名称解释
细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。
组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。
器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。
无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。
完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。
接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。
无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。
不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑
细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量
细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
1）体外培养细胞，其生长方式主要有贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁细胞和悬浮细胞。
2）一般可将贴壁细胞生长的体外培养细胞大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多行细胞型四种类型，最常见的为前两种。
3）体外培养细胞的主要生长特点：①贴附生长②接触抑制③密度依赖性培养细胞分化状态的变化：①去分化（脱分化）②不适应
1、细胞培养的基本要求有哪些和工作方法
要求：1）培养前准备2）操作间消毒3）洗手和着装4）火焰消毒
培养前的准备的基本要求：培养基的选择和无菌配制
动物细胞培养用液的类型、配制和无菌处理
方法：1）操作程序规范2）试剂设备专人负责3）培养用品定点存放
2、平衡盐溶液（BBS）：（1）成分：无机盐和葡萄糖，少量酚红。（2）作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度（3）常用：Hanks液、PBS等
消化液（1）作用：分散组织或细胞团。2）常用：胰蛋白酶消化液、胶原酶消化液、EDTA-2Na液、蜗牛酶等2、消化液中的胰蛋白酶消化液、胶原酶消化液、EDTA-2Na液作用的原理是什么？
胰蛋白酶消化液主要作用是水解细胞之间的蛋白质，使细胞相互分离。
EDTA-2Na液：是一种化学螯合剂，其溶液又称Versen液，对细胞有一定的离解的作用。EDTA-2Na液的主要作用是通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子从而破坏细胞之间的细胞连接。达到分散细胞的目的。
胶原酶溶液：胶原酶是从细胞中提取的一种酶，对胶原组织和细胞间质有较强的消化作用，而对培养细胞一般不产生损伤，常在上皮类细胞原代培养时用来离散细胞与胶原组织。
3、1）天然培养基：定义:主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。
优点：含有丰富的营养物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，培养效果好。
缺点：成分复杂，批间差异大，易被支原体污染。
2）合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的，配方恒定的培养基。
成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量固定。成本低。
缺点：缺少某些成分，不能促进细胞增殖生长。
3）完全培养基;定义：在合成培养基里添加血清后的培养基。细胞生长培养基:常用培养基，血清含量高, 10-20%。
维持培养基:维持细胞不死或缓慢生长，血清含量低, 2-5%。
4）无血清培养基：定义：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。
用途：用于研究细胞生长因子、单克隆抗体制备、细胞分泌产物研究等。
优点：保证实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少细胞污染，简化提纯和鉴定等程序。
3、完全培养基中各成分的作用是什么？
合成培养基（基础培养基）的成分只能维持细胞生存
血清：常用牛血清，含有促进细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。
一定量的抗生素：防止污染
4、体外培养细胞与体内培养细胞的差异都有哪些？
5、论述培养细胞的一代生存期可分为几个阶段及其特点？
培养细胞的“一代生存期”，是指从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间，它与细胞世代或倍增时间不同。可分为潜伏期、指数生长期、停滞期（平顶期）
1.潜伏期特点：1）细胞适应新环境的恢复期（包括悬浮期、贴壁期、潜伏期三个时期）2）可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。
2.指数生长期特点：1）细胞增殖最旺盛的时期，细胞数量呈指数生长，是实验研究和生产的主要阶段。2）用细胞分裂指数和细胞群体倍增时间表示。
3.停滞期特点：特点：细胞数量不再增加，仍有代谢活动
6、动物细胞培养具有一系列优点：
①可简化细胞的生长环境。在细胞存活的基础上独立研究细胞生命活动、逐项研究细胞生存条件和细胞功能。
②能够方便地控制实验因素。研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或者删除这种成分。
③易于观测实验结果。利用细胞培养技术研究细胞的生命活动规律，可以很方便地采用各种实验技术和方法来观察、检测和记录。
④可供研究的细胞种类极其广泛。
⑤可同时提供大量均一性较好的细胞群，降低实验成本。
⑥能够进行大规模生物制品的生产。
包括酶、单克隆抗体以及多种疫苗等生物制品或者基因工程产品。
2、动物细胞培养的缺点：
①体外培养的动物细胞对营养的要求较高。
②动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。
③体外培养的细胞与体内生长的细胞存在或多或少的差异。（形态和功能的差异）
7.动物细胞培养实验室有哪几个部分组成？
理想的培养实验室可分为：准备室、缓冲室（与培养室相连的消毒房间，作为隔离培养室与外面非消毒房间的
缓冲地带）、培养室（一间或几间），普通实验室、办公室。
8.论述细胞培养的生长特点。
培养细胞生命期：指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括三个阶段：原代培养期、传代培养期、衰退期。
1.原代培养期（也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周）
特点：二倍体，细胞分裂次数少，异质性，独立生存性差。用途：药物测试，疫苗制备等。
2.传代培养期（定义：原代细胞接种到两个或以上的器皿继续进行培养标志进入传代培养期）
特点：细胞分裂增殖旺盛，去分化，在全生命期中此期的持续时间最长，传代10-50次。
3.衰退期（定义：传代培养一定代数后，细胞生命活动明显减弱，增殖很慢或不增殖，直至衰退死亡的时期。）细胞特点：细胞形态轮廓增强，色泽变暗，细胞质内出现暗的颗粒样结构及空泡状结构，胞质突起回缩，最后
衰退凋亡。
9.论述玻璃制品清洗步骤
10、论述动物细胞培养技术的应用
1.在生物学领域基础研究中的应用
（1）在细胞生物学上的应用研究细胞的形态、结构、生长发育、细胞营养、代谢以及病变等微观过程。（2）在遗传学上的应用染色体分析，杂交育种。
（3）在胚胎学上的应用通过体外培养卵母细胞，进行体外受精、胚胎分割和移植。
（4）在病毒学上的应用培养细胞为病毒的增殖提供场所。
（5）在药理学领域的应用药品、食品添加剂等对机体的毒性及其产生不良影响的安全性调查。（许多致畸、致癌物质加入动物细胞培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。）
2.在临床医学上的应用
（1）用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断用羊膜穿刺技术获得胎儿细胞，培养后进行染色体分析，诊断胎儿
是否患有遗传性疾病或先天畸型。
（2）用于癌症的早期诊断和预防通过培养淋巴细胞，对其染色体进行对比分析检测出易患癌症的病人，进
行及早的预防和治疗。
（3）用于临床治疗目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。（4）用于药物效应的检测检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的细胞，如检测治疗肝病的药物可选
用肝细胞、检测抗癌药物可选用癌细胞。
3.在动物育种上的应用
新品种的培育可大大缩短育种进程，且更加经济有效。胚胎干细胞的研究成果和克隆羊多莉的
问世为动物遗传育种开辟了一条新途径。
4.在生物制品生产上的应用
用动物细胞可生产的生物制品有各类疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、病毒杀虫剂、单克隆抗体等。11、血清
种类：人血清、牛血清、马血清等。
成分：基本营养物、激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。
标准: 透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。
使用：逐步解冻，热灭活， 10%浓度，超低温保存。
牛血清又分胎牛血清和小牛血清，它们的区别
胎牛血清是从母牛剖腹取出的胎牛中分离出来的血清，对许多细胞系均有促进生长作用，主要用于细胞株的保藏及特殊娇贵细胞株的体外培养，但价格昂贵。
小牛血清是从刚出生但尚未哺乳的小牛分离出来的血清。
12、细胞传代方法
贴壁细胞的消化法传代步骤
（1）吸出或倒掉瓶内的旧培养液。
（2）加入适量的消化液消化。
（3）镜检，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。
（4）吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液。
（5）计数，接种到新的培养瓶。
悬浮细胞多采用离心法传代
将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心5min,然后取出上清，加入新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。
13、培养细胞的观察和检测技术
1）培养液观察培养液的颜色和透明度的变化。
正常培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色、清亮透明。
培养中细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。
2～3天或3～4天换液一次。
2）细胞生长状况倒置显微镜观察。
原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞。
成纤维细胞是最易生长的细胞。
细胞长满瓶底80%应及时传代。
3、细胞形状变化
生长良好的细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。
细胞生长状态不良的细胞：轮廓增强，细胞折光性变弱，边缘不齐，胞质中出现空泡、脂滴、颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞表面及周围出现丝絮状物。
采取措施：换液、排污、废弃。
4、微生物污染
细菌污染：培养液浑浊、漂浮菌丝。
支原体污染：生长减缓、胞质颗粒增多、培养液不变混。
细胞交叉污染。
化学物质污染。
14、去分化和不适应的区别
“去分化”不可逆（染色体变化）。“不适应”可重新诱导（培养条件变化）
关于去分化需要注意：①去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态。如:高度分化的神经细胞和心肌细胞已经丧失的增生活性不可能恢复，但已经具备的生物电活动特性不会完全失去。
②可重新表现出分化特点。如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的角质细胞、内皮细胞，但，这种能力会随着培养时间延长逐渐丧失。
15、谷氨酰胺在培养基中的主要作用？配液时应该注意哪些问题？
作用：在细胞代谢中有重要作用，是细胞合成核酸和蛋白质必需氨基酸，（在缺少时，细胞生长不良死亡）
配液时：由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20度冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4度冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来的谷氨酰胺。
第二章
1、细胞冷冻的原理是什么
细胞冻存的原则：慢冻快融 2）加冷冻保护剂（常用：甘油或二甲基亚砜（DMSO)）
主要原因：1）冷冻速度过快，细胞内水分结冰形成冰晶，造成细胞膜和细胞器的破坏引起细胞死亡。冷却速度越快，冰晶损伤越大。
2）细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。
冷冻保护剂作用机理：1）冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成；
2）通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。
2、复苏原理
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5~0度，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害，以防止细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
3、细胞复苏的过程
①将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。
②从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。
③将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。
④将细胞悬液经800～1000 r/min离心5min。弃上清液。
⑤给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加培养液37℃、5%CO2培养。
4、细胞活性检查
1.染色法：使损伤或死亡细胞着色。结晶紫、台盼蓝、苯胺黑等。
2.四唑盐（MTT）比色法：活细胞可沉淀四唑盐并形成蓝紫色结晶，再用DMSO溶解结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲躜量成正比。用酶标仪在5 7 0nm波长处测定其吸光度OD值，可间接反映活细胞数。
第三章
1、原代细胞培养常用组织块培养法和消化培养法。
2、组织块培养法
定义：组织块培养是即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶培养的方法。
基本方法：将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。
特点：操作简便，组织块易损伤，细胞生长缓慢，适于组织量少的原代培养。
基本过程：①取材修剪冲洗；②剪成1mm3左右的小块；③移入培养瓶；④间距5mm分布组织小块；⑤翻转培养瓶37℃静止2-4h；⑥翻正培养瓶培养；⑦原代细胞培养。
3、消化培养法
定义：利用组织消化分散法将细胞间质物质去除，使细胞分散，形成悬液培养的方法。
特点：容易获得大量细胞，生长速度快，适于培养大量组织，但步骤繁琐，易污染，实验费用高。
过程：①消化分离法消化细胞、镜检；②发现组织已分散成细胞团或单个细胞，终止消化，筛网过滤，大块继续消化；③过滤的消化液，低速离心，加培养液，细胞计数后，接入培养瓶。
4、原代取材的基本要求
（1）无菌取材：严格无菌操作。
（2）取材器械锋利：防止机械损伤。
（3）及时培养：可培养液4℃暂存。
（4）去除无用组织，避免干燥。
（5）营养丰富：添加10%血清。
（6）采用易培养组织：组织类型、分化程度、年龄等。
（7）作好记录：来源等信息及标本要保留。
5、组织材料的分离
1) 细胞悬液的分离方法来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，可采用离心法分离。一般采用
5000~1000r/min的低速离心5~10分钟。
2)组织材料的分离方法可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。
1.机械分散法方法:注射针芯挤压法。特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用
于处理纤维成分少的软组织。
2.剪切分散法利用剪切法将组织剪切成1平方毫米的小块。
3.消化分离法定义：消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。种类：胰
蛋白酶法、胶原酶法、EDTA法。
6、应用体外培养技术进行中瘤研究具有的优点
1，可以免受机体内部因素的影响，从而便于研究理化和生物等因素对肿瘤细胞生命的影响2、便与研究肿瘤细
胞的结构和功能3、肿瘤细胞可长期保存以便观察其遗传行为的变化4、可用抗癌药物的快速筛选
7、肿瘤细胞培养生物学特性：永生性、侵袭性，不受控增殖性，遗传性质改变，异质性、成瘤性。
第四章
动物细胞大规模培养技术：指在人工条件下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品
的技术
微载体：微载体指直径在60～250微米，能适用于细胞贴壁培养的微珠，一般由葡聚糖或各种合成聚合物组成。中空纤维培养技术：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用中空纤维给培养细胞提供物质代谢条件而建立的一
种大规模培养方法
微囊化培养是指在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质以及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养的方法。
1、动物细胞大规模培养的方法 1.贴壁培养2.固定化培养3.悬浮培养
（一）贴壁培养
定义：指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养方式。
优点：适用细胞种类多；容易采用灌流培养；容易更换培养液。
缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，投资大。
培养方式：旋转瓶培养、中空纤维培养、细胞工厂培养、微载体培养。
（二）固定化培养
定义：将动物细胞与水不溶性载体结合起来进行培养的方式。
优点：既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养，细胞密度高，抗剪切力和抗污染力强，易于分离纯化。
方法：吸附法、包埋法、微囊法
（三）悬浮培养
定义：指细胞在生物反应器中自由悬浮生长的培养方法。
优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。
缺点：体积小，较难采用灌流培养。
常用反应器为搅拌式和气升式。
2、微载体的选择有何要求
①微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适用细胞附着、伸展和增殖；
②微载体无毒、惰性，不与培养基成分发生化学变化，也不会吸收培养基中的营养成分；
③微载体的比重在1.030～1.045g/ml，使载体在低速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获；
④粒径在60～250μm（溶胀后）之间，均一，差异不大于20 μm 。有利于细胞均匀分布在各微载体表面；
⑤具有良好的光学透明性，利于观察细胞在载体上的生长情况；
⑥可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌；
⑦原料充足，价廉，制备简便，经简单的适当处理后，可反复多次地使用。
3、微载体培养的操作包括哪些步骤
①培养初期阶段；
②粘附贴壁阶段；
③维持培养阶段；
④细胞收获阶段；
⑤微载体培养放大阶段
4、大规模培养技术的应用
5、微囊化培养中微囊的制备应注意哪些问题
1）温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作2）所用试剂和膜材料对细胞无毒害3）膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过4）膜应有足够机械强度抵抗培养中的搅拌。
6、理想的动物细胞生物反应器应满足哪些基本要求？使比较教材所介绍的几种生物反应器各自优缺点
①能提供充足氧气；
②良好的传质传热及密闭性能；
③制备材料对细胞无毒；
④有自动检测调控系统；
⑤便于操作维护。
1、搅拌式细胞生物反应器优点：避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，没有移动部件，密封好，氧转换率较高，便于放大。缺点：氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌。
2、气升式动物细胞培养反应器优点:器内气流温和均匀剪切力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，
便于放大生产缺点：1）这种生物反应器只能用于需要气体的反应，或者是需要有气体的场合2）在培养细胞的过程中会产生大量的气泡，从而会对正在培养的细胞的生长产生影响3）这种生物反应器，如果没有其他装置的帮助就只能培养悬浮生长的细胞。
3、中空纤维细胞培养反应器优点1）培养器体积小，细胞高细胞损害小；2）浓缩产品；3）易于分离产物，
产物纯度高，不易污染；4）自动化程度高，细胞生长周期长。缺点:细胞生长速度慢，代谢物容易堵塞孔径，不易清洗维护，价格高
第五章
抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。
抗体：是指机体受抗原刺激后产生的能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。
单克隆抗体：即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。
多克隆抗体：一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，进入机体后会刺激好几中B细胞增殖，因而使机体
产生几种不同的抗体，成为多克隆抗体
基因转染技术：将外源性基因采用化学或物理的方法人工导入细胞的技术。主要用于癌基因研究。
1、什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗体有何异同？
单克隆抗体是由一种B细胞克隆所产生的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。
局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂，费
时费工，价格较高。
特性：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制
不同：单克隆抗体的特异性强，只针对单一的抗原表位；而多克隆抗体则可以与多个抗原表位结合，当抗原的
某个抗原表位改变时，单抗不能发挥其作用
2、简述单克隆抗体的制备流程和应用。
应用：1）用于疾病的诊断和治疗：2）作为载体制备导向药物。
3、骨髓瘤细胞和脾细胞融合过程中应特别注意的几个问题是什么
1)细胞比例2）反应时间3）反应温度4）PEG的选择
4、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
1）要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但B淋巴细胞不能在体外生长。
2）而骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞融合，得到杂种骨髓瘤细胞。
3）杂种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
5、HAT筛选杂交瘤细胞原理
细胞融合时加入HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基喋呤、T为胸腺嘧啶）选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。HAT培养基是含有由次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)、的一种选择性培养基，这三种成分与细
胞DNA合成有关。A可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨基碟呤的培养基中不能通过正常途径合
成DNA。这时正常细胞可以通过“补救合成途径”,由胸腺嘧啶激酶（HK）和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用T和H合成核酸而繁殖。
骨髓瘤细胞都是HGPRT缺乏株，不能利用H和T合成DNA，而B细胞中有这种酶，但在体外培养只存活5·7天，所以只有脾-瘤才能在HAT选择培养基上生长。
6、酶联免疫吸附法（ELISA）原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留
酶的活性。
第六章
外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段）。
愈伤组织：在人工培养基上，由外植体的表面形成的一团不定形的排列疏松的薄壁细胞。
细胞全能性：植物的每个细胞都携带一整套遗传信息，具有发育成完整植株的潜力。
脱分化：已经分化的细胞、组织、器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。
再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化为胚状体或直接分化出器官。
植物细胞培养：在离体条件下将易分散的植物组织或植物的愈伤组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞（单个细胞），通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。
1、植物组织与细胞培养的区别与联系
①培养对象不同
植物组织培养包括植物器官和组织如根、茎、叶、花、果实、种子等。
动物细胞培养包括各种单细胞、单倍体细胞、原生质体、小细胞团、固定化细胞等。
愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养。
②培养目的不同
组织培养：获得植物组织和再生成植株，或利用发状根培养生产某些次级代谢物。主要用于植株的产业化生产和繁育。
细胞培养：获得细胞和产物，进行生物转化，进行种质保存、人工种子的制备和植株的大规模快速繁殖。
2、外植体的选择和预处理
1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小，如叶片组织。
2、外植体的预处理：
（1）冲刷材料：流水，几分钟-数小时，加洗衣粉、吐温等表面清洗剂。
(2) 表面浸润灭菌：超净台，70%酒精，10-30S。
（3）深层灭菌：氯化汞、次氯酸钠等。
（4）无菌水冲洗。 3min/次，3-10次。
3、愈伤组织培养的一般程序
1.培养基配制
2.愈伤组织诱导
3.继代培养
4.从愈伤组织分离得到细胞
4、一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？
特性：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。
要求：①选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。
②选择适宜的培养基：生长素浓度很重要配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。
③愈伤组织要进行继代选择：选择疏松好、细胞状态好的细胞不断继代培养。
5、为什么要进行植物组织固定化培养
虽然细胞悬浮培养能够产生大量次生代谢物，但是人们所期待的次生代谢物往往产量不高，细胞固定后的密集
而缓慢的生长有利于细胞的分化和组织化，从而有利于次生代谢物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对
环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次
生物质的关键。与植物悬浮培养比较，固定化植物细胞具有稳定性好，产物容易分离、利于连续花生产等特点。但是只适用可以分泌到细胞外的次级代谢物的生产。
6、常见的植物细胞生物反应器有有哪些？各有和优缺点？
1）搅拌式生物反应器优点：混合性好，传氧效率高，操作弹性大，可用于细胞高密度培养等。缺点：由于植物细胞对搅拌是所产生的剪切力的忍耐力较差，传统的搅拌式生物反应器通常易对细胞产生伤害。
2）气升式生物反应器优点：剪切力小，结构简单，好的无菌状态。氧的传递速率较高。缺点：操作弹性小，
低气速在高密度培养时，其混合效果较差，植物细胞生长较慢。
3）鼓泡式生物反应器优点：容易长期保持无菌操作缺点：混合性能差，对养的利用绿较低，对于高密度及黏度较大的培养体系，反应器培养效率会降低。
4）填充床式生物反应器优点：单位体积固定细胞量大，反应速率较大，缺点：混合不均匀、床内氧传递速
率等
5）流化床式生物反应器优点：混合效果好，缺点：流体的切变力和颗粒的碰撞常造成颗粒破损而使细胞外流，同时流体学的复杂性也使其放大困难，
6）膜反应器优点：容易控制，易于放大、产物一分离。简化了下游工艺等缺点：膜材料的限制，构建莫反应器的成本较高。
《动物细胞工程学案》 张建尚/江苏 【学习目标】站得高——明确学习目标。 1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。 3.举例说出动物细胞融合的与单克隆抗体的原理和应用。 【重点和难点】 重点：1.动物细胞培养的过程及条件。 2.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 3.单克隆抗体的制备和应用。 难点：1.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 2.单克隆抗体的制备和应用。 【学法提示】 1.利用动物细胞培养过程示意图学习动物细胞培养过程，对每一步采取的措施要掌握其目的、原因，区分原代培养和传代培养，并与植物组织培养进行比较。 2.从植物原生质体融合入手，理解动物细胞融合的方法、过程；根据B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特点，理解单克隆抗体制备的方法、意义和利用。 【课前预习】起步稳——知识源于生活。 1.动物细胞工程常用的技术手段有①、②、③、 ④等，其中⑤技术是其他动物工程的基础。 2.动物细胞培养的流程：取动物组织块→剪碎→用①处理分散成②→制成③→放入培养瓶中进行④培养。对动物细胞进行培养时，要求培养瓶或培养皿内表面⑤。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的⑥。贴满瓶壁的细胞需要重新用 ⑦处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养称为⑧。 3.动物细胞培养的培养液应进行①处理，通常还要在培养液中添加一定量的②，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止③对细胞自身造成危害。合成培养基的成分主要有④等，通常还需加入⑤等天然成分。细胞培养中的O2是⑥所必需，CO2的主要作用是⑦。 4.动物细胞核移植是将动物的一个细胞的①，移入一个已经去掉细胞核的②中，使其重组并发育成一个新的③，并最终发育为动物个体。哺乳动物核移植可以分为④核移植（比较容易）和⑤核移植。 5.动物细胞融合也称①，融合后形成的具有原来②细胞遗传信息的单核细胞，称为③。动物细胞融合不同于植物原生质体融合的诱导方法是④。 6.将效应B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，经过筛选后得到①细胞，这种细胞既能大量②，又能产生③。将这样的细胞群在④条件下或注射到⑤内增殖，就可以获得大量的单克隆抗体。单克隆抗体最主要的优点是⑥，并可能大量制备。 答案1.①动物细胞培养②动物细胞核移植③动物细胞融合④生产单克隆抗体⑤动物细胞培养2.①胰蛋白酶或胶原蛋白酶②单个细胞③细胞悬液④原代培养⑤光滑、无毒、易于贴附
名称解释 细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。 组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。有时泛指所有的体外培养。 器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。 无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。 完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。 接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。 无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。 不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。原因：培养条件变化使分化发生阻抑 细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量 细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
阶段质量检测(二) 细胞工程 (时间:4５分钟,满分:10０分) 一、选择题(每小题3分,共45分) 1、下列生物工程技术中,不属于细胞工程得就是( ) A.通过试管动物大量繁殖优良动物 Ｂ.利用含有人胰岛素基因得大肠杆菌生产胰岛素 C.通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D、将某人得肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系 2。下列关于植物体细胞杂交技术得叙述,错误得就是( ) A.获得原生质体得过程需要用到纤维素酶与果胶酶 B.利用植物体细胞杂交可以获得某种多倍体植株 C.植物体细胞杂交过程就就是原生质体融合得过程 Ｄ。可根据细胞中染色体数目与形态得差异来鉴定杂种细胞 3.植物体细胞杂交制备原生质体与动物细胞培养配制一定浓度得细胞悬浮液,所需要得酶依次就是( ) Ａ.淀粉酶与磷脂酶 B.纤维素酶与胰蛋白酶 C.脂肪酶与二肽酶 Ｄ。过氧化氢酶与半乳糖苷酶 ４.下列有关单克隆抗体制备得叙述,正确得就是( ) A.先利用特定得抗原蛋白饲喂小鼠,再从小鼠脾脏中分离B淋巴细胞 B。为避免病毒感染,只能用聚乙二醇、电激等处理来诱导骨髓瘤细胞与已免疫得B淋巴细胞融合 Ｃ.体外培养杂交瘤细胞需要在培养液中添加动物血清与抗生素 D.经过选择培养基初次筛选得杂交瘤细胞即可进行体内或体外培养 5。(全国高考)关于动物细胞培养与植物组织培养得叙述,错误得就是( ) A.动物细胞培养与植物组织培养所用培养基不同 Ｂ.动物细胞培养与植物组织培养过程中都要用到胰蛋白酶 C、烟草叶片离体培养能产生新个体,小鼠杂交瘤细胞可离体培养增殖 D。动物细胞培养可用于检测有毒物质,茎尖培养可用于植物脱除病毒 ６。细胞工程中,选择合适得生物材料就是成功得关键、下列选择不合理得就是( ) A、选择高度分化得动物体细胞进行培养有利于获得大量细胞 Ｂ。选择胚胎细胞作为核供体进行核移植可提高克隆动物得成功率 Ｃ、选择一定大小得植物茎尖进行组织培养可获得脱毒苗
2.2动物细胞工程 2.2.1动物细胞培养和核移植技术 基础巩固 W i 下列不属于动物细胞培养必需条件的是（） A. 无菌、无毒的环境 B. 适宜的温度和pH C. O 2等气体环境 D. 适宜的光照条件 答案 D 下列关于动物细胞培养的叙述，不正确的是（） A. 动物细胞培养技术的原理是细胞的全能性 B. 传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞 C. 癌细胞在培养瓶中不会出现接触抑制现象 D. 动物细胞培养一般需要使用 CO 2培养箱 解析动物细胞培养的原理是细胞增殖。 答案A ? 3在动物细胞培养过程中 ，使用胰蛋白酶的目的是（） A. 使动物组织分散为单个细胞 B. 去掉细胞壁，使其成为原生质体 C. 去掉细胞膜，暴露岀原生质体便于细胞融合 D. 促进蛋白质水解为多肽 解析在进行动物细胞培养前 ，先用胰蛋白酶使组织块中的细胞相互分散开 ，以增加细胞与培养液的接触面积 便于培养。 4下列有关核移植的说法，错误的是（ ） A. 用核移植得到的动物称为克隆动物 B. 核移植的受体细胞最好是受精卵 C. 核移植可以充分发挥优良种畜的繁殖潜力 D. 核移植得到的克隆动物属于无性生殖 解析核移植的受体细胞应该是 M n 中期的卵母细胞，相对受精卵来说 ，M n 中期的卵母细胞细胞质所含的物 ? 5用于动物体细胞核移植的供体细胞一般选用（） A. 受精卵
B. 传代10代以内的细胞 C. 传代10?50代以内的细胞 D. 处于减数第二次分裂中期的次级卵母细胞 解析培养的动物细胞一般当传代至10~50代时，部分细胞核型可能会发生变化，而传代10代以内的细胞一般 能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞作为供体细胞。 W6在进行核移植时，通常将整个体细胞而不是细胞核注入去核卵母细胞中，下列有关叙述错误的是() A. 体细胞太小因而去除细胞核较困难 B. 细胞质中遗传物质少因而对遗传的影响很小 C. 直接将体细胞注入卵母细胞中简化了操作程序 D. 体细胞的核离开了原来的细胞质将不能存活 解析体细胞太小因而去除细胞核较困难，因此可将整个体细胞注入去核卵母细胞中，A项正确；DNA主要位于细胞核中，细胞质中遗传物质少，因而对遗传的影响很小，B项正确；将整个体细胞注入去核卵母细胞中，简化了操作程序，C项正确；体细胞的核离开了原来的细胞质，注入去核的卵母细胞依然能存活，D项错误。 ? 7下列关于动物细胞培养过程的叙述，错误的是() A. 制作细胞悬液时可以使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 B. 悬液中分散的细胞很快贴附在细胞壁上，细胞贴壁体现了细胞的适应性 C. 细胞进行有丝分裂，数量增加到相互接触时可以使用胃蛋白酶处理后分瓶培养 D. 传代10代以内的细胞一般保持细胞正常的二倍体核型 解析将相互接触的动物细胞分散开需使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。答案C j 8甲羊的去核卵细胞与乙羊体细胞的细胞核组装”成一个新的细胞，该细胞多次分裂后植入丙羊的子宫 内发育，产下羊羔的毛色和性别分别与哪只羊保持一致(决定毛色的基因位于细胞核中)?() A. 甲、丙 B.甲、甲 C.乙、乙 D.丙、甲 解析决定毛色和性别的基因都位于细胞核中，因而产下的羊羔的毛色和性别与提供细胞核的乙羊相同。答案C 1—9某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有 甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞、乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题。 (1) 将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，会观察到甲细胞数量比乙细胞数量______________ 。 (2) 在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因 是______________________________________________ 。细胞培养应在含5% CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是___________________________ 。 (3) 在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长 ____________ 。药物试验需要大量细胞，两种细胞频 繁传代，甲细胞比乙细胞传代的次数更 ____________ 。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用______ 处理。 (4) 为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的_____________ 。 (5) 已知癌基因X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
学校：临清市第二中学学科：生物编写人：黄丽平审稿人：于振玲 专题二细胞工程——.动物细胞工程 2.2.1动物细胞培养和核移植技术 课前预习学案 一、预习目标 预习动物细胞培养的过程、条件及应用和核移植的过程及应用前景。 二、预习内容 （一）、动物细胞培养 1、动物细胞培养的概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中；让这些细胞生长和增殖。 2、动物细胞培养的过程：取动物组织块-----------剪碎组织；--------------胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理-------------分散成单个细胞；------------制成细胞悬液-------原代培养（贴壁生长）-----------------------分瓶----------传代培养10代以内，遗传物质未改变。------细胞株---------10~50代，遗传物质改变----------细胞系。 3、条件：（1） （2） （3） (4) 4、应用：（1）生产生物制品。（2）———————————————— （3）检测有毒物质。 （二）：动物体细胞核移植技术 1、概念：将动物一个细胞的_________________,移入一个______________________________中，使其重组并发育成一个新的________________这个新的胚胎最终发育为新的个体。 2、过程： (1)取供体_________________ →供体细胞培养。 (2)从卵巢中采集_________________ →在体外培养到_______________________ →去核。 (3)将供体细胞注入_____________________ →使两细胞____________→供体核进人受体卵母细 胞→构建_________________。 (4)将胚胎______________到代孕母体内→生出与供体遗传物质基本相同的个体。 3、应用：(1)加速家畜_________________进程，促进优良畜群繁育。 (2)保护_________________物种。 (3)生产_________________。 (4)作为异种移植的_____________。 (5)用于_________________的移植。
细胞工程练习题 一．选择题 1. 在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，下列哪一项条件是不需 要的 A．消毒灭菌B．适宜的温度C．充足的光照D．适宜的养料和激素 2. 下列关于植物组织培养的叙述中，错误 ．．的是 A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B．培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 3．我国科学工作者曾成功地将分别属于两个科的植物----烟草和菠菜杂交成功，从而获得一种新型的烟草品种。在此过程中，下列操作不．是必需的是 A．杂交前要除去两种细胞的细胞壁 B．原生质体融合前要先脱分化 C．原生质体融合后，要选出烟草----菠菜融合细胞加以培养 D．要诱导愈伤组织进行再分化 4．下图是“白菜—甘蓝”杂种植株的培育过程。下列说法正确的是 A．所得到的“白菜—甘蓝”植株不能结籽 B．愈伤组织是已高度分化的细胞 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂等过程 D．诱导原生质体融合时可用聚乙二醇 5．下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，相关叙述中正确的是 A．②阶段会发生减数分裂过程B．①阶段需生长素而③阶段需细胞分裂素C．此过程体现植物细胞具有全能性D．此兰花的花药离体培养所得植株为二倍体6．下图为将胡萝卜的离体组织在一定条件下培育形成试管苗的过程示意图。有关叙述正确的是 A. 利用此过程获得的试管苗可能为杂合子 B．①②过程中都会发生细胞的增殖和分化 C. 多倍体植株的培育需经过如图所示过程 D．此过程依据的生物学原理是细胞膜具有流动性 7. 各项培育植物新品种的过程中，不经过愈伤组织阶段的是 A．通过植物体细胞杂交培育白菜——甘蓝杂种植株 B．通过多倍体育种培育无子西瓜 C．通过单倍体育种培育优质小麦 D．通过基因工程培育转基因抗虫水稻 8. 作物新品种的过程中，常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 ③ ② ① 四倍体兰花叶片愈伤组织胚状体植株
自我小测 1．下列关于动物细胞培养的叙述，不正确的是（） A．动物细胞培养前要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散开来 B．通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养 C．细胞的癌变通常发生在原代培养向传代培养的过渡过程中 D．传代培养的细胞在传至10～50代左右时，部分细胞的核型可能发生变化 2．在动物体细胞克隆技术中，不一定涉及（） A．卵母细胞的培养 B．细胞核移植 C．早期胚胎培养 D．导入外源基因 3．下列关于动物细胞培养液的叙述，不正确的是（） A．为了防止培养过程中出现细菌污染，可以在培养液中添加抗生素 B．细胞培养液中必须有糖、氨基酸等化合物以及动物血清等天然成分 C．含95%空气中再混入5%的CO2主要作用是维持培养液的pH D．培养液应该定期更换，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害 4．下列关于动物细胞培养的过程的叙述，错误的是（） A．制作细胞悬液时可以使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 B．悬液中分散的细胞很快贴附在细胞壁上，细胞贴壁体现了细胞的适应性 C．细胞进行有丝分裂，数量增加到相互接触时可以使用胃蛋白酶处理后分瓶培养 D．10代以内的细胞保持细胞正常的二倍体核型 5．在动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图是血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果，从该图中不能获得的信息是（） A．正常细胞与癌细胞的增殖速率相同 B．有无血清对正常细胞培养的影响不同 C．培养基中补充血清有助于正常细胞的培养 D．培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大
6．甲羊的去核卵细胞与乙羊体细胞的细胞核“组装”成一个新的细胞，该细胞多次分裂后植入丙羊的子宫内发育，产下羊羔的毛色和性别分别与哪只羊保持一致（决定毛色的基因位于细胞核中）？（） A．甲、丙B．甲、甲C．乙、乙D．丙、甲 7．若在克隆牛的培育过程中，将牛M（基因型为Aa）的体细胞核移入牛N（基因型为aa）的去核卵母细胞中，然后在雌牛L（基因型为AA）体内发育成熟。产出的犊牛基因型为（） A．AA B．Aa C．aa D．Aaa 8．以下细胞工程中所用技术与原理不相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理植物细胞——酶的专一性 B．动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交——细胞膜的流动性 D．植物组织培养——植物细胞的全能性 9．动物细胞培养的特点是（） ①细胞贴壁②有丝分裂③分散生长④接触抑制⑤减数分裂 A．①②④B．②④⑤C．①③④D．③④⑤ 10．乙马的卵细胞核被甲马的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂发育成重组胚胎，再植入丙马的子宫内发育，结果产下一只小马。下列叙述正确的是（）A．直接在体外对甲马的体细胞进行诱导也能培养出胚胎来 B．小马的性状完全与甲马相同 C．此项技术可用于保护濒危物种 D．该过程可以很好地证明动物细胞的全能性 11．动物细胞培养过程的顺序是（） ①原代培养②传代培养③用胰蛋白酶处理组织，形成分散的细胞悬液 A．①②③B．①③②C．②①③D．③①② 12．某研究小组进行药物实验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。 请回答下列有关动物细胞培养的问题。 （1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。 （2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是______________。 细胞培养应在含5% CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是______________。 （3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物实验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更________。若用动物的肝
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
学习指导案 课题 动物细胞培养 授课时间 课型 新授 主备人 教材分析 动物细胞培养是其他动物细胞工程的基础，打好基础很重要。通过设计六道讨论题，在预习的基础上解决讨论题后，大部分学生能够掌握动物细胞培养的过程。 学情基础分析及预习导学 在植物组织培养的基础上，学习动物细胞培养，要通过对比，理解过程，结果、应用和条件 课程目标 知识与技能： 简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 情感态度和价值观 了解生物技术，关注实际生活 能力方面 通过讨论，了解动物细胞培养的过程。 学习重点 动物细胞培养的过程及条件。
学习难点 动物细胞培养的过程 教具准备 多媒体课件和学案 学习过程 学习内容 学习形式 教师指导 时间 （一）引入新课 利用植物细胞可以培育成植物体，那么，你利用动物细胞能不能大量繁殖动物体，以提高繁殖率呢？这节课我们来学习动物细胞工程。 （二）进行新课 [问题]动物细胞工程的常用技术手段有哪些？最基础的技术手段是什么？ 动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。最基础的技术手段是动物细胞培养。 1．动物细胞培养 1.1概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。[来源:学_科_网] [分析]（1）需分散成单个细胞；（2）需要在培养基上培养；（3）动物细胞培养的实质是细胞增殖——原理 1.2动物细胞培养的过程： [问题]什么是细胞贴壁？什么是接触抑制？ 悬液中分散的细胞很快就贴附在有丝分裂，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 [问题]如何打破接触抑制？需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分别继续培养，让细胞继续增殖。 [问题]细胞传代培养代数有什么特点？ 传代培养的细胞一般传至10代后就不易传下去了，一般来说，细胞在传至10～50代左右时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，这时部分细胞的细胞核型可能发生变化，当继续传代培
细胞工程学名词解释及问答题 一、名词解释 1、细胞工程（cytotechnology或cell engineering）：它是以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 或应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。 2、看护培养（nursing culture）：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂增殖的方法。 3、细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。 4、外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的植物组织、器官等材料。 5、人工种子：是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 6、花药培养（anther culture）：将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，放在无菌的条件下，使其进一步生长、发育成单倍体细胞或植株的技术。（指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株，使之二倍化的细胞工程技术。 7、条件培养基(conditioned medium)：培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液称为条件培养基。 8、植物脱毒：由人工用物理、化学和生物方法将植物体组织器官病原体消除，以使这些组织器官生成完整植株。 9、原代细胞系：指从机体中取出而直接培养的细胞，从一代到十代的细胞培养是原代培养，形成的整个系统叫原代细胞系。 10、体细胞杂交：指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 11、胚胎培养：是指胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 12、互补选择：是指利用两个亲本具有不同的遗传和生理特征，在特定培养条件下，具有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 13、悬浮培养(suspension culture):是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 14、植板率:植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。 15、玻璃化冻存：是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。 16、接触抑制(contact inhibition)：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。 17、非对称融合（aymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合。 18、对称融合（symmetric fusion）：两个完整的细胞原生质体融合。 19、胞质体：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 20、体细胞胚：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。 21、永久细胞系：大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，在体外永久存活下来发育成永久细胞系或称连续细胞系。
《动物细胞培养技术》复习思考题 动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。你认为精确配制各种溶液？ 答： 配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答：L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质； b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源； d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
§2-2“动物细胞培养和核移植技术”第一课教学设计 （青龙县木头凳高中秦维华066505） 【设计思路】 采用135互动课堂的教学模式，以问题为主线，通过一个个问题的解决，达到推动新课进行的目的。教学的思路问题——讨论——展示——质疑——答疑。教学中设计了自主探究、合作探究、课堂巩固、课堂检测、课后总结五个环节。自主探究部分，学生阅读课本P44-47，课前独立完成。合作探究部分，学生以小组为单位进行讨论完成。课堂巩固每个学生独立完成后，在小组内进行核对答案，讨论，会的教不会，然后展示，如果都不会，可向其它小组求助。课堂检测，以小组为单位，以抢答题的形式出现，并计分。总之，学生能说的让学生说，学生能做的让学生做，学生能思考的让学生思考，使学生始终能主动地参与学习，成为学习的主人。 【教材分析】 本节课为人教版新课程教材选修3第二章第二节的教学内容,本节内容设计2课时，本节课为第1课时。教学过程可以归纳成3个问题:(l) 什么是动物细胞培养? (2) 怎样进行动物细胞培养? (3)为什么要进行动物细胞培养?第3个问题是本节的重点。本节旨在通过这些问题让学生充分理解和认识生物工程的前沿技术,以此激发学生热爱科学、努力学习、积极探索的精神。 【学情分析】 高二年级多数学生已经掌握了一定的生物学基础知识,具备了独立思考和判断的能力,合作性学习能力较强,但是个体之间还是存在着较大的差异。因此本节课以学生的学习为主,以教师的组织和引导为辅。加强教材与生活的联系,引导和调动学生的情感体验,关注学生的心理变化,培养学生对事物有正确的情感态度。 【教学目标】 知识目标：1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用 2、简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程及应用前景 能力目标：运用细胞的基础知识，分析细胞工程的理论基础 情感目标：关注细胞工程研究的发展和应用前景。 【教学重点难点】
第十章细胞培养技术和培养箱 首页习题习题参考答案 习题名词解释选择题简答题 一、名词解释 1. 细胞培养 2. 细胞培养传代 3. 原代细胞培养 4. 无限细胞系 5. 细胞融合 6. 细胞治疗 7. 培养箱 8. 缓冲室 9．手套操作箱 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1.体外培养细胞的分类（贴附型或悬浮型）是根据（） A．细胞为上皮样或成纤维细胞样 B．能否贴附在支持物上生长 C．呈密度抑止特性 D．肿瘤细胞 E．细胞可多次传代 2. 下述细胞传代的概念中，正确的是（） A．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器的过程 B．从体内取出细胞接种到培养容器，细胞继续增殖的过程 C．培养细胞期间更新培养液的过程
D．当细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞接种到其他容器并及时更新培养液使细胞增殖继续的过程 E．细胞倍增的过程 3. 细胞生长维持液，需添加的血清量的百分比为（） A．1％～2％ B．2％～5％ C．5％～10％ D．10％～20％ E．20％～25％ 4．培养细胞传代时，通常是（） A．根据不同细胞采取不同的方法 B．常用二乙烯四乙酸二钠（EDTA） C．EDTA与胰蛋白酶按不同比例混合使用 D．悬浮生长的细胞直接添加胰蛋白酶” E．贴壁生长的细胞添加新鲜培养液 5. 二氧化碳培养箱结构的核心部分，主要是 A．湿度调节装置 B．湿润的含水托盘 C．温度调节器 D．CO2调节器、温度调节器和湿度调节装置 E．气体保护器装置 6. 二氧化碳培养箱调节CO2浓度范围为（） A．0％～20％ B．20％～40％ C．10％～20％ D．20％～30％ E．30％～40％ 7. 厌氧培养箱通过自动连续循环换气系统保持箱内的厌氧状态，其换气过程是（） A．①气体排空→②净化→③气体排空→④N2净化→⑤气压平衡 B．①气体排空→②N2净化→③气压平衡
2.2动物细胞工程 2.2.1动物细胞培养和核移植技术 [学习目标] [ 核心素养] 1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。1.科学思维：结合具体实例，用文字和图示表述体细胞核移植的内涵和过程。 2.社会责任：了解体细胞核移植技术已取得的进展和尚未解决的问题。 一、动物细胞培养 1．动物细胞工程常用的技术手段及技术基础 (1)动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、1动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等。 (2)技术基础：2动物细胞培养技术是其他工程技术的基础。 2．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成3单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 3．原理：4细胞增殖。 4．过程
5．培养条件 (1)无菌、无毒的环境：添加11 抗生素，定期更换培养液以清除 (2) 成分。 (3)适宜的温度和pH哺乳动物)，pH 7.4。 (4)气体环境：含95% 持培养液的pH。 6．应用(填在下列横线处) A．生产生物制品a．筛选抗癌药物 B．用于基因工程b．病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体C．检测有毒物质c．培养受体细胞 D．用于生理、病理、d．判断物质的毒性药理等研究 二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1．概念 (1) (2) (3) 2 3 4．体细胞核移植的过程
5．选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞30比较大，容易操作；卵(母)细胞31细胞质多，营养丰富，含有促进核全能性表达的物质。 6．应用 (1)加速家畜32遗传改良进程，促进优良畜群繁育； (2)保护33濒危物种； (3)生产医用蛋白； (4)作为异种移植的34供体； (5)用于组织器官的35移植。 7．体细胞核移植技术存在的问题 (1)尽管体细胞核移植技术已经在许多种动物中获得成功，但其成功率仍然非常36低(填“低”或“高”)。 (2)绝大多数克隆动物还存在健康问题。 (3)对克隆动物食品的安全性问题存在争议。 1．判断下列叙述的正误。 (1)克隆植物和克隆动物都只具备一个亲本的遗传特性。( × ) (2)动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。( √ ) (3)动物细胞培养要定期更换培养液，其目的是便于清除代谢产物，防止代谢产物积累对细胞自身造成伤害。( √ )
细胞培养特性：分为贴壁性（上皮细胞型、成纤维细胞型）和悬浮型（白细胞、癌肿细胞）体外培养细胞生长特点：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。 原代培养（原代细胞）：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前称为原代培养或原代细胞。 传代培养：细胞持续生长繁殖一段时间，到达一定浓度之后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿，并补充更新培养液。 细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 有限细胞系：一般正常细胞系的寿命只能维持一段时间期限。 无限细胞系：传代中极少的后代发生转化，通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增值能力，这种永生化细胞即为无限细胞系。 细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。 克隆：在动物细胞培养中从细胞群体中分离出一个细胞开始，其在体外无性繁殖成新的基因型相同的细胞群体，这种纯化的细胞群称为细胞株，他们中的每个细胞的遗传特征及生物特性极为相似，常用的细胞克隆技术有有限稀释法和平皿克隆分离法。 杂交瘤技术：主要由免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，核心是细胞融合。 杂交瘤：由产生抗体的肿瘤细胞与抗原-刺激的正常浆细胞融合而形成的细胞，这种细胞产生的抗体称为单克隆抗体。基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。 细胞杂交：通过人工培养和诱导将不同种生物或同种生物不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。 杂交技术过程:①免疫动物及细胞培养:用特定抗原免疫纯系动物获得预定抗体B淋巴细胞,利用细胞融合技术可使短寿命抗体形成细胞与能永久生长的同种骨髓瘤细胞系融合,获得既有分泌抗体能力,又有无限繁殖能力的细胞②筛选杂交瘤细胞(在具有筛选作用的培养基上培养)③克隆化培养④单克隆抗体的大量制备与鉴定(动物体内诱生法和体外培养法)⑤进一步分离和纯化单克隆抗体,鉴定单克隆抗体类型及亚类,测定抗体亲和力以及相应抗原的分子量等. 显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ值，提高分辨率可采取以下措施: （1）降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsin(u)/2）。（3）增大孔径角u值以提高NA值。（4）增加明暗反差。 体外培养过程：原代培养或初代培养、传代期、衰老期。 每代细胞生长过程：滞留期（潜伏期）、指数生长期、平台期 培养细胞生长条件：①营养需要：基本营养物质（氨基酸、维生素、碳水化合物及无机离子）和促生长因子等物质。②生存环境：温度（35—37）、气相（CO2和O2）、pH值（）及渗透压③无污染及无毒：防止交叉污染、有害物质污染。 细胞冻存及复苏： 基本原则：慢冻快融，以最大限度的保存细胞活力。 原理：细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，