后传代。摇匀时要左右轻轻摇动，保证所有的细胞能够均匀的分布。
（6）第二天进行换液，保证去除死细胞。正常的培养过程是三天进行一次换液，如果细胞长到有
80-90 ％汇合进行传代。
注意事项：第二天换液可以去除死细胞对正常细胞的影响，正常的复苏情况下是会有少量的死细胞。细胞在80-90％汇合必须进行传代，否则会由于接触抑制而导致细胞的状态变差或者是消化后成团。本文来源细胞新语网(https://www.doczj.com/doc/a116762381.html,),干细胞最新动态资讯网站,干细胞美容抗衰老与干细胞
健康管理发展历程尽在其中。
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/a116762381.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/a116762381.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与 β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前
间充质干细胞培养方法 １、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境 ５、细胞培养板得选择 6. 如何选用细胞培养基? 7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S ) 10.细胞得细菌、真菌污染及排除 就是否需要灭活? １１、细胞培养污染得预防 1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型? S胰酶 １5、干细胞得种类与表面标记 18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化? 理 20。冷冻保护剂作用与选择 1９、细胞传代消化过程指导? 21。细胞冻存指导 2２。干细胞冷冻与复苏 2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。? 2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。? 2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 (1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控 在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少