朊病毒及朊病毒病的研究进展 1982年，美国生理学家Prusiner及其同事，在大量实验的基础上，突破经典病毒学理论而提出朊病毒（prion）的概念，认为绵羊瘙痒病的病原体是一种尚未证实有核酸结构的蛋白质侵染颗粒（proteinaceous infectious particles），并将其称为朊病毒蛋白（Prion protein），简称为PrP。朊病毒是医学生物学领域中至今尚未彻底弄清，与病毒和类病毒都很不相同的一种蛋白质传染病原体。它是一组至今不能查到任何核酸、对各种理化作用具有很强抵抗力、传染性甚强、分子重量在27000～30000道尔顿的蛋白质颗粒，它们是在人和动物中引起可传递的海绵脑病的特殊病因。 朊病毒是一个超出经典病毒学和生物学的全新概念，蛋白质在特定条件下发生突变或构型上的变化由良性变为恶性，即变为具有传染性的侵染颗粒，可引起人和动物脑内神经元空泡变性（即海绵状变性），所以这类病毒引起的疾病被称为传染性海绵状脑病 （ Transmissible Spongiform Encephalopathy，TSE），又称为朊病毒病。 一、朊病毒引起的相关疾病 朊病毒都是致死性中枢神经系统的慢性退化性疾病，病理学上的特点是大脑皮层的神经元细胞退化、空泡变性、死亡、消失，最终被星状细胞取代，因而造成海绵状态。患者具有痴呆、共济失调、震颤等症状。已知人和动物朊病毒有以下几种：人的库鲁氏病，又称新几内亚震颤病（Kuru）；克－雅氏病（Creutzfeldt－Jakob disease，CJD），又称皮质－基底节－脊椎变性综合征，也有人称其为人类海绵状脑病和早老性痴呆症（Presenile Dementia）；致死性睡眠综合症（Fatal Familial Insomnia，FFI）；吉斯综合症，又称脑软化病（Gersrmann -Straussler-Scheikerg disease，Gss）;疯牛病（ Mad Cow Disease，MCD），即牛海绵状脑病（ Bovine Spongiform EncePhalopathy，BSE）；传染性紫貂脑病（TME）；猫海绵状脑病（ Feline Spongiform Encephalopathy， FSE）；羊瘙痒症（Sctapie），有绵羊瘙痒（Scrapie of sheep）和山羊瘙痒症（scrapie of gaats）两种；大耳鹿慢性消耗病（Chronic Wasting Disease of Mule Deer，CWD）；传染性雪貂白质脑病（Transmissible Mink Encepholopathy，TME）。 这些疾病有些在二百年前就已发现，如人们在羊群中发现一种传染病，其主要表现为兴奋、瘙痒、瘫痪等症状，最后死亡，称之为羊瘙痒病（Sctaple in sheep and goat）。1985年英国暴发疯牛病事件，人们注意到疯牛病的症状及脑部病理变化与羊瘙痒症类似，同属于海绵状脑病，多有食用病羊和病牛内脏或骨粉饲料的病史，于是人们才认识到种间传播的可能性，并将它们和人类的某些中枢神经疾病相联系，同时开始怀疑疯牛病会传染给人，至此，对此类疾病的研究达到高潮。 二、朊病毒病原学特征及分子机制 羊瘙痒病是最早发现的传染性脑病，其病原体也是研究最早和最多的病原体。1961年Chandler通过实验成功地把羊瘙痒病传染给小鼠，随后其他实验室的动物模型如白鼠、豚鼠、大鼠等相继获得成功，羊瘙痒病伴随纤维（Scrapie Associated Fibrile，SAF）是在Scrapie感染的小鼠脑组织用去污剂处理提取的膜性部分中观察到的一种特殊纤维结构。它有两个类型：Ⅰ型纤维，直径为11～14nm，由两根直径为4～6nm的原纤维相互盘绕而成，螺距为40～ 80nm不等；Ⅱ型纤维，直径为34nm，有四根相同的原纤维组成，每两根之间间隙为3～4nm。Ⅱ型纤维每100～120nm即出现一个狭窄区，狭窄区的直径约为9～11mn。进一步研究表明，无论是自然发生朊病毒病的动物还是人工感染朊病毒病的实验室动物，在脑组织的提取物中均观察到SAF，而对照组均为阴性。 1982年，Prusiner等人发现羊瘙痒因子感染的仓鼠脑组织中部分纯化的Scrapie病原的片段，经过了修饰或者蛋白酶水解后能够减弱其抗原性，同时发现寻求Scrapie特异性核酸所作的试验不能证实它有独立的传染性，他将分离出的这一特殊的蛋白质——蛋白酶抗性蛋白称之为朊病毒蛋白（PrP）。PrP是一种膜蛋白，存在于大部分组织细胞中，其正常功能尚不十分清楚，可能与细胞表面的信号识别和粘着有关；在淋巴细胞中，PrP可能与激活有关；在神经系统中，PrP可能与突触功能及调节生物钟节律有关。随着实验的进展，Prusiner又把朊病毒（PrP）称作传染性蛋白颗粒（proteineceous infectious particle）。该蛋白能够抵抗蛋白酶K的消化作用，分子质量为27000～30000道尔顿，故又称作PrP27－30，用免疫亲和层析纯化去污剂溶解的病脑提取物时，PrP27－30浓度与朊病毒滴度成正
中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.doczj.com/doc/115189534.html,
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准
作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院免疫室·综述· 甲型肝炎病毒受体的研究进展 崔天盆 巫学兰综述 吴健民审校 【摘要】 现对人甲型肝炎病毒受体-1(hu HAVcr-1),也叫肾损伤分子-1(Kim-1),亦称T细胞免疫球蛋白域、粘蛋白域蛋白-1(Tim-1)及其家族的结构和功能作一综述,反映这一免疫球蛋白超家族成员功能的多样性。 【关键词】 肝炎病毒,甲型; 受体,病毒 甲型肝炎病毒受体的发现和命名 Kaplan G等[1]采用保护性单克隆抗体190/4从非洲绿猴肾细胞(african green monkey kidney cells,AGMK)培养甲型肝炎病毒时发现甲型肝炎(下称“甲肝”)病毒受体-1(HAV cellular receptor-1,H AVcr-1)。Feigel-stock D等[2]从人的肝和肾细胞识别359个氨基酸的人甲肝病毒受体-1〔human homolog(s)of HAVcr-1, huHAVcr-1〕。 Ichimura T等[3]采用代表性差异分析(representa-tional difference analysis,RDA)从缺血再灌注肾模型细胞识别肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,Kim-1),也就是huHAVcr-1。 2001年Mcintire JJ等[4]采用DB A/2N与B ALB/c 遗传背景得到同类系(congenic)HB A鼠,在HBA鼠的11号染色体识别“T细胞气道高反应表型座(Tapr)”与哮喘发病高度连锁,且在人识别Tapr同源域位于5q33.2。从上述Tapr分别克隆得到两个基因,即T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白-1(T cell,immunoglobu-lin domain and mucin domain protein-1,Tim-1)和Tim-3。人Tim-1也就是人甲肝病毒受体-1,而Tim-3又称为huHAVcr-2。Mcintir e JJ等在HB A鼠Tim-3和Tim-1基因上发现多种变异位点与哮喘发病密切相关。 因此,Tim家族第一个被识别的成员———Tim-1,与以前识别的肾损伤分子-1(Kim-1)和人甲肝病毒受体-1(huHAVcr-1)是同一种分子。 甲型肝炎病毒受体的分布 印迹杂交分析表明,huHAVcr-1mR NA在肝、小肠、结肠、脾、肾和睾丸等很多组织器官表达,其中肾和睾丸的表达水平较高。而人huHAVcr-1蛋白在所有人体器官都表达,在肾脏和睾丸的表达水平较高。HAV的肝外复制点发现有胃肠道、肝、唾液腺、肾、脾和实验性感染灵长类的淋巴结,是否有共受体或胞外因子参与H AV感染仍不清楚[5]。但是HAVcr-1的广泛分布不能解释甲肝病毒的嗜肝性,Dotzauer A等[6]采用鼠模型报道甲肝病毒特异I gA通过去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein r eceptor)介导甲肝病毒可以感染肝细胞。 研究发现,Tim-1(huHAVcr-1)表达在正在分化和已分化的T H2细胞上,与之相对,Tim-3(huHAVcr-2)最初是美国著名的免疫学家发现其在T H1细胞上特异表达,但在T H1细胞极化后才表达,而非早期表达,在体外最少一轮极化后Tim-3才在T H1细胞表达[7]。 甲型肝炎病毒受体的结构及功能 huHAVcr-1与猴甲肝病毒受体-1(HAVcr-1)有79%的同源性,其6个半胱氨酸残基和第1个N-糖化位点与HAVcr-1相同,但是粘蛋白域的六聚体重复只有13次,而H AVcr-1则有27次。此外,huHAVcr-1胞浆域的C-端少12个氨基酸残基。鼠和人的Kim-1 (huHAVcr-1)的c DNA有43.8%的同源性,在Ig域有68.3%的同源性,且均含6个半胱氨酸残基[1,2,8]。 转染表达不含单克隆抗体190/4结合表位的huHAVcr-1cDNA的狗细胞能结合甲肝病毒,造成有限的甲肝病毒感染。转染huHAVcr-1的非洲绿猴肾细胞用保护性单克隆抗体190/4处理不能保护非洲绿猴肾细胞感染甲肝病毒,表明甲肝病毒是通过huH AVcr-1感染非洲绿猴肾细胞,而不是通过HAVcr-1,因为HAVcr-1已被单克隆抗体190/4阻断。此结果表明, huHAVcr-1可与甲肝病毒结合并成为甲肝病毒的功能受体。像其他小R NA病毒一样,低pH有助于受体介导的内吞,有利于HAV入侵,表壳的构象变化是HAV 基因组脱衣壳的第一步。
朊病毒特性与致病机理研究进展 刁小龙，徐志良，边静静，施福明，杨飞宇，胡鹏年，陈扶香 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail：dxl841016@https://www.doczj.com/doc/115189534.html, 摘要:朊病毒病是人和动物的一种退行性脑病，主要包括羊骚痒病，疯牛病，以及人的克——雅氏综合症。其致病因子被认为是一种由正常细胞PrP蛋白经非正常折叠所形成的蛋白质（PrP sc）。PrP sc和PrP c来自于同一基因具有相同的氨基酸序列，但在二级结构和三级结构上有很大的不同。因为PrP sc是一种不含有核酸的蛋白质感染因子，所以关于朊病毒的致病机理至今还没有完全弄清楚。但有关研究表明该病是由于PrP sc或ctm PrP在大脑中积累所致。 关键词；朊病毒，PrP，PrP sc 引言 朊病毒,也称为朊粒，是一种只有蛋白质而没有核酸的传染因子。它是动物和人传染性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephloathy, TSE）的主要致病因子。Prusiner的“唯蛋白”假说认为：TSE是哺乳动物细胞中普遍存在的正常细胞型PrP(Cellular Isoform Of Prion Protein, PrP c)转变为致病性的异常痒病型PrP(Scrapie Isoform Of Prion Protein, PrP sc)所致。PrP sc在感染动物脑内形成不溶性的、抗蛋白酶的积聚物而引起动物发病，1985年英国爆发疯牛病后，朊病毒引起了人们的极大关注。而且随着时间的推移和科研水平的提高，朊病毒蛋白的结构特征、生化特性及致病机理的研究取得了显著进展。 1 朊病毒病 1.1羊搔痒病（Scrapie） 早在1730年就有了关于羊搔痒病的记载。症状表现为：丧失协调性、站立不稳、烦躁不安、奇痒难熬、直至瘫痪死亡。但直到1936年，Cuill和Celle才通过试验证实其具有传染性。20世纪60年代，英国生物学家，阿尔卑斯用放射性物质处理破坏DNA和RNA后，其病变组织仍具有传染性，因而他认为羊搔痒病的致病因子并非核酸，而可能是蛋白质。由于这种推断不符合当时的一般认识，也缺乏有力的室验支持，因此没有得到认同。 1.2克—雅氏病（Creutzfeldt-jakob Disease,CJD） 1920年，发现克—雅氏病。由Creutzfeldt 和jakob 两位神经病理学家首先描述报道，因而被命名为克—雅氏病（CJD）。其经典病例特征是：脑组织出现明显海绵样病变，星状细胞增生及淀粉斑块，与羊搔痒病病理特征相似。 1.3库鲁病（Kuru） 19世纪50年代，在大洋洲巴布亚新几内亚东部海拔1000-2000米高地土著Fore居民中流行着原因不明的库鲁病。临床症状为：战栗性震颤并发展成为发音障碍，失语直至完全不能运动，一年内即死亡。此病受到人们的极大重视，后经检测发现库鲁病病理变化、临床经过、流行病学与痒病相似。 -1-
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体
class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 10281 6 Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):1385213911 7 Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):2451224581 8 Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):6073260761 9 Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:54725581 10 Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:91729241 11 Navarro F,Bollman B,Chen H,et https://www.doczj.com/doc/115189534.html,plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 37423861 12 Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J]. Nat Med,2003,11:1398214031 13 Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:1404214071 14 Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:113982114071 15 Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2 plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:2861228661 16 Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:2867228721 17 Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:1056210601 18 Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:272391 19 G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):281 20 Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 20811 21 Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acid substi2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):5652256571 22 Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):3927239321 23 Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回) 第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述 蔡荣钱程审阅 【摘要】 由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high2capacity or gutted or help2dependent Adenovirus,HD2AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。 【关键词】 第三代腺病毒载体;辅助病毒;Cre/loxP 作者单位:310018浙江理工大学生命科学院 第一代腺病毒载体具有稳定、滴度高、高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而
朊病毒及其致病机理研究进展 摘要：朊病毒是有侵染性的蛋白颗粒，是造成人类及其它动物的多种致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患的元凶，它不含有核酸，因而其生物学结构及特性、复制及致病机理具有特殊性，这也为朊病毒的鉴别提供了标准。此外，值得注意的是，朊病毒的遗传也具有多样性，这造成了朊病毒在不同宿主间的传播障碍。本文将针对上述问题，对朊病毒及其致病机理研究进展进行简要的介绍。 关键词：朊病毒 人类早在18世纪就发现了由朊病毒引起的致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患[1]，但却一直无法分离出朊病毒病原。这是因为朊病毒不含有核酸和脂类，是纯粹的“有侵染性的疏水性蛋白颗粒”[2]。直到1982年，美国加州大学神经病学教授Prusiner在对绵羊瘙痒病因子的研究中，才第一次揭开其神秘的面纱[3]。朊病毒的发现，无疑使人类对生命体的认 识，达到了一种新的高度——不具有核酸却能复制的朊病毒是否属于生物的范畴，至今仍处在激烈的争论之中。现在，就让我们一起来认识这一特殊的存在。 1.生物学结构及特性 朊病毒是由朊病毒蛋白(prion protein，PrP)组成的，是具有传染性的结构简单的糖蛋白，其分子量为27000～30000Da[4]，在电镜下看不见其病原颗粒。 朊病毒蛋白的前体(cellular isoform of the prion protein，PrP C)，是一种正常无害的蛋白质，是由宿主细胞一条染色体上的一个基因产生的，多数存在于神经元中，能通过空间构象变化形成感染形式的朊病毒蛋白前体(scrapie isoform of the prion protein，PrP Sc)。PrP Sc 再经蛋白酶的酶切作用可转化为具有侵染性的PrP27～30，最后通过纤维聚合自我成核作用，形成朊病毒蛋白。PrP27～30的浓度与其传染性成正比，经化学灭活处理后，其活性与传染性将同步下降。 1.1.理化性质 由于朊病毒是纯粹的疏水性蛋白颗粒，因此能抵抗多种核酸酶（包括RNA酶和DNA酶）的作用，但却可被胰蛋白酶降解，蛋白质变性剂或氨基酸化学修饰剂也对其具有灭活或抑制作用。它耐高温，能抵抗254nm紫外线的照射，但对237nm紫外线表现敏感[5]，同时能抵抗离子辐射和超声波。一般的化学消毒剂对其无破坏作用。 1.2.生化特性 由于朊病毒不具有遗传信息载体——核酸，不能像病毒一样通过逆转录，利用宿主细胞物质合成自身所需物质，因此，它不能形成包涵体，不能产生干扰素，也对干扰素不敏感， 同时不能干扰其他病毒产生干扰素。它不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能，也不会引起宿主的免疫反应。免疫增强剂和免疫抑制剂均不能改变其致病过程。在温和的清洁提取物中纤维状或短杆状朊病毒会大量聚合，表明其在非变性去污剂中不溶。朊病毒只以单体或是二聚体形式存在，所以用核磁共振（NMR）和X光谱分析不能辨别其构象[6]。 此外，由于朊病毒依赖于磷酸肌醇磷脂酶作为结合位点（GPI）附着在细胞表面，因此经过磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，朊病毒不会从膜上被释放[7]。 1.3.基因结构 PrP基因为单一基因，人、哺乳动物和禽类都具有该基因。人类朊病毒蛋白(PrP)基因定位于20号染色体，小鼠则定位于2号染色体[8]并与控制朊病毒潜伏期的基因(Prn-i)相连
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含